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分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件

分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件
第12章 分子生物学实验技术(1-3)
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
精品资料
• 你怎么称呼老师?
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点,你 是否会认为老师的教学方法需要改进?
• 你所经历的课堂,是讲座式还是讨论式? • 教师的教鞭
10×Buffer
2.0µl
Mg2+(25mM) 1.2µl
Taq酶(5U/µl) 0.1µl
dNTP(25mM) 0.2µl
加水至20µl,混合后,进行 PCR扩增 。
PCR反应程序:
Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒
(SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。 ) Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环
对BC3F3(113株)田间成株期鉴定为: R : S = 78 : 35
2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立
6个抗病株DNA和6个感病株DNA以2BL上的17对SSR 引物进行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳多 态性引物Xgwm501对BC3F2(44株)和BC3F3(113株) 进行分析 Xgwm501—195bp、160bp 11.9cM Yr5基因
2、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。
基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。
基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
Sh C P1
Sh C
Sh C
94%
细胞
无交
sh c

分子生物学实验技术ppt课件

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质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +

定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒(﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后,用蛋白质水解酶裂解成肽段,可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子, 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值(M/Z值)的蛋白离子分离开,经过离子检测器收集分离 的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法: 基质辅助激光解吸附/离子化(MALDI)、电喷雾离子化 (ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后, 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达,得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化,基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用,可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来,再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法: 酵母双杂交技术,噬菌体展示技术,表
面等离子共振技术,荧光共振能量转移 技术,蛋白质微阵列芯片技术,免疫共 沉淀技术,pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳(2-DE),是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离,即等点聚焦(IEF),然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离,即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物, 使PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起,用于嵌合基因的构 建

医学分子生物学实验技术-课件(PPT-精)共18页

医学分子生物学实验技术-课件(PPT-精)共18页
医学分子生物学实验技术-课件(PPT-
精)
21、没有人陪你走一辈子,所以你要 适应孤 独,没 有人会 帮你一 辈子, 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候,留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运,首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首,因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿. 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ,它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ,以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
谢谢!
ห้องสมุดไป่ตู้
61、奢侈是舒适的,否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学,如日出之阳;壮而好学 ,如日 中之光 ;志而 好学, 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也,匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里,与其说好 的教师 是幸福 ,不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战,就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿

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最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而 CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
1. 将1 g叶片用液氮速冻后,迅速研磨成白色粉末,置入1.5 ml 离心管中; 2. 加入600 ul 预热的cTAB提取液65℃水浴提取1 hr,其中每10 min颠倒混
匀1次; 3. 取出离心管,冰浴冷却5 min 后,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),轻
1、根据带的深浅(明暗),估计含量
2、根据杂带的多少,判断纯度
3、根据和对比带(marker)比较, 大概知道片段的大小
Polyacrylamide (聚丙稀酰 胺):
has high resolving capability, and can resolve DNA/RNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.
4. 因此,可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)NA也可用于Northern blot试 验。
提取植物RNA时,要注意的问题:
1)一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞;
2)要加入蛋白质变性剂,使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA;
2.2 植物总RNA的提取与电泳
由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子,如 mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。 RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一,在分子生 物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern验。
Agarose (琼脂糖):
(1) a much less resolving
4 kb 3 kb
power than
2 kb
polyacrylamide,
1 kb
(2) but can separate DNA

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理论上 61 gaatctggta gaagtgagtt ttggatagta aaataagttt cgaactctgg cacctttcaa
121 ttttgtcgca ctctccttgtt tttgacaatg caatcatat gcttctgcta tgttaagcgt
目的基因片段长度:330bp 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag
分子生物学实验
一、人类基因组DNA提取 二、PCR技术 三、RFLP技术
1
实验流程图
采集血液样本
提取基因组DNA
基因位点的PCR扩增
琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物
PCR产物酶切
琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物
DNA凝胶成像系统判读基因型
统计分析各等位基因频率
2
一、人类基因组DNA提取 材料:生物组织、培养细胞、血液样品 常规提取基因组DNA主要步骤: 1.破碎细胞: (1)物理方法:超声波、匀浆、液氮研磨 法等(易导至DNA链的断裂 ) (2)化学等温和方法(获得大分子量DNA)
10
引物:能与模板DNA两条链上的各一 段序列互补的寡核苷酸(15~20bp)
SRY基因引物:
上游引物:5′GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG3′ 下游引物:5′CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTC 3' 扩增DNA片段长度:330bp
11
SRY基因部分序列
1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa
1OD260单链DNA或RNA≈40μg/ml 样品纯度判定:OD260/ OD280 ≈ 1.8~2.0 DNA或RNA较纯

