环介导等温扩增技术简介
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
lamp环介导等温扩增原理
lamp环介导等温扩增原理
LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的等温扩增技术，它可以在恒定温度下快速扩增DNA序列，因此被广泛应用于分子生物学和医学领域。
LAMP技术的原理如下：
1.引物设计
LAMP技术需要设计4-6个特异性引物，其中包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）和一个环形引物（loop primer）。
这些引物的设计基于目标DNA序列的特异性，以及引物之间的相互作用，以确保扩增的特异性和高效性。
2.等温扩增
LAMP技术的扩增过程是在恒定温度下进行的，一般为60-65℃。
引物结合到目标DNA序列上后，FIP和BIP引物通过自身的反向和正向扩增，形成一个DNA 环，这个环可以作为模板，引导F3和B3引物的扩增。
同时，环形引物也可以加速扩增速度和提高扩增效率。
3.产物检测
LAMP技术的产物是大量的DNA片段，可以通过凝胶电泳或实时荧光检测来进行检测。
实时荧光检测可以在扩增过程中实时监测DNA量的增加，从而确定扩增的特异性和灵敏度。
总之，LAMP技术是一种快速、特异性和高效的等温扩增技术，可以广泛应用于分子生物学和医学领域，例如病原体检测、基因突变分析和DNA测序等。
环介导等温扩增技术
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
环介导等温扩增技术简介
环介导等温扩增反应的检测
应用浊度检测
﹣+
阴性
阳性
扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩 增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物 ，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。
dNTPs DNA Polymerase P2O74- +2Mg2+
DNA-(dNMP)n+nP2O7 MgP2O7(白色沉淀)
环介导等温扩增法所需的试剂
DNA扩增
RNA扩增
模板DNA 引物
FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶
dNTPs 反应缓冲液
模板DNA
引物 FIP F3 BIP B3
链置换型DNA聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液
PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。
。
4. B3 Primer: B3引物含有与目标DNA上的B3序列相同的区段。
环介导等温扩增引物如何设计？
关于各引物的设计，需要专门的支持软件：Primer Explorer。设计 中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。
引物设计要点
F2、B2、F3、B3的3’末端应极力避免AT碱基连续或过多。 扩增领域为F2~B2区段间，引物应该在200bp以内。 包含F2/B2在内的环状部分的长度在40~60bp范围内。 各区段的Tm值应该在60~65℃之间。 若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。 引物应避免二次结构发生。 各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。
环介导等温扩增有哪些优点？
优点
不需要使双链DNA先变性成单链，省时。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。 不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本 低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不 一的片段，检测方法简单。
环介导的核酸恒温扩增技术概述
般以 ２ ０～ ０ ｂ ０ ３ ０ ｐ为宜 。一般的实验流程包 括 ： Ｇ ｎ 在 ｅ— Ｂｎ ａ ｋ中检索 目的基 因片段（ 并通过 Ｂ Ｓ Ａ Ｌ Ｔ确定该 片段
与其 他物 种基因的 同源性 ） 人 工或在 线设计 引 物组 、 、 引物合 成 、 定 反应 体系 、 确 在具有 链置换 活 性 的 Ｄ Ａ Ｎ 聚合 酶（ 若进 行逆转 录 Ｌ Ｍ Ａ Ｐ扩增 ， 仅需要 在 Ｄ Ａ扩 Ｎ 增 的试剂 中 ， 加入逆转 录酶） 用下恒 温扩增 和反应 再 作 结果判定 等【 。
核酸扩增 是一种重 要 的分 子生物 学研究 方法 ， 其 应用涉及到生命科 学 的各个 领域 ， 传染 性疾 病 的定 如 性与定量检测 、 品微 生物检 测、 因诊 断、 床 医学 食 基 临 等 。近年来 ， 随着分子生物学技术的迅速 发展 ， 科学 家
开发 出多种核酸扩增的方法 ， 自序列复制 （ｅ —Ｓ８ 如 ｓｒ Ｕ－ ｆ
２ ＬＭ Ａ Ｐ技术 的 引物设 计与 反应 液 中各成 分 的终 浓
度
ｔｎ ｄｓ ｕｎｅｒ ｌ ａｏ ， Ｓ ， ａ ｅ ｑ ｅｃ ｐｉ ｔ ｎ ３ Ｒ） 依赖核酸序列 的扩增 ｉ ｅ ｅ ｃｉ
