酶工程酶学概论

A对照管— A实验管
（
×
1
×
1
×
1 0.1
× 10
发酵液体积 反应时间 0.1A= 1单位
0.2
15
稀释倍数
）
比色法：
酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成稳定的有色溶液， 生成颜色的深浅与产物浓度在一定范围内有线性关系。
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生 成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收。
与酶分子上的某些必需基团结合，使这些基团的结构 和性质发生改变，从而引起酶活力的下降或丧失。
与变性剂的区别： 1. 没有引起酶的变性 2. 有一定的选择性
抑制剂的分类：
不可逆抑制剂
不可逆抑制剂通常以比较牢固的共价键与酶蛋 白中的基团结合，而使酶失去活性。 不可逆抑制剂与酶结合后，不能通过透析和超 过滤等物理方法除去抑制剂。 如：有机磷， 有机汞、有机砷、氰化物，重金属等。
米氏常数的意义:
3. Km值可帮助判断某一代谢的方向及生理 功能。催化可逆反应的酶，对正逆两个方向 反应的Km常常是不同的。
测定这些Km的大小及细胞内正逆两向的底物浓度，
可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率；这对了解酶在细 胞内的主要催化方向及生理功能具有重要的意义。
4. 判断酶的最适底物。 有的酶可作用多种 底物，因此对每一个底物都有一个Km值，Km最 小的那个底物为该酶的最适底物或天然底物。
（1）竞争性抑制作用（competitive inhibition) （2）非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition） （3）反竞争性抑制作用（Uncompetitive inhibition） （4）线性混合型抑制作用
竞争性抑制剂
非竞争性抑制的特点： ⑴ 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底 物的分子结构类似； ⑵ 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部 位相结合； ⑶ 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底 物浓度的改变对抑制程度无影响； ⑷ 动力学参数：Km值不变，Vm值降低。
（秒或者分钟）每个活性中心或每个酶分子催化底物转化
的分子数。
酶的催化周期：进行一次催化所需时间，转化数的倒数。
加入试剂
实验管 0.1mL 0.2mL
对照管 0.1mL 0.2mL
空白（1） -0.2mL --
1％的淀粉溶 液 缓冲液
相应发酵液
摇匀后40℃恒温水浴保温5min 0.2mL --
相应培养基 蒸馏水
远离最适 pH值时甚至导致酶的变性失活。测定酶的活性时， 应选用适宜的缓冲液，以保持酶活性的相对恒定。
■ 各种常用缓冲液及其使用范围：
缓冲液
Formate Citrate Acetate Phosphate HEPES Tris Borate Carbonate Universal
pH
3.0 - 4.5 3.0 - 6.2 3.7 - 5.5 5.8 - 8.0 6.5 - 8.5 7.1 - 8.9 9.1 - 9.0 9.7 - 10.7 2 - 12
第二节 酶反应动力学
1. 酶促反应速率
酶促反应速率：单位时间、
单位体积中底物的减少量或
产物的增加量。 单位：浓度/单位时间
2. 底物浓度对酶反应的影响
底物饱和曲线（Saturation curve）
米氏方程
Michaelis-Menten Equation
快速平衡学说三个假设条件： 1）在初速率范围内，产物生产量极少，E+P→ES可以忽略不计。
乙酸溶液
---
0.2mL --
-0.3mL
0.5mL
摇匀后40℃保温15min 0.5mL 0.5mL
8000转离心5min 取0.5mL上清,加入0.5mL稀碘液试管中
加4mL蒸馏水稀释至5mL
计算淀粉酶酶活：
显色后，用空白管于660nm波长处校零，然后测 定对照管和实验管的吸光度（A660）。计算各样 品吸光度大小酶活力。即以1mL粗酶液在40℃， pH7.0条件下1min所引起的吸光度值变化0.1为1 个酶活力单位。
5. 测定不同抑制剂对某个酶的Km及Vmax的影 响，可区别抑制剂是竞争性的还是非竞争性 的抑制剂。
V
温度对酶促反应的影响
化学反应的速度随温度增高而加快。但酶是蛋白质，可随温 度的升高而变性。在此曲线顶点所代表的温度，反应速度最
大，称为酶的最适温度(optimum temperature)。
