质粒的提取和纯化

【操作步骤】
⒎向吸附柱中加入500 μl Buffer PB ， 12,000rpm
离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重
新放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入600μl Buffer PW， 12,000rpm
离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重
新放回收集管中。（重复一次）
9. 将吸附柱重新放回收集管中， 12,000rpm离
【操作步骤】
⒋ 向离心管中加入350μl Buffer N3，立即上下颠倒
混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5
分钟。 12,000rpm离心10分钟。 ⒌ 向已装入收集管的吸附柱中加入200μl Buffer PS， 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。 ⒍ 将步骤4所得的上清液转移到吸附柱中， 12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。
心2分钟，倒掉废液。将吸附柱放入一个新
的离心管中置于室温数分钟，以彻底晾干。
10. 向吸附膜的中间部位加入50-100 μl Buffer
EB，室温放置2-5分钟， 12,000rpm离心2分
钟，将质粒溶液收集到离心管中，-20Байду номын сангаас保
存。
清理桌面，撰写实验报告
【器材】
微量移液取样器，枪头，PCR管， Spin Column CM， Collection Tube，离心机
【试剂】
Buffer P1, Buffer P2, Buffer N3, Buffer PS, Buffer PB, Buffer PW, Buffer EB, RNase A, 无 水乙醇。
实验：
质粒的提取和纯化
【目的】
了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小 量制备方法。
【原理】
本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它 既能使细菌细胞裂，又能使一些蛋白质变性。 用 SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质 粒DNA 和染色体DNA。 两种DNA 在强碱环境都会变 性。当加入pH=4.8的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后， 质粒DNA 将迅速复性，而染色体DNA 分子巨大，难 以复性。通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质沉淀（SDS 的作用下）除去，而质粒 DNA 留在上清中。再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可 得到纯化的质粒 DNA。
【操作步骤】
⒈ 取1ml过夜培养的菌液加入离心管中， 12,000rpm 离心3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上 清。 ⒉ 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer
P1，充分混匀，悬浮菌体沉淀。
⒊ 向离心管中加入250μl Buffer P2，轻轻混匀6-8
次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。