实验三细菌的分布与消毒灭菌

实验三细菌的分布与消毒灭菌【目的】①了解细菌广泛分布于自然界及正常人体，树立“有菌观念”，从而认识无菌操作对于微生物学及医学实践的重要性。

②了解正常人体中寄居着种类繁多的细菌，正常情况下不引起人类疾病，称为正常菌群。

③熟悉外界因素对细菌的影响，学习常用的消毒灭菌方法。

④了解不同细菌对外界因素具有不同的抵抗力。

一、细菌的分布检查（一）空气中的细菌检查【材料】普通琼脂平板培养基。

【方法】①取普通琼脂平板一只开启皿盖，培养基面向上放于实验桌上，暴露5～30min后盖好。

②置37℃培养18～24小时后观察结果。

【结果】（填表10-1）平板培养基表面或多或少有菌落生长。

（二）地面水中的细菌检查【材料】地面水(河水、井水或池水)、高层琼脂培养基、1ml无菌吸管、灭菌培养皿。

【方法】①以无菌吸管吸取1ml地面水，加入灭菌平皿中。

②将已溶化且冷至45℃左右的高层琼脂倾注人上述平皿中，加盖后轻轻摇动，使水与琼脂充分混匀，静凝。

③37℃ 24小时后取出观察，计数菌落。

【结果】（填表10-1）（三）衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查【材料】普通琼脂平板培养基。

【方法】取普通平板一个，用蜡笔在平板背面玻璃上划成四等分，并贴上标签(图10-1)。

然后以无菌操作法，用衣袖角、票证、头发及手指或指甲内污物，在平板培养基表面相应部位轻轻涂抹，置37℃培养24【结果】填表培养基表面涂抹处有菌落生长。

衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查（四）正常人体咽喉部的细菌检查【材料】血液琼脂平板培养基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯。

【方法】取灭菌棉拭一支，在被检查者咽喉部轻轻涂擦后，再涂于血液琼脂培养基—侧，然后改用灭菌接种环作分离划线接种。

盖上皿盖，37℃孵育24小时（或者采用咳喋法）。

【结果】（填表10-1）琼脂平板表面有菌落生长。

其中占优势的是一种细小菌落，其周围有草绿色的不完全溶血环。

此为咽喉部的正常菌群—甲型链球菌。

（五）实验结果观察(填表)（一）煮沸与高压灭菌法【原理】高温对细菌有明显的致死作用，主要机制是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌细胞膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。

湿热灭菌法所需温度比干热法为低，时间较短。

尤其是高压蒸气灭菌，因增加压力而提高沸点，灭菌效果最佳。

有芽胞的细菌由于对热的抵抗力比无芽胞细菌强，所以只有采用高压蒸气灭菌法才能将芽胞彻底杀灭。

【材料】琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培养物。

【方法】①取琼脂平板两块，用记号笔分别在二平板底部玻面上，注明大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌，并分别将二块平板底玻璃面划分三等份，于每块平板的三等份上分别注明对照、加热100℃ 10min及加热121℃ 20min。

②取肉汤管二支，分别注明加热100℃ l0min及加热121℃ 20min，用毛细吸管吸取大肠埃希菌肉汤培养物，于上述二支肉汤管中各加入菌液一滴。

混匀，再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对照处，然后分别将肉汤管加热100℃ l0min及加热121℃ 20min(高压蒸气15磅、20min)，再各取一接种环分别接种于平板的相应部位。