分子生物学实验 ppt课件

分子生物学实验  ppt课件
分 子 生 物 学 实 验下
ppt课件
1
实验流程一
ppt课件
2
实验安排
准备材料:重组工程菌目标蛋白的表达 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装 离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白、 离子交换层析 第3次 亲和柱层析,并对收集样 品进行测活、定蛋白等 第4次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析 第5次 Western blotting, 绘出分离纯化表 ppt 绘制包涵体复性曲线 课件
ppt课件 23
B瓶 1N NaCl 100ml
A瓶 0N NaCl 100ml
ppt课件
24
操作要点
1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A(混合器)和洗脱瓶B(贮存器)
内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ(注意加溶液的方法),
注意液面应处于同一水平面,同时应排除连接管内的气泡 2) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关,调节搅拌速度,以 混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开,同时将
O
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O O
-
-
Na+ Na+
碱性磷酸酶
O
- P
OH 对硝基苯酚
p-NP
NO2
NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物,根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下,每分钟转 化产生1μ mol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
ppt课件 6
每10秒记一个数(0、10、20、……120) 将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中, 做时间t—A405曲线,得到斜率,
ppt课件 20
层析操作一般过程
装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品 上样前后样品活性测定---当天测定 上样前后蛋白浓度测定---最后一天测定

分子生物学实验课件

分子生物学实验课件

分子生物学实验课件实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制,掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。

二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株:R-,M-,Amp-2、实验设备恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌工作台,高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏,蛋白胨,氯化钠,琼脂,卡那霉素三、实验步骤液体LB(Luria-Bertain)培养基配方:蛋白胨(typtone) 1.0% (1 g/100 ml)酵母提取物(Yeast extraction)0.5% (0.5g/100 ml)氯化钠 1.0% (1 g/100 ml)PH 7.0固体LB培养基:每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药,防止药品相互污染!(1)每组按上述液体LB培养基配方,以配制100ml的量称取药品放入烧杯。

(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中,玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。

(3)pH试纸检测pH值,并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。

(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶,每瓶为50ml。

(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中,以配制成两瓶50ml固体LB培养基。

(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。

并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。

(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中,盖上锅盖,以对称方式拧紧锅盖,打开排气阀通电加热,至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时,关闭排气阀。

当高压锅温度(气压)指示器指示锅温度升高至121℃(0.1Mpa)时,调节电压(或利用手动开关电源的方式)使高压锅稳定在该温度(压力)下20 min,然后断开电源。

待指示器指示压力降为0时,方可打开排气阀,然后再打开锅盖小心取出锅物品。

(8)取出三角瓶后,在酒精灯火焰旁进行下述操作。

医学分子生物学PPT课件

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高通量测序技术则可以对整个 基因组进行测序,提供更加全 面和准确的基因信息,是目前 最先进的基因诊断技术之一。
基因诊断技术在临床中应用案例分析
01
基因诊断技术在临床中应用广泛,如用于遗传性疾病的诊断、病原体 检测、药物基因组学等。
02
例如,对于遗传性疾病的诊断,基因诊断技术可以检测出患者是否携 带某种遗传病的致病基因,为疾病的早期预防和治疗提供依据。
03
在病原体检测方面,基因诊断技术可以快速、准确地检测出病原体的 种类和数量,有助于临床医生及时采取有效的治疗措施。
04
药物基因组学则是利用基因诊断技术,分析个体对药物的代谢和反应 差异,为个体化用药提供指导。
07
基因治疗策略安全性问题 探讨
基因治疗策略概述
基因治疗定义
通过修改或操纵人类或其 他生物的遗传物质以达到 治疗疾病的目的。
06
基因诊断技术原理临床应 用
基因诊断技术原理简介
基因诊断是利用分子生物学技术 ,检测和分析基因的结构和功能 异常,从而对疾病进行诊断和预
测。
基因诊断技术基于DNA或RNA 水平的变化,包括基因突变、基 因缺失、基因插入、基因重排等

通过检测这些变化,可以确定个 体是否携带某种疾病的易感基因 或已经患病,为临床诊断和治疗
提供依据。
基因诊断技术方法分类
基因诊断技术主要包括核酸检 测技术、基因芯片技术、高通
量测序技术等。
核酸检测技术是最常用的基因 诊断方法之一,包括聚合酶链 式反应(PCR)、实时荧光定 量PCR等,可用于检测病原体
、基因突变等。
基因芯片技术是一种高通量的 基因检测技术,可以同时检测 多个基因的变化,适用于大规 模筛查和基因表达谱分析。

