苹果酸-乳酸发酵

5.4.2 影响MLB的因素 3/3
抑菌剂：SO2、山梨酸、多酚、氯霉素、溶菌酶、脂肪酸等 其它微生物：酿酒酵母的某些菌株对生长有拮抗，污染了膜 蹼毕赤氏酵母、路德类酵母的葡萄酿造的酒对MLB生长有抑 制，能分泌核苷酸等营养物质的某些酵母促进MLB生长，污 染过灰葡萄孢和醋酸菌的葡萄酿造的酒能促进MLB生长。 菌种间相互影响，噬菌体能侵染MLB，使MLF延缓停止。 发酵罐的大小、高度、使用木桶或钢罐也产生影响。 P75图5-3用实验证明了SO2、温度(19、14℃)、AF对MLB群 体的影响。
5.3 MLF的机理
发酵一般是厌氧获得能量的反应，而MLF的能量来自少量 糖的分解0.1g-5g苹果酸，MLF的目的或许是改善自身的生 存环境，目前还不清楚。 由苹果酸转化为乳酸，有3条可能的途径：苹果-酸-草酰乙 酸-丙酮酸-乳酸；苹果酸-丙酮酸-乳酸；苹果酸-乳酸。如 果有丙酮酸环节，MLB又具有两种脱氢酶，葡萄酒中就应 该有L和D型两种乳酸，而实际上MLF只是将酒中L苹果酸转 化为L乳酸，所以只能是第三条途径，将催化该反应的酶命 名为苹果酸－乳酸酶(MLE) 。
5.4.2 影响MLB的因素2/3
温度：最适生长温度因菌种而异，<10℃抑制生长， <15℃生长缓慢，15-30℃随温度升高，MLF加快，结束也 早，温度高会带来一些缺陷，18-20℃最佳 。致死温度 60℃ (1-2min)。 CO2和02： CO2对MLF有促进作用，AF后晚除渣有利于保存 CO2 。MLB为兼性厌氧菌，生存需要低浓度的氧，太多的 氧则抑制。 品种：红葡萄中含有比白葡萄多的促进MLB生长的物质， 红葡萄酒比白葡萄酒易发生MLF。品种间也不同。 工艺：影响MLB数量、活性、营养物质的处理都影响MLF。 果皮上有营养物质(浸渍强度)，酵母自溶，冷、热处理，过 滤、离心等。
5.5 如何进行MLF 1/3
酒样、菌种、接种(菌种活化、量、时间)、监控管理、判断 终点、中止。 酒样：AF前SO2≤70mg/L，若≤50mg/L更佳，AF后不使用 SO2，酒度≤12％，S≤4g/L， pH≥3.2，温度18-20℃ ，密 闭满罐，必要时带酒脚，加酵母菌皮(吸附脂肪酸)。 菌种：对环境的适应性(pH、温度、酒度、SO2)，抗噬菌体， 不同菌系、不同菌类混合培养，酒质(色香味)。 接种：以接种纯种MLB为好，也有自然促发MLF的(组胺高)。 有少数菌种直接用于酒中，多数需预先水化复活，介质有 水、汁-水、酒-水-汁，甚至可以扩培。
5 苹果酸－乳酸发酵 (MLF)
5.1 MLF的简史和定义 5.2 MLF的意义 5.3 MLF的机理 5.4 苹果酸－乳酸细菌的种类和特性 5.5 如何进行MLF 5.6 MLF的新技术 思考题
5.1 MLF的简史和定义
定义：就是在乳酸细菌的作用下将苹果酸分解为乳酸和CO2 的过程。使酸涩、粗糙 柔软肥硕，提高酒的质量。 18世纪70年代，巴斯德首先发现。 1914年，瑞士Muller－Thurgau等定名为苹果酸－乳酸发 酵。 现代葡萄酒学的研究得出现代葡萄酒酿造的基本原理—— 要获得优质的干红葡萄酒，首先应该使糖和苹果酸分别只 被酵母菌和MLB分解；其次应尽快完成这一分解过程；第 三，当葡萄酒中不再含有糖和苹果酸(而且仅仅在这个时候)， 葡萄酒才算真正生成，应尽快除去微生物。
5.5 如何进行MLF 2/3
