核酸等温扩增
三种核酸检测方法
三种核酸检测方法
目前常用的三种核酸检测方法为：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR 是一种常用的核酸检测方法，通过引物与目标序列的互补配对，利用酶的作用在体外复制目标DNA 或RNA 片段，进行扩增后，通过荧光探针或凝胶电泳等方法进行检测。
PCR 方法具有高灵敏度和特异性，可以检测极微量的目标核酸。
2. LAMP（等温扩增法）：LAMP 是一种基于异构酶的等温扩增技术，可以在恒温条件下，通过多个特异性引物和DNA 聚合酶，实现核酸片段的高倍增。
LAMP 技术不需要特殊设备和高精度温控，成本较低，操作方便，适用于一些基层医疗机构进行疫情监测。
3. NGS（高通量测序）：NGS 是一种高通量测序技术，可以同时测定数百万条DNA 或RNA 片段的序列，广泛应用于基因组学和转录组学研究。
在核酸检测领域，NGS 技术可以通过对样本进行高通量测序，快速检测和鉴定病原体的基因组序列，对于新型病毒的检测和变异分析具有较高的灵敏度和准确性。
然而，NGS 技术需要专业的设备和分析软件，成本较高，操作复杂，一般用于重大疫情的溯源和研究。
第九章 核酸等温扩增技术
品质量安全方面的第一部专门法律，该 法明确提出了转基因农产品标识制度， 对转基因农产品安全问题的重视可见一 斑。
• 早在 2001 年，我国就建立了转基因农产品 的标识制度。当年颁布的《农业转基因生 物安全管理条例》及其 2002 年的两部配套 规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》对 这一制度作出了较为详细的规定。此外， 同年颁布的《进出境转基因产品检验检疫 管理办法》和 2002 年颁布的《转基因食品 卫生管理办法》也对这一制度作出了规定。
• B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由 B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间 温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状 态。因此，DNA在此温度下合成是可能 的。利用4种特异引物依靠一种高活性链 置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成 在不停地自我循环。
中国的转基因标识政策
• 根据《农业转基因生物安全管理条例》 和《农业转基因生物标识管理办法》规定， 中国采用有标识目录的定性强制性标识制 度。2002年公布的标识目录包括5大类17种。 表示方法分3种，包括“转基因xx”、“含 有转基因xx”、“由转基因xx原料加工， 但已不含有转基因成分”。关于阴性标识， 未作相关规定。
• 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》 则规定了进出境转基因产品标识制度。
中国转基因标识现状及建议
现状：
我国的转基因标识制度目前还比较粗糙和单薄， 主要见于《农业转基因生物安全管理条例》及其 配套规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》 。另外 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》和《转 基因食品卫生管理办法》也对这一制度作出了规 定。这些法律规定仍有很多不足之处，不能适应 规制转基因生物安全的要求，也不能满足消费者 知情权的需要。
rpa等温扩增原理解析
rpa等温扩增原理解析RPA（等温扩增）原理解析1. 引言RPA（等温扩增）是一种基于循环介导核酸回路的核酸扩增技术，与PCR（聚合酶链式反应）相比具有许多优势。
本文将深入探讨RPA的原理、应用以及对该技术的观点和理解。
2. RPA原理RPA的目标是在等温条件下扩增特定的核酸序列。
其主要原理基于两个关键组分：寡核苷酸引物和核酸酶。
引物包括一个引导引物（primer）和两个酶拆分引物（probe），它们都与目标序列互补。
在反应开始时，引物与DNA模板的目标序列结合形成引物-模板复合物。
外源的核酸酶通过切割酶拆分引物的作用将其离解，并释放出一个能够启动下一轮循环的寡核苷酸。
这种循环迭代的过程可以产生大量的目标序列。
3. RPA优势和应用- 等温条件：RPA在等温条件下进行，无需复杂的温度循环设备，可以在简单的实验条件下进行。
- 灵敏度：由于循环介导核酸回路的特点，RPA对目标序列的敏感性较高，可以在极低的起始DNA模板浓度下有效扩增。
- 速度：与PCR相比，RPA具有更快的扩增速度，通常在15-60分钟内完成。
- 特异性：RPA可以通过引物设计实现高度特异性的扩增，避免了非特定性的产物形成。
- 简单性：RPA反应体系简单，操作方便，不需要复杂的实验步骤和设备。
RPA技术已广泛应用于许多领域，包括：- 分子诊断：RPA可以用于检测和诊断致病微生物的核酸标记，从而实现快速和准确的病原体检测。
- 食品安全：RPA可用于检测食品中的致病微生物或污染物，保障食品安全。
- 环境监测：RPA技术可用于检测环境中的微生物污染、环境污染物等，为环境监测提供快速准确的方法。
- 法医学：RPA可用于快速鉴定和识别DNA样本，为法医学病例提供科学依据。
4. 对RPA的观点和理解RPA作为等温核酸扩增技术的代表，具有许多优势，使其在分子生物学和临床诊断领域得到广泛应用。
RPA不仅具有灵敏度高、特异性强等优点，还具有操作简单、快速扩增等特点，使其成为一种理想的核酸扩增技术。
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。
该技术具有与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求等优点。
核酸等温扩增技术是一类技术的统称，包括但不限于LAMP、NASBA、RCA、SAT、IMSA、RPA、SPIA等多种具体方法。
请注意，核酸等温扩增技术虽然具有诸多优点，但也有其局限性，例如可能存在交叉污染的风险，影响检测的准确性。
因此，在使用该技术时，需要采取有效的措施来避免这些问题。
核酸等温扩增技术及其应用
核酸等温扩增技术及其应用一、引言核酸等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，其在生物医学研究、临床诊断和基因工程等领域具有重要应用价值。
本文将详细介绍核酸等温扩增技术的原理、方法和应用。
二、核酸等温扩增技术的原理核酸等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的核酸扩增方法，通过利用逆转录酶和DNA聚合酶的活性，实现核酸的扩增。
其基本原理是通过逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA链，然后利用DNA聚合酶在恒温条件下合成新的DNA链。
这种等温扩增方法不需要复杂的温度变化，且具有较高的特异性和敏感性。
三、核酸等温扩增技术的方法核酸等温扩增技术主要包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增法）和RPA（等温扩增法）。
RT-LAMP方法利用4-6个特异性的引物，在同一温度下通过逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用，在短时间内扩增目标核酸。
RPA方法则利用DNA聚合酶和DNA单链结合蛋白在等温条件下，通过引物结合、DNA解旋、DNA聚合等步骤，实现核酸的扩增。
四、核酸等温扩增技术的应用1. 医学诊断：核酸等温扩增技术在医学诊断中有广泛应用。
