第25次课 体内药物分析_PPT幻灯片
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最新体内药物分析 课件ppt课件
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
15.01.2021
体内药物分析
14
(一)检测条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
15.01.2021
体内药物分析
10
第四章 分析方法的建立与验证
第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
15.01.2021
体内药物分析
11
一、分析方法的选择
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
体内药物分析方法的设计
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测
用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
15.01.2021
体内药物分析
9
四、实验室条件
第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
➢ 分析方法建立之前
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法
——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
15.01.2021
体内药物分析
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
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体内药物分析
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(一)检测条件的筛选
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
15.01.2021
体内药物分析
10
第四章 分析方法的建立与验证
第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
15.01.2021
体内药物分析
11
一、分析方法的选择
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
体内药物分析方法的设计
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测
用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
15.01.2021
体内药物分析
9
四、实验室条件
第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
➢ 分析方法建立之前
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法
——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
15.01.2021
体内药物分析
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二、分析方法的建立
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
第05章-体内药物分析-幻灯片
中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
第二节 体内样品分析的前处理
微量药物存在于大量生物介质中，若直 接进行测定，内源性物质可能干扰，药 物浓度太低将会达不到仪器灵敏度要求。 因此，生物样品中的药物必须经过分离、 纯化与浓集，必要时还需对待测组分进 行化学改性处理，从而为最后测定创造 良好的条件。
pH13 pH7 pH2
返回 液-液萃取(续)
其他方法
① 离子对提取法（ion-pair extraction） ②提取烷基化法（extractive alkylation）
——适用于离子化倾向较大，难以 用溶剂直接提取的极性药物
离子对提取法
一种有机溶剂提取离子性药物的方法
原理：在体液(水溶液)中呈离解状态的 酸性或碱性有机药物(Q)，与呈相反电 荷离子(X)作用形成具有一定脂溶性的 离子对(QX)，再用有机溶剂提取
酸水解：
尿中缀合物用盐酸水解时，使代谢物的七元 环断裂、形成相应的二苯甲酮衍生物
酶水解：
用 - 葡 萄 糖 醛 酸 苷 酶 水 解 酶 ， 尿 液 1ml 、 pH4.8缓冲液50l、 -葡萄糖醛酸苷酶溶液 0.1ml、37℃水浴水解12h，水解后尿样调成 pH9乙醚萃取
返回 缀合物的水解 三唑仑GC测定
一般规则：碱性药物在碱性pH值、
液-液萃取法水相pH值:
生物样品宜在碱性或近中性提取，
生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性 下不易萃取
空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液 中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测 定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少
第三章 附图五
空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图
常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
第二节 体内样品分析的前处理
微量药物存在于大量生物介质中，若直 接进行测定，内源性物质可能干扰，药 物浓度太低将会达不到仪器灵敏度要求。 因此，生物样品中的药物必须经过分离、 纯化与浓集，必要时还需对待测组分进 行化学改性处理，从而为最后测定创造 良好的条件。
pH13 pH7 pH2
返回 液-液萃取(续)
其他方法
① 离子对提取法（ion-pair extraction） ②提取烷基化法（extractive alkylation）
——适用于离子化倾向较大，难以 用溶剂直接提取的极性药物
离子对提取法
一种有机溶剂提取离子性药物的方法
原理：在体液(水溶液)中呈离解状态的 酸性或碱性有机药物(Q)，与呈相反电 荷离子(X)作用形成具有一定脂溶性的 离子对(QX)，再用有机溶剂提取
酸水解：
尿中缀合物用盐酸水解时，使代谢物的七元 环断裂、形成相应的二苯甲酮衍生物
酶水解：
用 - 葡 萄 糖 醛 酸 苷 酶 水 解 酶 ， 尿 液 1ml 、 pH4.8缓冲液50l、 -葡萄糖醛酸苷酶溶液 0.1ml、37℃水浴水解12h，水解后尿样调成 pH9乙醚萃取
返回 缀合物的水解 三唑仑GC测定
一般规则：碱性药物在碱性pH值、
液-液萃取法水相pH值:
生物样品宜在碱性或近中性提取，
生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性 下不易萃取
空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液 中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测 定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少
第三章 附图五
空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图
常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-
《体内药物分析》PPT课件
(四) 组织
常用的脏器组织：胃、肝、肾、心、脑等
1. 样品的制备
先制成匀浆液━━萃取药物
2.样品处理
①沉淀蛋白法
②酸水解或碱水解法
③酶水解法
(五) 毛发（头发）
适用：微量元素测定
方法：有机破坏法
湿法破坏
干法破坏
氧瓶燃烧法
测定方法为原子吸收分光光度法和电感耦 合等离子体发射光谱法。
第二节、体内样品分析的前处理技术
ห้องสมุดไป่ตู้一.体内样品种类
生物样本：生物体的任何脏器组织、体液均可 作为生物样本.