接种量：接种后MLB群体数量达到106/ml。接种量与MLF 速度(可控性)有很大关系，与挥发酸有关，太小的接种量 挥发酸高。
5.5 如何进行MLF 3/3
接种时间：最好在AF后；若同时进行AF和MLF，即在AF前 接种MLB，需要解决微生物间的拮抗和对底物的专一性(单 一发酵性)，而且某一发酵出现问题时，所采取的措施可能 影响到另一发酵，需要强的抗SO2能力。据报道有能用于葡 萄汁或正在AF的葡萄醪的乳酸菌，效果好。 监控管理：纸层析、HPLC、酶法测D乳酸、观察气体的溢出、 变浑浊及感官变化、监测挥发酸、很少数用镜检方法。 终点判断：纸层析苹果酸消失，有时不能灵敏地指示MLF是 否完成，因琥珀酸和乳酸，柠檬酸和苹果酸的斑点很近，有 时难以区分；苹果酸<200mg/L；D乳酸>200mg/L ，认为 MLF结束。 中止：立即分离转罐并使用20-50mg/L SO2处理。
葡 萄 酒 工 艺 学
5.苹果酸-乳酸发酵
5 苹果酸－乳酸发酵 (MLF)
本章主要讲述苹果酸－乳酸发酵的机理、作 用、控制技术和工艺条件。 要求学生了解苹果酸－乳酸发酵的机理、作 用和研究进展，掌握现代葡萄酒酿造的基 本原理，掌握苹果酸－乳酸发酵对干红葡 萄酒的必要性及其控制技术和工艺条件。 教学重点和难点：苹果酸－乳酸发酵的管理 和控制。
苹果酸－乳酸酶（ MLE ）的性质
为诱导酶，即只有当基质中含有苹果酸时，乳酸菌才能合成 此酶；其活性需要NAD+为辅酶，故其具有与苹果酸脱氢酶 和苹果酸酶相似的性质； 它只能将L-苹果酸转化为L-乳酸； 其分子量很大，为230000左右。 最佳活动pH值为5.75，需要Mn2+的激活。 L-乳酸和其它有机酸都对MLE有抑制作用，更有研究表明， 有机酸对细菌的抑制作用比对MLE更为强烈。 作用机理的假说：MLE是多个蛋白酶构成的复合体，其中一 部分像苹果酸酶一样催化L-苹果酸转化为丙酮酸，另一部分 则像L-乳酸脱氢酶一样将丙酮酸转化为L-乳酸，但是，丙酮 酸和NAD+并不被复合体释放。
5.4苹果酸－乳酸细菌的种类和特性
5.4.1 MLB的种类 5.4.2 影响MLB的因素 5.4.3 MLB引起MLF的乳酸细菌分属于明串珠菌属、乳杆菌属、片球 菌属和链球菌属。葡萄酒中的MLB多为异型乳酸发酵细菌。 明串珠菌属的酒明串珠菌能耐较低的pH，较高的SO2和酒 精，是MLF的主要启动者和完成者。后经深入研究发现， 该种与同属的其它种在表型和遗传型上有明显差异，1995 年Dicks将其重新命名为酒球菌属，酒类酒球菌。 按照乳酸菌对糖代谢途径和产物种类的差异，分为同型和 异型乳酸发酵细菌。异型乳酸发酵指葡萄糖经发酵后产生 乳酸、乙醇(或乙酸)和CO2等多种产物的发酵；同型乳酸发 酵指产物中只有乳酸和CO2的发酵。
5.4.2 影响MLB的因素1/3
酒精：2-4%轻微促进，12％对一般乳酸菌的前期增长有强 烈抑制作用，对酒精的耐受力：酒类酒球菌12％，片球菌 14％，乳杆菌15％，温度高、pH低时耐力下降。 SO2：对MLB有强烈抑制。10-25mg/L对MLB群体生长影响 不大，大于50mg/L则明显推迟或不能进行MLF，低pH同 SO2有协同作用。当Tso2>100mg/L或结合SO2>50mg/L或 Fso2>10mg/L就可抑制MLB繁殖，使之不能达到MLF需要的 菌数，当MLF结束用10-25mg/LSO2阻碍MLB的活动。 pH：pH≤3.0几乎所有MLB受抑制， pH3-5期间，随pH升高， MLF速度加快。一般乳酸菌最适pH为4.8，低于3.5MLF难发 生，酒类酒球菌能耐低pH。