枯草芽胞杆菌以同法试验。

③将二块琼脂平板接种物置37℃培养24小时，比较培养基上二种细菌的生长情况。

【结果观察】（填表10-2）结果分析（二）紫外线杀菌法【原理】波长265～266nm的紫外线因与DNA吸收光谱-致而有明显的杀菌作用。

其机制是使细菌DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌死亡。

紫外线杀菌力虽强，但穿透力弱，故只能用于实验室、病房或手术室内空气及物体表面的消毒灭菌。

另外，杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛等有损伤作用，应注意防护。

【材料】大肠埃希菌培养物、琼脂平板、接种环、酒精灯、紫外线灯。

【方法】①以灭菌接种环挑取大肠埃希菌培养物，于琼脂平板上作来回密集划线接种。

②半启皿盖(将皿盖遮住涂面的1／2)，置于紫外线灯下lm以内接受照射30分钟。

③盖上皿盖，于37℃培养24小时后观察结果。

【结果观察】（填空）平板上用黑纸遮盖部分菌生长，未遮盖部分菌生长。

这说明紫外线具有作用，但力弱。

（三）化学消毒法1、皮肤消毒试验【原理】乙醇可使菌体蛋白脱水凝固或与菌体蛋白、酶蛋白等结合而使之变性失活。

70％～75 ％乙醇在15～30秒即将细菌杀死。

但95％的乙醇消毒效果反不如70％～75％为好，因高浓度乙醇使菌体蛋白表面迅速凝固，影响乙醇继续进入菌体内发挥作用。

2.5％的碘酒可使菌体酶蛋白中的硫氢基(-SH)改变，使酶失去活性，导致机能障碍而死亡。

【材料】普通琼脂平板一个、2.5％碘酒、75％乙醇。

【方法】取普通琼脂平板一个，用蜡笔在平板背面玻璃上划成五等分，并贴上标签；两人用手在培养基上各涂一格，然后用2.5％碘酒、75％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作对照，盖好平板，置37℃温箱中培养24小时观察结果。

【结果】（填表）2、化学消毒剂对细菌的影响【原理】有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。

由于化学消毒剂对人体细胞往往具有毒性作用，故只能外用。

不同细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性。

【材料】1％龙胆紫、2％碘酒、2％红汞、1:1000新洁尔灭、无菌滤纸片、葡萄球菌培养液、大肠埃希菌培养液、琼脂平板、无齿小镊子。

【方法】取琼脂平板两块，分别在其底部注明葡萄球菌及大肠埃希菌。

同时将每块平皿底部玻璃面划分4等分，并分别标明龙胆紫、碘酒、红汞、新洁尔灭。

(操作方法与药敏试验相似)三、抗生素的抗菌试验(药敏试验，纸片法)【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多数为放线菌和真菌、极少数为细菌)在生长繁殖过程中产生的一种合成代谢产物。

此种有机化合物具有抗生物作用，能抑制或杀灭某些生物细胞，主要是一些微生物和肿瘤细胞。

一种抗生素只对一定种类的生物细胞具有选择性拮抗作用，这种作用范围称为抗菌谱。

抗生素的抗菌试验(药敏试验)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。

【材料】①金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、琼脂平板培养基。

②抗生素纸片(青、链、氯、庆大霉素、磺胺等)、尖头镊子、酒精灯、接种环。

【方法】①取琼脂平板培养基二块，于其底部玻璃上用标签纸注明本人所接种的菌株名称（或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在靠近边缘处注明青、链、氯、庆大等字样）。

②以灭菌接种环挑取菌液，在培养基表面作密集划线接种。

③将镊子火焰灭菌，待冷后再取各药物纸片，分别牢贴于种有细菌的平板培养基表面相应位置，每次贴片后镊子均应经火焰烧灼灭菌。

每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，并分别作好标记。

在直径90mm的平板上均匀摆放药敏纸片的样板④37℃孵育18～24h后，分别测量各纸片抑菌环直径(包括纸片在内)(mm)，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

判定其敏感度。

【结果观察记录】填表。

敏感：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌；中度敏感：指提高测定药物的剂量或在该药物浓集部位，细菌生长可被抑制；耐药：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度不能抑制或杀灭待测菌。