常用样本:血液（血浆、血清或全血）、尿液、 唾液、毛发
二、体内样品的采集和制备
（一）血样
适用－药物药动学研究、生物利用度、治疗药物检 测等研究与实际工作。
血药浓度通常指血浆、血清中的浓度。其中 的血药浓度能够反映药物在体内（靶器官）的 状况。是体内药物分析最常用的样本 1.血样采集 动物(采血不得超过总量的1/10） 人：静脉采血1-5ml
的强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸 等。（高速离心机离心约2min ）上清液近呈酸 性pH 0 ～ 4。不适宜在酸性中分解的药物。
④ 热凝固法 要求药物热稳定好，通常加热至90℃ ，使热 变性蛋白沉淀，高速离心或过滤法除去。
方法最简单，只能除去热变性蛋白。
（二）分离纯化与浓集
一般浓集方法： ①使被测组分提取体积小
贮藏
采血后及时分离。 短期保存：4℃ 长期保存： -20℃或-70~-80℃ 全血未经分离不宜冷冻
(二) 尿液 适用－药物剂量回收、肾清除率和生物利
用度测定、药代动力学研究等. 体内药物的清除主要通过尿液的排出。药 物可以原型或代谢产物及缀合物等形式排出。 尿液中药物浓度高，收集量大、方便。但 尿液浓度通常变化较大。 尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；不 宜采样的人群：肾功能不良者、儿童 采样后应立即测定。否则应加入防腐剂或冷藏
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证ppt课件
4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
5
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
6
全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
21
④酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
22
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
15
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
11
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
12
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
60%以上精力和花费用在样品前处理上
5
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
6
全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
21
④酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
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超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
15
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
11
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
12
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证ppt课件
缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理 后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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18
②加入中性盐
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋 白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用
的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上
清液。
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21
④酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用 酶解法。
在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合 物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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12
5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
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18
②加入中性盐
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋 白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用
的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上
清液。
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21
④酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用 酶解法。
在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合 物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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12
5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
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体内药物分析ppt课件
How for LC?