5.6 MLF的新技术
60年代，固定MLB可使苹果酸转化达51.2-53.9%；也进行了 固定MLE的工作，但操作要求较高，而前者效果不错，使得 固定MLE的研究减少。85年转MLE基因酵母，只是表达差， 一直<20%；现在认为表达差的原因是缺少通透酶，裂殖酵 母中有苹果酸通透酶，希望将MLE和通透酶基因都转到酵母 中，可能解决表达差的问题。 学院已经研究了乳酸菌的固定化；从各个葡萄酒产区分离、 纯化、筛选乳酸菌，研究我国的乳酸菌资源，其中有活性好、 发酵酒质好的菌株正研制其干粉。 了解生物技术在MLF中的应用，提供一种思路。
5． 细菌可能引起的葡萄酒病害 在含糖量很低的干红和一些干白葡萄酒中，苹果酸是最 易被乳酸菌降解的物质，尤其是在pH较高（3.5-3.8）、温 度较高（＞16℃）、SO2浓度过低或苹果酸-乳酸发酵完成后 不立即采取终止措施，几乎所有的乳酸菌都可变为病原菌， 从而引起葡萄酒病害。根据底物来源可将乳酸菌病害分为： 酒石酸发酵病（或泛浑病）；甘油发酵（可能生成丙烯醛） 病（或苦败病）；葡萄酒中糖的乳酸发酵（或乳酸性酸败）。
5.2 MLF对葡萄酒质量的影响
苹果酸-乳酸发酵对酒质的影响受乳酸菌发酵特性、生态 条件、葡萄品种、葡萄酒类型以及工艺条件等多种因素的制 约。如果苹果酸-乳酸发酵进行的纯正，对提高酒质有重要 意义，但乳酸菌也可能引起葡萄酒病害，使之败坏。 1． 降酸作用 在较寒冷地区，葡萄酒的总酸尤其是苹果酸的含量可能 很高，苹果酸-乳酸发酵就成为理想的降酸方法，苹果酸-乳 酸发酵是乳酸菌以L-苹果酸为底物，在苹果酸-乳酸酶催化 下转变成L-乳酸和CO2的过程。二元酸向一元酸的转化使葡 萄酒总酸下降，酸涩感降低。酸降幅度取决于葡萄酒中苹果 酸的含量及其与酒石酸的比例。通常，苹果酸-乳酸发酵可 使总酸下降1-3g/L。
5.4.3 乳酸菌的生长周期
在葡萄酒酿造过程中，MLB的生长周期分为： 潜伏阶段：AF过程，选择保留了最适应葡萄酒环境的MLB 群体。 繁殖阶段：AF结束后，MLB大量繁殖，群体数量达到最大 值。分解苹果酸，几乎不生成醋酸。 平衡阶段：群体数量几乎处于平衡稳定状态，条件适宜可 持续很长时间。分解葡萄酒几乎其它所有的成分，造成挥 发酸的升高，引起葡萄酒各种病害。 实验证明了：苹果酸在繁殖阶段被分解；不管基质中是否 有苹果酸，繁殖阶段生成的醋酸很少；醋酸主要在平衡阶 段生成，与基质的含糖量成正比。 因此，一旦苹果酸消失，应立即杀死或去掉MLB。
3． 风味修饰
苹果酸-乳酸发酵另一个重要作用就是对葡萄酒风味的影响。例 如乳酸菌能分解酒中的柠檬酸生成乙酸、双乙酰及其衍生物（乙 偶姻、2,3-丁二醇）等风味物质。乳酸菌的代谢活动改变了葡萄 酒中醛类、酯类、氨基酸、其它有机酸和维生素等微量成分的浓 度及呈香物质的含量。这些物质的含量如果在阈值内，对酒的风 味有修饰作用，并有利于葡萄酒风味复杂性的形成；但超过了阈 值，就可能使葡萄酒产生泡菜味、奶油味、奶酪味、干果味等异 味。其中，双乙酰对葡萄酒的风味影响很大，当其含量小于4mg/L 时对风味有修饰作用，而高浓度的双乙酰则表现出明显的奶油味。 苹果酸-乳酸发酵后有些脂肪酸和酯的含量也发生变化，其中乙酸 乙酯和丁二酸二乙酯的含量增加。