（ ｕ ｌｃａｉ ｓｑ ｅｃ ａｅ ｍ ｌｉ ｔ ｎ Ｎ Ｓ Ａ） 以 ｎｃ ｉ ｃ ｅｕｎｅｂｓｄａ ｐ ｆ ａｏ ， Ａ Ｂ ， ｅ ｄ ｉｃ ｉ
生物 学教 学 ２１年（ ６ 第５ ０１ 第３卷） 期
・
５・
环 介 导 的核 酸 恒 温 扩 增 技 术 概 述
高 芳 曹 明富 （ 江 杭 师 大 生 与 境 学 院 ３０ ） 浙 省 州 范 学 命 环 科 学 １３ ０６
摘 要 环介导的恒温扩增技术是一种新的核酸扩增技术。本文介绍 了该技 术的原 理、 引物设计要点、 反应体 系的配 制和产物 的 检测 以及 当前该技术在生命科学各领域的应用。 关键词 核酸扩增 环介导的恒温扩增技术 ＬＭ Ａ Ｐ
环介导等温扩增技术
简单，快速，准确的基因扩增法
四、问题分析
1.随机采取鸽子翅或尾部羽髓样，用试剂盒提取DNA
01
2.在家鸽在W染色体上找到保守基因并以LAMP引物设计
02
软件设计引物
3.进行应用LAMP法扩增目的基因、不断优化dNTPs、
03
Mg2+、甜菜碱浓度，反应体系温度，反应结果由紫红色
变为天蓝色为雌性，否则为雄性
80℃水浴，5min，结束反应，加指示剂
LAMP反应体系
三、应用
1、LAMP在食品安全中的应用：
水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用；环介导等温扩增 技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分等
2、LAMP在动植物疫病检测中的应用：
环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究；
感谢各位观看
Thank You
3、LAMP在人类疾病检测中的应用：
环介导等温扩增技术在新型冠状病毒检测中的应用研究进展；环介导等温扩增技术（LAMP） 在肺结核诊断中的应用研究
四、问题分析
生产上的鸽子性别 鉴定主要通过PCR 和翻肛鉴别，不太 适用于养殖户
鉴别方法比较
LAMP法
PCR法
翻肛鉴别
温度 时间 产物量 特异性 检测
试剂
二、原理
设计四条引物，包括两条内引 物和两条外引物，利用DNA链在 60-65℃的恒温条件下处于解链 和退火的动态平衡状态，在DNA 聚合酶的驱动下结合靶序列启 动DNA合成，反应中生成LAMP反 应特有的焦磷酸镁白色沉淀， 运用HNB指示剂显色反应。
二、流程
制作LAMP反应体系，12.5uL，如右图 放入200uL PCR管中，离心混匀 64℃水浴，90min
环介导等温扩增技术在禽病毒病检测中的应用
名单 。根据血凝素 （ Ｈ Ａ） 的抗原差异可将 Ａ Ｉ Ｖ分为 １ ６个 ＨＡ亚 型 。Ａ Ｉ Ｖ 已在 世界 范 围 内多次 大 规 模 流
行， 给养禽 业 造成 了 巨大损 失 。当前 影 响我 国养 禽 业
的高致病性禽流感病毒 主要为 Ｈ ５ 亚型 ，侯佳蕾等【 １ ］ 根据 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 中的 Ｈ ５ 一 Ａ Ｉ Ｖ Ｈ Ａ基因保守区域 ， 设计
［ ２ ］ 彭宜 ， 谢芝勋 ， 郭捷 ， 等． 利用 Ｒ Ｔ — Ａ ＭＰ可视化检测技术检测 Ｈ１亚 Ｌ 型禽流感病毒及 Ｎ１ 、 Ｎ ２ 亚型的分型啪． 病毒学报 ， ２ ０ １ ３ ， ２ （ ３ ） ： １ ５ ４ — １ ６ １ ．
了１ 套 内、 外引物 ， 对 Ｈ ５ 一 Ａ Ｉ Ｖ 、 Ｈ ７ 一 Ａ Ｉ Ｖ 、 Ｈ ９ 一 Ａ Ｉ Ｖ的 总Ｒ Ｎ Ａ进 行 检测 ，除 Ｈ５ 一 Ａ Ｉ Ｖ外其他 相应 的泳 道 中
没有 特异 的 电泳 条带 出现 ， 证 明特异性 良好 。最 小检
测限为核糖核酸量约为 ０ ． １ 皮克。 与Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ方法相 比， 灵敏度更高。当前 ， 我 国正面临防控高效病情禽 流感的挑战 ，若能做到对病原的快速检测 、快速诊
眄 研 究 与 综 述
环介导等温扩增技术在禽病毒病检测 中的应用
徐 宁 （ 辽宁省重大动物疫病应急中心 沈阳 １ １ ０ １ ６ １ ）
环介导等温扩增技术 （ Ｌ Ａ Ｍ Ｐ ） ， 是２ ０ ０ ０ 年由日 本的荣研株式会 的 Ｎ ｏ ｔ ｏ ｍ ｉ Ｔ等人开发 出来的一种新
Ｈ ３ Ｎ ２ 、 Ｈ ５ Ｎ １ 、 Ｈ ９ Ｎ ２ 亚型 ） 、鸡传染性喉气管炎病毒 Ｍ ４ １ 毒株以及鸡传染性支气管炎分离株进行扩增 ， 仅在 Ｎ Ｄ Ｖ Ｆ ４ ８ Ｅ ９的泳道 中有特异性的 电泳条带 出 现， 空白对照及其他的病毒毒株泳道均无条带 ， 说明 该方法对 Ｎ ＤＶ具 有 良好 的特 异性 。该 方 法 可 较 快 速、 准确地检测出 Ｎ Ｄ Ｖ， 对临床样品的检测也达到较 高的准确性 ，可作为一种新 的 Ｎ Ｄ Ｖ检测方法使用。 其最低检测限约为 １ ０ ０ 皮克。近年来 ， 我 国鸭群感染 新城疫病毒 的病例在江苏 、 浙 江、 河北 、 山东等地 日 益增多，不 同 日 龄 的鸭均可感染 ，但 以雏鸭最为易 感 ，半月龄 内雏鸭的发病率和死亡率最高 ，均可达 １ ０ ０ ％， 给养鸭业带来了巨大 的经济损失。
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
lamp技术综述
LAMP简介环介导等温扩增法(1oop—mediated isothermal amplification，LAMP)，是由日本的荣研株式会社的Notomi日等人2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。