UV
FL
非对映衍生化
生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。
如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？
有差别才有可能分离！
（五）分离、纯化与浓集
01
02
原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。
加入酸性沉淀剂
三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点
02
组织酶消化法 加入酶使蛋白质水解 优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化
其他 加热 超滤
1
2
01
02
03
酸水解 ： 0.1mol/L HCl，100℃，30min， 条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。
对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。
缺点：
（二）样品的贮藏
1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏， -70℃加入稳定 剂NaF 2．尿样 ①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4℃保存 ②加入防腐剂 a．1%甲苯 b．饱和氯仿 c．pH改变 3．唾液：同血样
第二节 生物样品的预处理与制备
03
缺点： 与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。
04
2．尿样
01
02
唾液是无损伤性采样，易采集。 一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓(P)密切相关，因此，在TDM中可利用测定S代替P监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。
UV
FL
非对映衍生化
生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。
如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？
有差别才有可能分离！
（五）分离、纯化与浓集
01
02
原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。
加入酸性沉淀剂
三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点
02
组织酶消化法 加入酶使蛋白质水解 优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化
其他 加热 超滤
1
2
01
02
03
酸水解 ： 0.1mol/L HCl，100℃，30min， 条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。
对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。
缺点：
（二）样品的贮藏
1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏， -70℃加入稳定 剂NaF 2．尿样 ①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4℃保存 ②加入防腐剂 a．1%甲苯 b．饱和氯仿 c．pH改变 3．唾液：同血样
第二节 生物样品的预处理与制备
03
缺点： 与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。
04
2．尿样
01
02
唾液是无损伤性采样，易采集。 一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓(P)密切相关，因此，在TDM中可利用测定S代替P监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。
《体内药物分析》课件
个体化用药指导
个体化用药指导是体内药物分析的重要应用之一。随着精 准医学的发展，个体化用药已成为提高治疗效果和降低不 良反应的重要手段。通过体内药物分析，可以实现对个体 化用药的科学指导。
在个体化用药指导中，体内药物分析可以帮助医生了解患 者对药物的代谢和反应特点，为医生制定个体化的用药方 案提供依据。这有助于提高治疗效果，降低不良反应的发 生率，提高患者的用药安全性和满意度。
03
免疫分析法
04
利用抗体与抗原的特异性结合反 应进行药物测定的方法。该方法 具有高选择性、灵敏度和简便性 ，适用于生物样品中痕量药物的 测定。
其他方法
除上述常用方法外，体内药物分 析还包括光谱法、荧光法、化学 发光法等其他一些测定方法。这 些方法在特定情况下可能更具优 势，例如光谱法在某些特定药物 的测定中具有较高的灵敏度。
某些药物可能通过皮肤排泄，但这一过程相对较 慢且排泄量较小。
05
CHAPTER
体内药物分析的应用
药效学研究
药效学研究是体内药物分析的重要应用之一。通过分析药物 在体内的代谢和作用机制，可以深入了解药物的疗效和作用 特点，为新药研发和药物优化提供科学依据。
在药效学研究中，体内药物分析可以帮助研究人员了解药物 在体内的分布、活化、代谢等过程，以及这些过程对药效的 影响。这有助于发现潜在的药物作用靶点，预测新药在不同 个体内的效果和安全性。
目的
体内药物分析的主要目的是评估药物 的有效性和安全性，为药物的研发、 生产和使用提供科学依据，同时为临 床医学、药理学和毒理学等领域的研 究提供支持。
药物代谢过程
第一季度
第二季度
第三季度
第四季度
吸收
药物通过各种途径进入 生物体内，如口服、注 射、皮肤吸收等。在吸 收过程中，药物可能受 到生物膜的屏障作用、 药物的溶解度、渗透性 等因素的影响。
体内药物分析[可修改版ppt]