医学分子生物学实验ppt课件

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3)在电泳中形成肉眼可见的指示带,可判断DNA电泳的速度
和位置
精选编辑ppt
50
荧光染料 (如SYBR Green I)
荧光染料SYBR Green I嵌入DNA的碱基平 面后,本身无荧光的DNA在紫外光激发下 发出荧光,且荧光强度与DNA含量呈正比。
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SYBR Green I
51
DNA 分子标准物 (DNA Marker)
用大量程的移液器移取小体积的液体 装配吸头时气密性不好,吸头不匹配 吸液速度和放液速度太快
自我检测漏气:吸取液体,垂直静置5秒,
观察是否有液滴流出;
规范操作,损坏赔偿!
精选编辑ppt
21
实验报告要求
精选编辑ppt
22
实验报告按下列要求书写
❖ 1. 实验题目——当次实验
❖ 2. 实验原理——简明扼要,有针对性
精选编辑ppt
43
1
2
3
4
5
6
精选编辑ppt
44
精选编辑ppt
45
琼 脂 糖 凝 胶 电 精选编辑ppt 泳 系 统
46
紫外投射分析仪:
精选编辑ppt
47
凝胶成像系统
精选编辑ppt
48
琼脂糖凝胶电泳操作步骤
❖ 样品:PCR产物 10 µl ❖ 加上样缓冲液2 µl,加荧光染料如Sybr Green I
注意点:缓慢转动,记录时间
❖ 停止(转速按钮回零,时间按钮回零,完全停止后 轻轻取出离心管)
精选编辑ppt
6
使用注意事项
❖ 1. 样品需对称放置; ❖ 2. 先调节离心时间,离心开始缓慢提高转速
至设定值; ❖ 3. 离心结束需等转子完全停止后才能打开离

分子生物学课件(共51张PPT)

分子生物学课件(共51张PPT)
二级结构
蛋白质局部主链的空间结构, 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构,每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白:作为细胞的结构,如膜蛋白,染色体蛋白等 。 酶:催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象,揭示生命现象的分子基
础,是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入,为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存

表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达

05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元,共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶, 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程

分子生物学实验课件

分子生物学实验课件
• 与诱导前对照比较,可知诱导效率较好,蛋白表达量较多 ,成功率高。
参考文献
1.马金石. 绿色荧光蛋白[ J] . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 250.
2. 季爱加, 宁喜斌 原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表 达 微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷 第4 期
• 继续培养,分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品,作为诱导后 的样品。
• 每次取1mL样品置于Eppendorf管中,冰浴待用。诱导完后,将样品 5000r/min离心5min,回收上清液进行下一步实验或者保存在-20℃冰 箱中。
检测:SDS-PAGE原 理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。
制备感受态细胞
制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法
(一)受体菌培养 1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落,接种于5 ml LB培养基中,37 ℃振荡培养过夜。 2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5 ml LB培养基中,37 ℃振 荡培养2-3 h,至菌浓度OD600=0.3-0.5 (二)感受态制备 1.将培养液冰浴20 min,取1.5ml菌液于无菌EP管中,4℃离心6000 rpm ,5 min. 2.重复上述操作,收集4.5ml菌液的菌体. 3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体,冰上放置10min,4℃离心6000rpm,5 min.4.弃上清,加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞,冰上放置数分钟后 即为感受态细胞悬液。
• 分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基,37℃恒温培养1~2h。
• 当细菌浓度A600达到0.4~0.6时,分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的 样品,其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L,其中一 瓶实验组不加IPTG的对照。