因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP原理利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。
FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对，启动循环链置换反应。
F3引物与模板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA 互补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。
与此同时，BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着，B3引物在BIP外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。
被置换的单链DNA两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的DNA结构。
LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的DNA，在恒温条件65℃左右进行扩增，在45～60min的时间里扩增可达到109～1010数量级。
LAMP优缺点LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
环介导等温扩增技术及其应用
Ｐｒ ｏ Байду номын сангаасｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
环 介 导 等 温 扩增 技 术 及 其 应 用
肖 璐 ， 邬 旭 龙 ， 王 印 ＇ ， 杨 泽 晓 ， 姚 学萍 。
ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ， Ｆ Ｉ Ｐ）和 外 引 物 （ ｂ ａ ｃ ｋ ｗａ ｒ ｄ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ，
软件 在 线 设 计 引 物 ， 引 物分 内引物 （ ｆ ｏ ｒ ｗａ ｒ ｄ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ 结构和花椰菜样呈大小不一结构的 Ｄ ＮＡ 混 合
脂糖 凝 胶 电 泳 菌 均 显 示 ， Ｌ ＡＭＰ检 测 具 有 高 特 异
性， 仅 志 贺菌 和入侵 性肠 道杆 菌呈 现 阳性 ， 而其 他 肠 道菌 未 查 见 阳性 反 应 。 Ｌ ＡＭＰ的灵 敏 度 明 显 高 于
是在 反应 管 中加 入 Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ染 料 ， 通 过 颜 色 的变 化进 行判 定 ， Ｌ ＡＭＰ阳性 反 应 管 在 紫外 照射 的
菌进 行 分离 培养 ， 直接 取 疑 似 患 病 动 物 病 变 组 织 进
行基 因扩增 ， 免 去 了常规 Ｐ Ｃ Ｒ检测 繁 琐 的核 酸提 取
而 提高 反应 的效率 。但 内引物浓 度太 高 是 否会 抑 制
扩 增反应 ， 目前 尚不 清楚 ， 仍 需 进 一 步 的探 究 ， 以设 计最 适 引物 浓 度 以确 保 反 应 快 速 高 效 进 行 。另 外 ， Ｂ ｓ ｔ 聚合 酶促 进 整个 Ｌ ＡＭＰ反应 ， 其 浓 度 也 可 影 响
环介导等温扩增技术
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别
形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)
作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序
列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些
具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的
折叠结构的DNA 的混合物。
精品PPT
LAMP法实验室常规操作步骤
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
• 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
精品PPT
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应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
精品PPT
原理
扩增启动阶段 循环扩增阶段
延伸循环阶段
精品PPT
精品PPT
扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
环介导等温扩增技术
精品PPT
主要内容
• 定义 • 原理 • 操作步骤 • 优缺点及
精品PPT
定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。
精品
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；
LAMP技术原理和引物设计