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体内药物分析
1
生物样品前处理方法
▪ 常用的生物样品预处理方法
……
沉淀蛋白 液液萃取 固相萃取
生物样品分析的前处理
▪ 沉淀蛋白
▪ 操作：
50μl血浆＋150 μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心 10min→取上清液进样分析
▪ 常用沉淀剂： ▪ 与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈 ▪ 酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸 ▪ ……
▪ 色谱柱：DiamonsilTM C18（5 m ，200×4.6mm）
▪
分析柱前备有Supelco保护柱
▪ 流动相：甲醇-水（35∶65）
▪ 流 速：1.0ml/min
▪ 紫外检测波长：290nm(0.0005aufs)
▪ 柱 温：25±1℃
生物样品分析 的前处理
▪ 蛋白沉淀 （SD大鼠血浆）
2. Dissociating ion/solvent clusters before the sampling orifice
ESI示意图
生物样品分析 的前处理
液质联用对样品前处理的要求
▪ 基质效应的存在
▪ 基质效应可认为是样品中分析物周围所有成分的集 体干扰行为。
▪ 除分析物外样品中所有其它成分所引起的分析误差，尤指来 自生物样品中未知的或性质不确定的成分或体系特性(如粘 密度、离子强度、表面张力等)所引起的干扰。
▪ 溶剂的选择与纯度的要求 ▪ 有机溶剂相和水相的体积 ▪ 水相的pH 值
▪ 常用的液液萃取溶剂：
❖ 正己烷
❖ 叔丁基甲醚
极
性
❖ 乙醚
增
❖ 乙酸乙酯
加
❖ 正丁醇*
▪ 相似相容原理进行选用
▪ 沸点低、易于挥散和浓集
1
生物样品前处理方法
▪ 常用的生物样品预处理方法
……
沉淀蛋白 液液萃取 固相萃取
生物样品分析的前处理
▪ 沉淀蛋白
▪ 操作：
50μl血浆＋150 μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心 10min→取上清液进样分析
▪ 常用沉淀剂： ▪ 与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈 ▪ 酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸 ▪ ……
▪ 色谱柱：DiamonsilTM C18（5 m ，200×4.6mm）
▪
分析柱前备有Supelco保护柱
▪ 流动相：甲醇-水（35∶65）
▪ 流 速：1.0ml/min
▪ 紫外检测波长：290nm(0.0005aufs)
▪ 柱 温：25±1℃
生物样品分析 的前处理
▪ 蛋白沉淀 （SD大鼠血浆）
2. Dissociating ion/solvent clusters before the sampling orifice
ESI示意图
生物样品分析 的前处理
液质联用对样品前处理的要求
▪ 基质效应的存在
▪ 基质效应可认为是样品中分析物周围所有成分的集 体干扰行为。
▪ 除分析物外样品中所有其它成分所引起的分析误差，尤指来 自生物样品中未知的或性质不确定的成分或体系特性(如粘 密度、离子强度、表面张力等)所引起的干扰。
▪ 溶剂的选择与纯度的要求 ▪ 有机溶剂相和水相的体积 ▪ 水相的pH 值
▪ 常用的液液萃取溶剂：
❖ 正己烷
❖ 叔丁基甲醚
极
性
❖ 乙醚
增
❖ 乙酸乙酯
加
❖ 正丁醇*
▪ 相似相容原理进行选用
▪ 沸点低、易于挥散和浓集
体内药物分析概述课件
示例：血液中酒精的检测（直接测定）
顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测
0.2ml全血和0.5ml内标放到小瓶后迅速封口 小瓶被放到顶空进样器上 自动加热获得气液两相平衡 将液上气体注入GC分析
3.2.2蛋白沉淀 protein precipitation PPT ★
测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出 来
有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈）
中性盐析法（饱和硫酸铵） 强酸沉淀法（高氯酸）
使蛋白变性后除去
蛋白沉淀过程示意图
A 血浆样品200µl B 加入甲醇600µl C 涡旋混合3min后 D 10000 rpm离心10min后
ABC D
常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率
沉淀剂
甲醇 乙腈 10%三氯醋酸 钨酸盐-硫酸 (饱和)硫酸铵
分析方法的建立—色谱条件及优化
体外方法的建立
色谱柱：Diamonsil C18 柱 (5 µm, 200mm×4.6mm i.d.) 保护柱： DiamonsilTM ODS 流动相： 乙腈-0.5% 三乙胺（磷酸调pH3.0） 为21:79 流速： 1 ml/min 荧光检测：λex - 280 nm, λem - 425 nm 柱温：30℃ 内标化合物为洛美沙星（结构类似、性质相近）
药物代谢与动力学（drug metabolism and pharmacokinetics，DMPK）研究——新药研发
治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring， TDM）——临床应用
内源性物质检测——疾病标志物 社会事件中的分析——食品安全、法医毒物分
析等
体内药物分析的任务：DMPK
喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓 度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。—— 浓度依赖性
《体内药物分析》课件
方法和技术。
3
局限性的原因
分析体内药物时的局限性，包括生物变 异、样本制备和测定方法等方面的影响。
如何解决局限性问题
1 优化样本制备
2 改进测定方法
3 标准化操作流程