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基因组特点
基因组具有高度的复杂性 和多样性,同时不同生物 之间的基因组存在显著的 差异。
基因表达调控机制
基因表达概念
基因表达是指基因转录成mRNA并翻 译成蛋白质的过程。
表观遗传学调控
表观遗传学调控是指通过DNA甲基化、 组蛋白修饰等方式对基因表达进行调 控,但不改变DNA序列本身。
基因表达调控
生物体通过多种机制对基因表达进行 精确调控,包括转录水平调控、转录 后水平调控和翻译水平调控等。
05
蛋白质组学研究方法及应 用
蛋白质组学概念及研究内容
蛋白质组学定义
研究生物体或特定细胞类型中所有蛋 白质的科学,包括蛋白质表达、结构、 功能和相互作用等方面。
蛋白质组学研究内容
包括蛋白质表达谱、蛋白质翻译后修饰、 蛋白质相互作用网络等。
蛋白质分离纯化技术
双向凝胶电泳
利用蛋白质的等电点和分子量差 异进行分离,具有高分辨率和高
数据库资源搜索策略
数据库类型
包括核酸序列数据库、蛋白质序列 数据库、结构数据库、基因组数据 库等。
搜索策略
根据研究目的和数据类型,选择合 适的数据库和搜索工具,制定有效 的搜索策略,以获取准确、全面的 数据资源。
序列比对和注释方法
序列比对
通过比较两个或多个生物分子序列的相似性和差异性,来推断它们的结构、功 能和进化关系。常用的序列比对方法包括全局比对和局部比对。
程。
microRNA
通过与mRNA结合,抑 制翻译过程或促进 mRNA降解。
表观遗传调控
通过DNA甲基化、组蛋 白修饰等方式,调控基
因表达。
异常情况对生理功能影响
1 2
转录和翻译异常 导致蛋白质合成异常,影响细胞功能和代谢。

