【发酵工程】第五章 发酵工业种子制备

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种子扩大培养阶段

液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
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生产车间种子制备
接种种龄和接种量

接种量：移入的种子液体积和接种后培养液 体的体积的比例

接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰 老细胞增加等，发酵后劲不足
种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
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原材料质量波动引起种子质量不稳定 原材料质量波动的主要原因：无机离子 含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
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培养温度

温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨 基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
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湿度

湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少

大量地接入培养成熟的菌种的优点：

缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率


节约发酵培养的动力消耗
有利于减少染菌机会
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放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
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在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
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影响种子质量的因素

原材料质量
培养温度
斜面冷藏时间 培养基 pH
湿度
通气与搅拌
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原材料质量

实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子 罐进行扩大培养 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子 罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养 条件，使菌体适应发酵环境

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种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及 减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
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确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)
瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度
发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
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种子质量的判断方法


斜面冷藏时间

对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
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培养基

培养种子的目的：

扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性 高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。

通常检测的培养液中参数

pH是否在种子要求的范围之内


糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染

其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等
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种子制备

步骤：

斜面培养基中活化；

扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培
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种子培养基特点

有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大；

各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

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pH

选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应 接近于发酵培养基的pH，以便种子 能尽快适应新的环境

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种子质量的控制措施

菌种稳定性的检查

测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并 及时对退化菌种进行复壮

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种龄与接种量
接种龄
种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。
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种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期

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举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
酵母发酵时的种子扩大培养

酿酒酵母的扩大培养

最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为10％，并控制繁殖条件与酿造 时一致
现代的流程中，接种量为1%或更低， 控制的条件也与酿造时不同。
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面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以
利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐 进行发酵
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利用孢子作为接种物

在固化的培养基上产生孢子
“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产
在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子

在液体深层培养基中产生孢子
灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子
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本章内容：

种子制备原理与技术 影响种子质量的因素
种子质量的控制措施
种子制备的放大原理与技术
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种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件

生长活力强，延迟期短；
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丝状真菌的菌丝体作为接种物

不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种—— 藤仓赤霉

问题：难以获得均一的接种物
接种前将菌丝打成碎片，形成大量的 菌丝段，它具有大量的生长点
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养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； 种子转种至发酵罐
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种子制备过程

实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养

生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
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通气与搅拌

足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁 殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过 多增加染菌机会，增加能耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
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生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
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种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
放线菌发酵时的种子扩大培养

斜面培养，制备孢子悬浮液作初级 种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子

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提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵。
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
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种子制备的放大原理与技术

细菌发酵时的种子扩大培养；
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ；
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实验室种子制备

无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子


菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法
不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可