改进样本制备方法，以减 少样本制备过程中的误差。
ห้องสมุดไป่ตู้
优化测定方法，提高测定 的准确性和灵敏度。
制定标准化操作流程，减 少人为因素对分析结果的 影响。
通过研究药物在体内的吸收速 率和程度，了解药物在体内的 吸收过程。
药物代谢动力学参数的测 定
研究药物在体内的代谢速率和 代谢途径，了解药物在体内的 代谢过程。
体内药物分析的精度和准确性
1
精度和准确性的概念
解释精度和准确性在体内药物分析中的
如何提高精度和准确性
2
重要性和定义。
介绍提高体内药物分析精度和准确性的
《体内药物分析》PPT课 件
# 体内药物分析
什么是体内药物分析？体内药物分析是研究药物在人体内分布、代谢和排泄 等过程的科学方法。
什么是体内药物分析
体内药物分析是研究药物在人体内分布、代谢和排泄等过程的科学方法。它 包括对药物浓度的测定以及药物动力学参数的研究。
体内药物分析的应用
临床药物治疗监测
通过分离和测定药物在样品中的浓度，可以定量分析药物。
2 质谱法
利用质谱仪对药物和其代谢产物进行分析和鉴定。
3 毒理学方法
通过观察药物在体内的毒副作用，评估药物的毒理学活性和安全性。
药物动力学参数的测定
测定方法介绍
介绍药物动力学参数的测定方 法，包括药物吸收、分布、代 谢和排泄等方面的参数。
药物吸收动力学参数的测 定
体内药物分析 第一章_PPT幻灯片
分布、代谢和排泄规律 3.研究在体 内各种体液和组织 中的数量和质量
过敏和继发性反应等
第三节 体内药物分析的发展概况及 学科热点问题
二 学科热点问题
1 游离型血药浓度测定方法 2 血药浓度中游离型药物浓度 3 代谢物的监测与研究 4 对映体的监测与研究
第三节 体内药物分析的发展概况及 学科热点问题
（二）任务： 1 进行分析方法学研究 2 为药物体内研究提供数据 3 进行临床治疗药物监测 4 内源物质的测定和研究 5 滥用药物的检测
第三节 体内药物分析的发展概况及 学科热点问题
一 发展状况
临床药理学 生物药剂学
要求 完善
体内药物分析
㈠与药物动力学及生物药剂学关系
定量测定血药（或尿液）浓度
课堂要求
一、不要迟到 二、不要讲小话 三、准时上下课 四、做好预习工作
第一章 总 论
第一节 体内药物分析的意义、性质、 对象和任务
一 体内药物分析
是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内 源物质的质和量变化规律的分析方法学。
二 意义
化学上等价 生物学上不等价
三 体内药物分析的对象和任务
（一）对象：生物体的各种器官、组织和体液
第四节 体内药物分析的相关文献 四 文献单位类型
第四节 体内药物分析的相关文献 五 核心单位
第四节 体内药物分析的相关文献
六 检测样品的选择 七 实验对象的选择
体内药物分析
求出一系列动力学参数和药物制剂的生物利用度参数
根据动力学原理和数学分析方法
评价药物及其制剂的内在质量 指导临床合理用药
复习临床药理学
？ 研究
研究人体和药物之间的相互作用关系
1.研究药物进入人体内，对人体生理和生化机能影 响临床效应，以及药物作用原理
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品量少、不能重复取样：生物样品多数在特定
条件下采集，无法再次取样，且浓度低、变化幅
度大，在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要
求。
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2、唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。 缺点：药物浓度变化大 采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内 搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激 使唾液流出。
另外，在用药过量、误服或服毒等中毒事件中， 为解毒急救或判断案情，也需要进行体内药物分析； 还有对一些兴奋剂、致幻剂、镇静剂等药物滥用现象 也需要进行体内药物进行检测。
（三）体内药物分析的特点
1．干扰物质多：生物样品中含有大量的内源性物，
质如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等，
样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。
免疫测定法原理
将被测药物作为抗原（ Ag ）免疫动物使其产
生抗体（Ab），然后根据抗原、标记抗原（ Ag* ）
与一定量的抗体分子竞争结合的程度来测定抗原
（药物）的含量。
Ag*t
标记抗原总量
Agt
+ Ab
Ag*-Ab+ Ag*f
游离标记抗原
Ag-Ab+ Agf
抗原总量
游离抗原
五 体内药物分析方法建立的一般实验步骤
③ 离子型药物：离子对提取发 ④ 提取技术：提取次数尽可能少，不要求提取完 全，而要求适量而稳定的提取率。
（2）液-固提取（LSE）：
将生物样品溶液通过填有适宜担体的小柱，使 药物保留在担体上，洗去杂质后，用适当的溶剂洗 脱下来测定；或杂质保留在担体上，先把药物洗脱 下来测定。
（四）被测组分的浓集
浓集方法：
1、末次提取时，加入溶剂尽可能少 2、挥去溶剂：
（1）通入气流（氮气）吹干 （2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物
（五）化学衍生化
GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物→极性 小、稳定性好的衍生物
HPLC中，分子结构无紫外吸收→具紫外吸收或荧光 的衍生物
1、GC中化学衍生化：
（二）样品前处理的目的
1、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性 2、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质 等的污染。
（三）样品的分离与纯化
包括样品去除蛋白质、缀合物水解和待测组分的提取。
1、去除蛋白质