医学分子生物学ppt完整版

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通过蛋白质组学技术可以筛选疾病相关的生物标志物,为疾病的早期诊
断和治疗提供新的思路和方法。
06
基因诊断与治疗
基因诊断的原理与方法
原理
基因诊断是基于DNA或RNA水平上的检测,通过检测特定基因序列的存在、缺失或变异,来判 断个体是否携带某种疾病相关的基因。
方法
包括聚合酶链式反应(PCR)、基因测序、基因芯片技术等。这些方法可以检测基因突变、基 因多态性、基因表达水平等,为疾病的早期诊断和预后评估提供依据。
基因编辑技术的发展与挑战
发展
基因编辑技术是一种能够在DNA水平上对基因进行精确编辑的技术,包括CRISPRCas9系统、TALENs和ZFNs等。这些技术的发展为基因治疗提供了新的手段和思路。
挑战
基因编辑技术虽然具有巨大的潜力,但也面临着许多挑战,如安全性问题、伦理问 题等。此外,基因编辑技术的效率和准确性也需要进一步提高和完善。
基因表达的调控
研究基因表达在时间和空间上的调控机制, 包括转录因子、表观遗传学修饰等。
分子生物学与医学的关系
疾病发生的分子基础
分子生物学可以揭示疾病发生的分子 机制,为疾病的预防、诊断和治疗提
供理论依据。
药物设计与研发
分子生物学的发展促进了药物设计与 研发领域的进步,使得药物更加具有
针对性和有效性。
基因治疗的策略与应用
策略
基因治疗是通过向患者体内导入正常的基因或修复患者体内有缺陷的基因,以 达到治疗疾病的目的。根据导入基因的方式不同,基因治疗可分为体外基因治 疗和体内基因治疗。
应用
目前基因治疗已经在多种疾病中进行了尝试,如遗传性疾病、感染性疾病、恶 性肿瘤等。虽然取得了一些成果,但仍存在许多挑战和问题需要解决。
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• 表1 高轶血红蛋白还原试验操作步骤
4 颠倒混匀,以“B”管为空白管, 在波长635 nm 处测定“A”管及“ S”管吸光度。 5 高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1 一A/S)×100 ,MHb%在31~74 之间(中间值,杂合子)或≤30 (纯台 子),即为G 6PD活性缺乏,均判断 为阳性。MHb% ≥75 ,则为G6PD 活性正常,判断为阴性。
3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室
检查结果。(必答)
蚕豆病
遗传性
葡萄糖-6磷-酸够的NADPH以 维持还原型谷胱甘肽(GSH)的还原性(抗 氧化作用),在遇到蚕豆中某种因子后更诱 发了红细胞膜被氧化,红细胞膜上的磷脂分 子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质, 损害细胞膜发生溶血。 故临床表现为黄疸,精神萎靡,低热。溶血 严重发生心力衰竭,造成食欲不振、恶心、 呕吐 这些临床症状,心衰最典型的症状是程 度不同的呼吸困难,所以病人呼吸急促。
5. 患者体型瘦小与该病症是否有关,为什么?
(选答)
• 无关,体型瘦小跟先天遗传有一点关系,但是后 天性的运动跟营养更重要。有蚕豆病不一定就瘦 小。蚕豆病不能吃蚕豆,但可以从其它食物中来 弥补。蚕豆病最主要的特征是 G6PD缺陷。然而 G6PD缺乏症是一种遗传性代谢疾病,G6PD缺陷 症有多种临床表现,包括新生儿高胆血红素症、 感染及药物引起的急性溶血性贫血和慢性非球形 细胞溶血性贫血等。但并不会引起体型瘦小。
实验结果
• 朗伯比尔定律A=lg(1/T)=Kbc(A-吸光度, T-透射比,K-摩尔吸收系数,c-吸光物质的 浓度,b-收层厚度)
高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1一A/ S)×100 ,MHb%在31~74 之间(中间值, 杂合子)或≤30 (纯台子),即为G 6PD活性缺 乏,均判断为阳性。MHb% ≥75 ,则为 G6PD活性正常,判断为阴性。
4.要想探讨该病发生的分子基础,可以用哪 些技术检测什么目的基因?(选答)
1.PCR,利用PCR技术由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤,扩增葡萄糖6磷酸脱氢酶 热点基因片段。采用单链构象多态性 (SSCP)技术对扩增片段进行分析。用 PCR直接测序以确定突变的基因位点
• 检测X染色体内G6PD的基因及扩增其因.
实验步骤
• 1 将抗凝血以1000 r/min离心沉淀1 5 min,取出.调整血细胞与血浆比侧为1:l 后再混匀。
• 2 将0.18 mol/L 亚硝酸钠一0.28 mol /L葡萄糖溶液与0.4 mmol/L亚甲基蓝 溶液等量混合.形成混合试剂
• 3 取1 5 mm×150 mm 试管3支,标明A、 B、S,按表1顺序进行操作
2,还原型谷胱甘肽(GSH)是体内重要的 抗氧化剂,可以保护一些含—SH(氢硫基)的 蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损 害。因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH 以维持还原型谷胱甘肽(GSH)的还原性( 抗氧化作用),高铁血红蛋白还原成血红蛋 白降低。
3,高铁血红蛋白还原率(MHb% )在31~74 之间(中间值,杂合子)或≤30 (纯台子),即 为G 6PD活性缺乏,均判断为阳性。MHb% ≥75 ,则为G6PD活性正常,判断为阴性。
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昆明医学院分子生物学实验设计2012
实验名称 高铁血红蛋白还原实验 实验目的
• 掌握高铁血红蛋白还原实验的 操作及步骤
• 了解G6PD的活性检测
实验原理
• 正常红细胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖转变为6磷酸葡 萄糖酸,同时又能使其辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(NADP+)还原为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(NADPH),高铁血红蛋白在NADPH供氢条件下 还原成还原血红蛋白。氧化型亚甲基蓝可作为递氢体 加速磷酸戊糖旁路代谢中此种作用的速度,当G6PD缺 乏时,在递氢体亚甲基蓝加速磷酸戊糖旁路的条件下, 高铁血红蛋白还原速度显著降低,因此,可根据高铁 血红蛋白还原的速度来了解红细胞有无G6PD缺乏。
思考题
1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查, 初步判断患儿是何种疾病?(必答)
面色苍白——贫血 伴血尿——血红蛋白尿 恶心、呕吐——说明有溶血性贫血 尿呈酱油色——蚕豆病典型体征 姐姐有过类似情况——符合蚕豆病具有遗传性 这一特点
相关知识
• 蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸 葡萄糖脱氢酶(G6PD酶)缺乏者进食 蚕豆后,随后发生的急性溶血性疾 病。通过性联不全显性遗传,G-6PD基因在X染色体上,病人大多为 男性,男女之比约为7∶1,在生吃 蚕豆后数小时至数日(1~3天)内 突然发热、头晕、烦躁、恶心,尿 呈酱油样或葡萄酒色,一般发作 2~6天后能自行恢复,但重者若不 及时抢救,会因循环衰竭危及生命。
4, 急性溶血性贫血 起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白 、腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出 现恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状。这
是由于红细胞大量破坏,其分解产物对机 体的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆 内浓度加深时,即由尿液排出,出现血红 蛋白尿,尿色如浓红茶或酱油样,12小 时后可出现黄疸,溶血产物损害肾小管细 胞,引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管, 以及周围循环衰弱等因素,可致急性肾功 能衰竭。
G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型 谷胱甘肽(GSH)的还原性(抗氧化作用),在遇 到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化,红 细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过 氧化脂质,损害细胞膜。 G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用, 新鲜蚕豆是很强的氧化剂,当G-6-PD缺乏时则红 细胞被破坏而致病。 亚甲基蓝与血红蛋白结合能力强 亚硝酸钠能使血红蛋白变成高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原试验意义 当红细胞G-6-PD活性 正常时,还原率>75%;如G-6-PD缺陷,形成高铁 血红蛋白,还原速度远较正常红细胞慢,还原率显 著降低。
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