例如，可以通过核酸等温扩增技术检测病毒、细菌和真菌等病原体，快速确认感染病原体的种类和数量，为临床治疗提供依据。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等，为早期癌症和遗传病的筛查提供技术支持。
2. 食品安全检测：核酸等温扩增技术可以应用于食品安全检测领域。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测食品中的病原菌、转基因成分和食品中的传染性病毒等。
这种技术具有快速、灵敏和高效的特点，可以为食品安全监管提供重要依据。
3. 环境监测：核酸等温扩增技术在环境监测中也有广泛应用。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测水体、土壤和空气中的微生物，了解环境中的微生物多样性和污染程度。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于环境污染源的追踪和监测。
4. 生物工程：核酸等温扩增技术在生物工程领域也有重要应用。
在实验室检测核酸的方法
在实验室检测核酸的方法
实验室中常用的检测核酸的方法有以下几种：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的核酸检测技术，主要用于扩增目标DNA序列。
通过PCR可以在短时间内扩增出大量目标DNA，使其能够被进一步分析和检测。
2. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR结合了PCR和荧光探针技术，可以在PCR的同时进行定量检测。
通过检测PCR反应过程中荧光信号的强度，可以实时监测并定量目标核酸的数量。
3. 等温扩增：等温扩增是一种在常温或接近常温下进行的核酸扩增方法。
常用的等温扩增方法包括LAMP（循环介导等温扩增）和RPA（递归螺旋扩增）等。
等温扩增技术具有快速、敏感、简便等特点。
4. 测序技术：测序技术是一种用于确定核酸序列的方法。
常用的核酸测序技术包括Sanger测序和新一代测序技术（如Illumina测序、Ion Torrent测序等）。
这些技术可以通过对目标核酸序列进行测序，实现对其序列信息的分析和检测。
5. Northern blot：Northern blot是一种利用电泳分离和检测RNA的方法。
通过将RNA样品经过电泳分离后，利用亲和性探针进行靶向检测，可以确定目标RNA在样品中的存在和相对数量。
这些方法在实验室中广泛应用于核酸的检测和分析，并且可以根据具体需求进行选择和组合使用。
核酸提取及扩增技术简介(含等温扩增技术)-综述
核酸提取及扩增技术原理简介1核酸理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
2细胞破碎大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。
1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
2）化学试剂法：经一定的pH 环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。
而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液（TE、STE 等）提供。
在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA 等）螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。
3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
等温扩增仪使用指南说明书
等温扩增仪使用指南说明书一、产品概述等温扩增仪是一种用于核酸扩增的实验仪器，其原理是通过等温酶链反应（LAMP）技术，在恒温条件下，将目标DNA或RNA的片段合成成多个复制品。
本使用指南将详细介绍等温扩增仪的操作步骤及相关注意事项，以帮助用户顺利使用本产品。
二、安全注意事项1. 本产品仅限于科学研究用途，禁止用于任何其他用途。
2. 在操作过程中，请佩戴实验室必备的个人防护用品，如手套、实验服等。
3. 使用前请仔细阅读本使用指南，并按照指南的步骤进行操作。
4. 注意仔细核对试剂盒的过期日期，过期试剂禁止使用。
5. 操作结束后，及时清理工作区域并正确处置废弃物。
三、仪器准备1. 将等温扩增仪放置在稳定的水平台上，并确保其电源接线正确。
2. 打开仪器开关，待仪器显示正常后，进入仪器主界面。
3. 查看试剂盒中的试剂、储存条件等信息，并按照说明储存在适当的温度下。
4. 检查试剂盒是否完好，并确认无损坏及泄漏情况。
四、试剂准备1. 使用前请将试剂从低温保存条件中取出，放置于室温下静置片刻，确保其温度平衡。
2. 检查试剂瓶盖是否完整，如若有损坏请更换试剂。
3. 按照试剂盒说明书，将所需试剂按照要求配制，并充分摇匀。
4. 配制好的试剂请避免阳光直射，存放于适当的温度条件下。
五、样本准备1. 根据实验要求，选择适当的样本来源，如组织、液态样本等。
2. 样本收集前，请提前了解样品的特点、储存条件等信息。
3. 样本收集时，请佩戴手套，并使用无菌技术操作。
4. 样本收集后，请及时标注好样本信息，并存放于适当的温度下。
六、操作步骤1. 打开等温扩增仪软件，并选择适当的扩增模式。
2. 使用无菌技术，将待测样本加入扩增反应体系中。
3. 加入适量的酶链反应试剂，并充分混匀。
4. 将混匀后的反应体系分装至扩增管中，注意避免出现气泡。
5. 将扩增管放入等温扩增仪中，并调整合适的温度和时间参数。
6. 点击开始按钮，开始扩增反应，并等待反应结束。
核酸等温扩增
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RPA技术
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RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年 由剑桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
核酸等温扩增技术在病毒 检测中的应用
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1
核酸等温扩增技术
.
2
核酸等温扩增的优势
.
3
核酸等温扩增的种类
.
4
环介导核酸等温扩增技术（LAMP）
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5
LAMP引物设计原则
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LAMP扩增引物设计
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LAMP扩增过程
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Байду номын сангаас
9
环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特 异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。
SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境 中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据， 因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。
SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确 保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳 性、假阴性结果。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
详解核酸等温扩增技术
详解核酸等温扩增技术近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR 技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。
在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP )环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。
反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。
此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP，Fig1)依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can －gene 公司首次介绍。
它是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。
整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相，在AMV 逆转录酶的作用下，引物I 与模板RNA 退火后合成cDNA，形成RNA/DNA 杂合体，随即RNaseH 降解 RNA，引物Ⅱ与 cDNA 退火，合成第二条 DNA 互补链。
核酸等温扩增ppt课件
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
等温扩增原理
等温扩增原理
等温扩增（LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，它具有高度特异性和高效性，能够在恒温条件下迅速扩增目标DNA序列。
等温扩增原理基于DNA聚合酶、反转录酶和DNA结合蛋白等多种酶的协同作用，通过一系列复杂的核酸反应过程，实现对目标DNA的高效扩增。
首先，等温扩增的原理涉及到DNA聚合酶的作用。
DNA聚合酶在等温条件下能够在目标DNA的两个特定区域上合成DNA链，形成环状结构。
这种环状结构具有特殊的功能，能够通过反复的DNA合成过程，迅速扩增目标DNA序列。
其次，反转录酶在等温扩增中也扮演着重要的角色。
反转录酶能够将RNA模板转录成互补的DNA链，进而参与到DNA合成的过程中。
这种RNA-DNA混合链的形成，为目标DNA的扩增提供了必要的前提条件。
此外，DNA结合蛋白在等温扩增中也发挥着重要的作用。
DNA结合蛋白能够在DNA的特定区域上结合并稳定DNA的结构，促进DNA 聚合酶和反转录酶的活性，从而保证等温扩增反应的顺利进行。
综上所述，等温扩增原理是基于DNA聚合酶、反转录酶和DNA
结合蛋白等多种酶的协同作用，通过一系列复杂的核酸反应过程，
实现对目标DNA的高效扩增。
这种技术具有操作简单、扩增速度快、特异性高等优点，被广泛应用于医学诊断、食品安全检测、环境监
测等领域。
相信随着技术的不断进步，等温扩增技术将在更多领域
展现出其巨大的应用潜力。
等温扩增技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握等温扩增技术的原理和操作步骤。
2. 学习利用等温扩增技术对特定靶标进行扩增和检测。
3. 了解等温扩增技术在分子生物学研究中的应用。
二、实验原理等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）是一种在恒定温度下进行核酸扩增的技术。
与传统的PCR技术相比，等温扩增技术具有操作简便、快速、成本低、特异性高等优点。
其原理是利用特定设计的引物和聚合酶在恒定温度下进行核酸扩增，无需热循环，从而实现快速、高效、特异的核酸扩增。
三、实验材料1. 样本：含有靶标基因的DNA样本。
2. 引物：针对靶标基因设计的引物。
3. 聚合酶：等温扩增用聚合酶。
4. 反应体系：缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
5. 实验器材：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 引物设计：根据靶标基因的序列设计引物，确保引物特异性高、Tm值相近。
2. 反应体系配置：按照实验要求，配置反应体系，包括缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
3. 反应：将配置好的反应体系加入PCR管中，放入PCR仪进行等温扩增。
反应温度根据所使用的聚合酶和引物进行优化。
4. 扩增产物检测：将扩增产物进行电泳分析，观察扩增结果。
5. 结果分析：根据电泳结果，判断靶标基因是否存在，并进行定量分析。
五、实验结果与分析1. 扩增结果：根据电泳结果，观察到扩增产物条带，说明等温扩增成功。
2. 特异性分析：通过设置阴性对照和阳性对照，验证扩增结果的特异性。
3. 定量分析：通过比较扩增产物条带的亮度，对靶标基因进行定量分析。
六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是等温扩增技术成功的关键。
引物设计时应考虑引物长度、Tm值、GC含量等因素，以确保扩增结果的特异性。
2. 反应体系优化：反应体系中的各种成分比例对扩增结果有较大影响。
在实验过程中，应优化反应体系，以提高扩增效率和特异性。
3. 扩增温度优化：不同聚合酶对温度的敏感度不同，因此在实验过程中，需要根据所使用的聚合酶和引物优化扩增温度。
era等温扩增技术原理
era等温扩增技术原理
ERA等温扩增技术，全称为酶促重组等温扩增技术，通过模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，将来源于细菌、病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造突变并筛选其功能，再通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系。
在37-42℃恒温条件下，该技术可以将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍。
其反应原理如下：
1. 重组酶首先与上下游引物结合，寻找同源双链DNA，一旦定位发生链交换。
2. 同时SSB蛋白与亲本链绑定，阻止其与其脱离的模板链发生相互作用。
3. DNA聚合酶从上下游引物的3'端启动合成，形成两条双链DNA，如此循环重复扩增。
该技术广泛应用于公共卫生领域，针对致病微生物、动物源性成分和转基因农产品进行快速现场检测，以及农业生产领域，针对水产、畜牧养殖和宠物中各类病原，进行早期快速检测和诊断。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询相关学者。
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
•此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
核酸等温扩增技术在病毒 检测中的应用
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核酸等温扩增技术