（1）加入与水相混溶的有机溶剂：乙腈、甲醇、乙 醇、丙酮等。 （2）加入中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐 等。 （3）加入强酸：三氯醋酸、高氯酸、硫酸-钨酸等。
一 概述
（一）体内药物分析的概念
体内药物分析：是一门研究进入人或动物体内，存在 于生物样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的 药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分 析方法学。
（二）体内药物分析的意义
通过体内药物分析结果可求得药物动力学参数， 可了解药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。 因此，体内药物分析为药物研究、制剂质量管理、临 床用药等提供了数据和信息。
多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂提取出来， 而大多数内源性杂质是强极性的，不被提取出。
液-液提取中需注意的问题：
① 适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿等。 ② 适当的水相pH值：由药物的pKa值确定，一般碱 性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下提取。
碱性药物最佳pH 高于pKa值1-2个pH单位 酸性药物最佳pH 低于pKa值1-2个pH单位 中性药物：多选碱性下提取
1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等 2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值， 考虑分离度。 3、空白样品加对照品测定：求得样品回收率，检 验样品中是否有干扰。 4、体内实际样品测定
（4）加入金属离子：CuSO4-Na2WO4等。 （5）酶解法：常用枯草菌蛋白酶
2、缀合物水解
尿液中药物多数呈缀合物状态。 （1）酸水解：适量盐酸 （2）酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶 或两者混合。
3、待测组分的提取
提取目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分 提取方法：
（1）液-液提取（LLE）：
烷基化、酰化、硅烷化等。
例：烷基化
RCOOH、ROH、RSH、RNH2 CH3I、CH3N2等
RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3 极性降低，挥发性增加
2、HPLC中化学衍生化
常用衍生化试剂有：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。
柱前衍生化 化学衍生化
柱后衍生化
四 含量测定方法
色谱分析法（HPLC、GC、TLC） 光度分析法（UV、荧光、可见） 免疫测定法（RIA、EIA、FIA）
尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或 更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏 或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）保存。
三 生物样品前处理
（一）药物在体内的存在形式
游离型：原形药物或代谢物
缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合 结合物：药物与蛋白质结合
因此，在样品测定之前要进行适当的样品制备。 包括分离、纯化、浓集、必要时还需对待测组分进 行化学衍生化。
3、尿液：
尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清 除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。
优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。 缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿 样。 采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
（二）样品贮存
取样后最好立即进行分析，不能立即分析的， 则短期内冷藏(4℃)，长期冰冻(-20℃) 。
条件下采集，无法再次取样，且浓度低、变化幅
度大，在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要
求。
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2、唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。 缺点：药物浓度变化大 采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内 搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激 使唾液流出。
另外，在用药过量、误服或服毒等中毒事件中， 为解毒急救或判断案情，也需要进行体内药物分析； 还有对一些兴奋剂、致幻剂、镇静剂等药物滥用现象 也需要进行体内药物进行检测。
（三）体内药物分析的特点
1．干扰物质多：生物样品中含有大量的内源性物，
质如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等，
样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。
免疫测定法原理
将被测药物作为抗原（ Ag ）免疫动物使其产
生抗体（Ab），然后根据抗原、标记抗原（ Ag* ）
与一定量的抗体分子竞争结合的程度来测定抗原