米氏方程的变化：
1
米氏常数的意义:
1. Km是酶的特征性常数之一，只与酶的性 质有关，与酶的浓度无关；不同的酶其Km不 同。但指在一定的温度、pH、离子强度、一 定的底物存在下而言的。 2. Km表示酶与底物之间的亲和程度，Km 越大，表示亲和程度越小，酶的催化活性越 低； Km越小亲和程度大，酶的活性越高。
这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能
进行酶活力的相对比较。
3. 酶的比活力
二.酶活力及其测定
指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数
比活力 ＝
酶活力单位数（U） 酶蛋白质量（mg）
比活力是酶制剂纯度的常用指标 —— 比活力越大，表示酶越纯
4. 酶的纯度 转换数和催化周期
二.酶活力及其测定
表示酶的催化中心的活性，指在一定条件下，单位时间
Vmax/Km比值不变。
底物抑制
有些酶反应在低浓度时符合米氏方程，但当 底物浓度升高时，反应速率反而下降，这种 现象称底物抑制。
底物浓度很高时，两个或多个底物分子分别 占据了部分活性位点，使之无法按正常方式 接受酶的催化作用。
2. 小分子的有机化合物：抗坏血酸、半 胱氨酸、谷胱甘肽。 3. 生物大分子激活剂：蛋白激酶 特点：（1）有一定的选择性；（2）拮 抗和替代；（3）受浓度影响。
非专一性不可逆抑制剂：
专一性不可逆抑制剂：
Ks：抑制剂与酶活性部位必须基团形成络合物的解离常数 与非活性部位同类基团形成络合物的解离常数之比。
可逆的抑制作用
通过非共价键结合，可通过透析，超滤除去； 结合部位可以是酶的活性中心，也可以是非活性中心部位。 根据抑制剂与酶分子的结合关系，将可逆作用分为四种：
这种单位是由国际酶学委员会规定的。 在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下， 酶每分钟催化 1 mmol 底物转化为产物所需要的酶 量，定义为1个国际单位 (IU)。
2. 酶活力与单位
二.酶活力及其测定
B Kat（卡特）
是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位
在最适条件下，每秒钟能使 1mol/L 底物转化
第三节 酶活力及其测定
酶活力（enzyme activity）又称酶活性，是指酶
催化某一化学反应的能力。
酶活力：就是指在一定条件所催化的某一化学
反应的速度（初速度），即酶催化的反应速度 越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。
2. 酶活力与单位
二.酶活力及其测定
常用的酶活力单位有三种：
A 国际单位（IU）
使用上注意
容易挥发，可用冷凍乾燥除去。 小心会与二价金属离子結合。 容易挥发，可用冷凍乾燥除去。
小心会与钙离子結合沉淀，低溫下易結晶。 毒性較小，多用在細胞培養。 pH 受溫度影响很大，要用特殊电极。 小心会与金属离子結合沉淀。 几种不同 pH 范围的缓冲液混合而成。
抑制剂对酶催反应的影响
抑制剂（Inhibitor）是指能降低酶的活性，使 酶促反应速率减慢的物质。
2）底物的浓度显著的超过酶浓度,ES形成不会明显的降低底物浓度。
3）ES分解为E和S的速率远远大于ES分解为E和P的速率；在初速度范围内， E+S=ES的正逆反应迅速达到平衡，ES分解为产物的速度不足以破坏这一平衡。
稳态平衡学说
1925年，Briggs-Haldane 对米氏方程做了 修正
Km 称为米氏常数，是当反应速率为最大反应速率一半 时的底物浓度，单位为浓度单位。 该方程表明当已知Km和Vmax时，酶反应速率与底物 浓度之间的定量关系。
pH对酶促反应的影响 1. 酶的最适pH 2. 影响酶分子的构象
3. 影响酶和底物的解离
4. 它和酶的最稳定pH不一定相同，和体内环境的pH也未必 相同。 最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种 类和浓度以及酶的纯度等因素的影响。
6. 溶液的pH值高于和低于最适pH时都会使酶的活性降低，
为产物所需要酶的量定义为 1个Kat 。
1 Kat = 60×106 IU
1 IU= 1µmol /L·min=1/60 µmol /L ·s=1/60 µKat= 16.6 nKat
2. 酶活力与单位
二.酶活力及其测定
C 自定义酶活力单位U
酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定
义为酶的活力单位。 有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间 内消光值的变化 (DA/t) 表示酶活力单位。