四、口腔内微生物检查（口腔专业）【方法】①滴一滴墨汁于洁净玻片的一端；②用牙签取齿间牙垢少许在墨汁中涂匀；③用玻片推成推片，干燥后油镜观察、绘图。

【结果】（绘图） 可见黑色背景中有着色发亮的细菌、螺旋体等微生物。

五、常用消毒灭菌器及无菌室介绍(一)高压蒸气灭菌器【构造】高压蒸气灭菌器是双层的金属圆筒，盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不外溢。

因而当蒸气压力升高时，其温度亦相应地增高，高压蒸气灭菌器上装有排气门、安全活塞，以调节器内压力。

还有温度表和压力表，以显示内部的温度和压力。

二者的关系见表10-5。

器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物品。

【用法】加适量水于器内，放入欲灭菌物品，将盖关上，转紧螺旋使之密闭。

灭菌器底部用电炉加热，同时打开排气门，使器内冷气完全排出，否则压力表上所示压力并非全部为蒸气压力，再维持该压力20分钟后，停止加压。

蒸气压力与温度的关系千帕斯卡千克/平方厘米磅/平方吋温度(kPa) (kg/cm2) (lb/in.2) (℃)34.47 0.35 5 108.855.20 0.60 8 113.068.94 0.70 10 115.6103.50 1.05 15 121.3137.80 1.50 20 126.2 【注意事项】1.必须待压力逐渐自行下降至零时，才可开盖取物。

切不可突然打开排气门，放气减压，以免瓶内液体冲出外溢。

2.用于耐高温和耐湿物品的灭菌，如普通培养基、手术器械、手术衣及敷料等。

(二)干热灭菌器(干烤箱)【构造】箱壁为双层，两层间衬以石棉板隔热，底部装有电热线圈，箱壁有温度调节器和时间调节器，箱顶有温度计调节孔，灭菌开始时关闭调节孔。

开启电源后，箱内温度逐渐升高，可保持恒温。

【用法】将待灭菌物品包装妥当，放人箱内金属架上，关好玻璃门和金属门，开启电源，调节温度(160～170℃)和时间(2小时)。

【注意事项】①温度不可超过180℃，以免烧焦棉塞及包装纸。

②灭菌后须待温度下降至接近室温时方可打开箱门，否则因冷空气骤进会引起玻璃器皿破裂。

③干烤灭菌主要应用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液体石蜡等物品。

(三)流通蒸气灭菌器其构造原理同一般的蒸锅，底层盛水，器内有一至二层的带孔隔板，以放置待灭菌的物品。

加热水后沸腾产生蒸气。

在普通大气压下，蒸气温度只能达到100℃，维持此温度30分钟左右，只能杀死细菌繁殖体，而芽胞不一定死亡。

所以使用流通蒸气灭菌器时，必须行间歇灭菌法，即每日一次，每次100℃蒸30分钟，取出置37℃孵箱培养过夜，使未死亡的芽胞发育成繁殖体。

如此连续灭菌三次可达灭菌目的。

本法用于一些不耐高温的培养基之灭菌。

(四)滤菌器滤菌器是用以除去细菌的器具，它含有微细小孔，只允许液体及气体通过，而大于孔径的物体不能通过。

滤菌器可以除去细菌，但不能除去病毒、支原体、衣原体及细菌L型等微生物。

滤过除菌主要用于一些不耐高温的血清、抗生素、药液、酶制剂等。

常用的滤器有蔡氏滤器和玻璃滤器。

(五)煮沸消毒器煮沸100℃ 5min，能杀死一切细菌的繁殖体，煮沸消毒器可用于一般器械(剪刀、注射器)等的消毒。

(六)紫外线灯常用于手术室、病房、无菌室、婴儿室等的空气消毒，其消毒效果与照射的时间、距离和强度有关，一般要求灯管离地面约3米高处，照射1～2小时。

(七)无菌室及无菌工作台的工作原理及使用为避免环境和空气中的细菌污染培养物，一般较为细致的细胞培养、细菌培养的操作均应在紫外线消毒后的无菌室或超净工作台内进行。