昆明医学院分子生物学实验设计2012.ppt

5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？
（选答）
• 无关，体型瘦小跟先天遗传有一点关系，但是后 天性的运动跟营养更重要。有蚕豆病不一定就瘦 小。蚕豆病不能吃蚕豆，但可以从其它食物中来 弥补。蚕豆病最主要的特征是 G6PD缺陷。然而 G6PD缺乏症是一种遗传性代谢疾病，G6PD缺陷 症有多种临床表现，包括新生儿高胆血红素症、 感染及药物引起的急性溶血性贫血和慢性非球形 细胞溶血性贫血等。但并不会引起体型瘦小。
思考题
1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查， 初步判断患儿是何种疾病？（必答）
面色苍白——贫血 伴血尿——血红蛋白尿 恶心、呕吐——说明有溶血性贫血 尿呈酱油色——蚕豆病典型体征 姐姐有过类似情况——符合蚕豆病具有遗传性 这一特点
相关知识
• 蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸 葡萄糖脱氢酶(G6PD酶)缺乏者进食 蚕豆后，随后发生的急性溶血性疾 病。通过性联不全显性遗传，G-6PD基因在X染色体上，病人大多为 男性，男女之比约为7∶1，在生吃 蚕豆后数小时至数日（1～3天）内 突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿 呈酱油样或葡萄酒色，一般发作 2～6天后能自行恢复，但重者若不 及时抢救，会因循环衰竭危及生命。
2，还原型谷胱甘肽（GSH）是体内重要的 抗氧化剂，可以保护一些含—SH(氢硫基)的 蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损 害。因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH 以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（ 抗氧化作用），高铁血红蛋白还原成血红蛋 白降低。
3，高铁血红蛋白还原率(MHb% )在31～74 之间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台子)，即 为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活性正常，判断为阴性。
3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室
检查结果。（必答）
蚕豆病
遗传性
葡萄糖-6磷-酸脱氢酶
急性溶血性贫血
1，G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以 维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗 氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱 发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分 子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质， 损害细胞膜发生溶血。 故临床表现为黄疸，精神萎靡，低热。溶血 严重发生心力衰竭，造成食欲不振、恶心、 呕吐 这些临床症状，心衰最典型的症状是程 度不同的呼吸困难，所以病人呼吸急促。
4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪 些技术检测什么目的基因？（选答）
1.PCR，利用PCR技术由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤，扩增葡萄糖6磷酸脱氢酶 热点基因片段。采用单链构象多态性 （SSCP）技术对扩增片段进行分析。用 PCR直接测序以确定突变的基因位点
• 检测X染色体内G6PD的基因及扩增其因.
4, 急性溶血性贫血 起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白 、腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出 现恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状。这
是由于红细胞大量破坏，其分解产物对机 体的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆 内浓度加深时，即由尿液排出，出现血红 蛋白尿，尿色如浓红茶或酱油样，12小 时后可出现黄疸，溶血产物损害肾小管细 胞，引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管， 以及周围循环衰弱等因素，可致急性肾功 能衰竭。
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• 表1 高轶血红蛋白还原试验操作步骤
4 颠倒混匀，以“B”管为空白管， 在波长635 nm 处测定“A”管及“ S”管吸光度。 5 高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1 一A／S)×100 ，MHb%在31～74 之间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台 子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断 为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD 活性正常，判断为阴性。
实验步骤
• 1 将抗凝血以1000 r／min离心沉淀1 5 min，取出．调整血细胞与血浆比侧为1：l 后再混匀。
• 2 将0．18 mol／L 亚硝酸钠一0．28 mol ／L葡萄糖溶液与0．4 mmol／L亚甲基蓝 溶液等量混合．形成混合试剂
• 3 取1 5 mm×150 mm 试管3支，标明A、 B、S，按表1顺序进行操作
G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型 谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇 到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红 细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过 氧化脂质，损害细胞膜。 G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用， 新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红 细胞被破坏而致病。 亚甲基蓝与血红蛋白结合能力强 亚硝酸钠能使血红蛋白变成高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原试验意义 当红细胞G-6-PD活性 正常时，还原率>75%；如G-6-PD缺陷，形成高铁 血红蛋白，还原速度远较正常红细胞慢，还原率显 著降低。
实验结果
• 朗伯比尔定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度， T-透射比，K-摩尔吸收Hale Waihona Puke Baidu数，c-吸光物质的 浓度，b-收层厚度）
高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1一A／ S)×100 ，MHb%在31～74 之间(中间值， 杂合子)或≤30 (纯台子)，即为G 6PD活性缺 乏，均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为 G6PD活性正常，判断为阴性。
昆明医学院分子生物学实验设计2012
实验名称 高铁血红蛋白还原实验 实验目的
• 掌握高铁血红蛋白还原实验的 操作及步骤
• 了解G6PD的活性检测
实验原理
• 正常红细胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖转变为6磷酸葡 萄糖酸，同时又能使其辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(NADP+)还原为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(NADPH)，高铁血红蛋白在NADPH供氢条件下 还原成还原血红蛋白。氧化型亚甲基蓝可作为递氢体 加速磷酸戊糖旁路代谢中此种作用的速度，当G6PD缺 乏时，在递氢体亚甲基蓝加速磷酸戊糖旁路的条件下， 高铁血红蛋白还原速度显著降低，因此，可根据高铁 血红蛋白还原的速度来了解红细胞有无G6PD缺乏。