（药物）的含量。
Ag*t
标记抗原总量
Agt
+ Ab
Ag*-Ab+ Ag*f
游离标记抗原
Ag-Ab+ Agf
抗原总量
游离抗原
五 体内药物分析方法建立的一般实验步骤
③ 离子型药物：离子对提取发 ④ 提取技术：提取次数尽可能少，不要求提取完 全，而要求适量而稳定的提取率。
（2）液-固提取（LSE）：
将生物样品溶液通过填有适宜担体的小柱，使 药物保留在担体上，洗去杂质后，用适当的溶剂洗 脱下来测定；或杂质保留在担体上，先把药物洗脱 下来测定。
（四）被测组分的浓集
浓集方法：
1、末次提取时，加入溶剂尽可能少 2、挥去溶剂：
（1）通入气流（氮气）吹干 （2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物
（五）化学衍生化
GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物→极性 小、稳定性好的衍生物
HPLC中，分子结构无紫外吸收→具紫外吸收或荧光 的衍生物
1、GC中化学衍生化：
（二）样品前处理的目的
1、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性 2、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质 等的污染。
（三）样品的分离与纯化
包括样品去除蛋白质、缀合物水解和待测组分的提取。
1、去除蛋白质
（1）加入与水相混溶的有机溶剂：乙腈、甲醇、乙 醇、丙酮等。 （2）加入中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐 等。 （3）加入强酸：三氯醋酸、高氯酸、硫酸-钨酸等。
一 概述
（一）体内药物分析的概念
体内药物分析：是一门研究进入人或动物体内，存在 于生物样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的 药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分 析方法学。
（二）体内药物分析的意义
通过体内药物分析结果可求得药物动力学参数， 可了解药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。 因此，体内药物分析为药物研究、制剂质量管理、临 床用药等提供了数据和信息。
多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂提取出来， 而大多数内源性杂质是强极性的，不被提取出。
液-液提取中需注意的问题：
① 适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿等。 ② 适当的水相pH值：由药物的pKa值确定，一般碱 性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下提取。
碱性药物最佳pH 高于pKa值1-2个pH单位 酸性药物最佳pH 低于pKa值1-2个pH单位 中性药物：多选碱性下提取
1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等 2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值， 考虑分离度。 3、空白样品加对照品测定：求得样品回收率，检 验样品中是否有干扰。 4、体内实际样品测定
（4）加入金属离子：CuSO4-Na2WO4等。 （5）酶解法：常用枯草菌蛋白酶
2、缀合物水解
尿液中药物多数呈缀合物状态。 （1）酸水解：适量盐酸 （2）酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶 或两者混合。
3、待测组分的提取
提取目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分 提取方法：
（1）液-液提取（LLE）：
烷基化、酰化、硅烷化等。
例：烷基化
RCOOH、ROH、RSH、RNH2 CH3I、CH3N2等
RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3 极性降低，挥发性增加
2、HPLC中化学衍生化
常用衍生化试剂有：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。
柱前衍生化 化学衍生化
柱后衍生化
四 含量测定方法
色谱分析法（HPLC、GC、TLC） 光度分析法（UV、荧光、可见） 免疫测定法（RIA、EIA、FIA）
尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或 更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏 或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）保存。
三 生物样品前处理
（一）药物在体内的存在形式
游离型：原形药物或代谢物
缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合 结合物：药物与蛋白质结合
因此，在样品测定之前要进行适当的样品制备。 包括分离、纯化、浓集、必要时还需对待测组分进 行化学衍生化。
3、尿液：
尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清 除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。
优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。 缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿 样。 采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
（二）样品贮存
取样后最好立即进行分析，不能立即分析的， 则短期内冷藏(4℃)，长期冰冻(-20℃) 。