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核酸等温扩增的优势
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核酸等温扩增的种类
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环介导核酸等温扩增技术 （LAMP）
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LAMP引物设计原则
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LAMP扩增引物设计
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LAMP扩增过程
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环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在 产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆 等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
• NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用是对 RNA 病毒的检测。
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RCA的扩增原理
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SAT技术
• 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）是将新一代的核酸恒 温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检 测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应 稳定等优点。
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
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SAT技术的优势
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（ RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该 DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个 RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带 有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。 该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循 环情况。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
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引物、探针设计
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RPA技术的缺点
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等进 行核酸检测。
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IMSA扩增
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IMSA扩增的原理
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IMSA扩增的原理
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IMSA扩增的优点
• IMSA 不仅拥有 LAMP 检测技术类似的应用优点， 在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点， 使得其具备比 LAMP 更高检测灵敏度的潜力。
• 针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的 扩增和检测，有效防止假阴性结果。
• • SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易
降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利 于用药之后疗效的监测和判愈。 • • SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确保检 测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性 结果。
• 整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个小时的 扩增可将模板 RNA放大至 109~1010倍。
• 灵敏度高、特异性强、保真度高。
• 反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高、须重 复加入逆转录酶和 T7 RNA 聚合酶。
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滚环放大(rolling circle amplification, RCA)技术
• 基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同 温滚动复制的原理。
• 基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温 核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型 探针互补的重复序列。
• RCA反应体系组成： 噬菌体 φ29DNA 聚合酶、单链环状 DNA 模板和引物（一 条或一对也可多条）。 噬菌体 φ29 DNA 聚合酶具备很强的链置换活性，无需模 板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成 DNA。
• 该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在我国 的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防 控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。
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RPA技术
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RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年由剑 桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。