LAMP技术原理和引物设计LAMP技术（Loop-mediated isothermal amplification），中文称为环介导等温扩增技术，是一种于2000年由Eiken Chemical Co. Ltd.日本公司开发的基于异十四链聚合酶反应（Bst聚合酶）的异源DNA快速扩增技术。
LAMP技术通过引物设计和反应条件的优化，实现在等温条件下对目标DNA的高效扩增。
下面将分别介绍LAMP技术的原理和引物设计。
LAMP技术的核心原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进行DNA的扩增。
它利用一种特殊的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能够在不需要高温退火的情况下，具有高度特异性和高效率地进行DNA合成。
LAMP技术本身具有极高的扩增速度，优势在于其在等温下，不需要复杂的设备和严格的实验条件，可以简化扩增过程。
同时采用特殊设计的引物组合，能够提高扩增特异性。
1.初始化反应：将反应体系中的DNA片段与引物（包括2个外端引物和2个补体引物）结合；2. 引物扩增：引物与Bst聚合酶作用，反应体系中的DNA得到扩增；3.聚合物合成：一种特殊的引物结合到目标DNA的5'末端，通过内端引物和内部位点进行扩增；4.循环放大：扩增产物作为新的模板参与反应，进行连续循环扩增。
通过这种等温扩增的方法，LAMP技术可以在短时间内获得大量的目标DNA，且具有很高的扩增特异性和灵敏度，可以用于分子生物学、诊断医学和病原检测等领域。
引物设计：引物设计是LAMP技术成功应用的重要因素之一、LAMP技术使用了4个单链引物，包括2个外端引物（forward outer primer，F3和reverse outer primer，B3）和2个内端引物（forward inner primer，FIP和reverse inner primer，BIP）。
外端引物负责扩增DNA的初始段，内端引物负责扩增DNA的中间段。
在引物设计中，需要注意以下几个方面：1.引物的特异性：要求引物能够有高度特异地结合到目标DNA的区域，确保扩增的目标是准确的；2.引物的长度和碱基组成：引物的长度通常为20-24个碱基，碱基组成要尽量避免重复序列和形成组内结构，以保证扩增效率和特异性；3.引物的位置和方向：合理选择引物的位置和方向，以确保扩增产物的特异性和有效性；4.引物的浓度：引物的浓度需要进行优化，以获得最佳的扩增效果。
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
1
原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
3
优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
环介导的等温扩增法
• (1)需要昂贵的PCR仪； • (2)多因素影响扩增效果；
• (3)常引起非特异性扩增；
• (4)扩增反应时间长，一般需要几个小时，难以在基层推广应用等诸 多的缺陷，急需更新的方法来替代。
•
近年来随着分子生物学技术的发展，新的核酸扩增技
术也不断涌现。根据是否需要温度循环也可分为两类：一
类是非等温扩增体系，如聚合酶链式反应(PCR)、 连接酶 链式反应(LCR)等。另一类是等温扩增体系，如赖解旋酶 恒温基因扩增(HDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、滚环扩增 (RCA)、环介导的等温扩增（LAMP）等系统，核酸恒温扩
• （2）指数RCA
• 指数RCA与线性RCA相似，它采用了第二种引物。该引物序列与环 状DN并在聚合酶的作用
• 下延伸，其产物又作为 • 第一种探针的模板，这
• 样一来产物呈指数递增。
• 指数 RCA也可用于非环 • 状 DNA的扩增。
• 3、Loop-prime
•
Loop primers hybridize to the stem-loops, except for the loops that are hybridized by the inner primers, and prime strand displacement DNA synthesis. RESULT:signal increase was detected at 14 min and 44 min with and without the loop primers, respectively
(2)，byproduct.
• 2、Detection
(3), SYBR GreenⅠ
(4), Real-time PCR
环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒
环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒【摘要】环介导等温扩增技术是一种高效、快速的核酸扩增技术，能够在恒温条件下进行。
本文将介绍如何利用环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒，首先对环介导等温扩增技术进行简要介绍，然后详细描述小苍兰花叶病毒的特点，并探讨环介导等温扩增技术在叶病毒检测中的应用。
接着将介绍实验方法，以及环介导等温扩增技术在叶病毒检测中的优势。
最后讨论小苍兰花叶病毒检测的可靠性以及未来的发展方向。
通过本文的介绍，读者能够更深入了解环介导等温扩增技术在小苍兰花叶病毒检测中的作用，并对其未来发展方向有所启示。
【关键词】环介导等温扩增技术、叶病毒检测、小苍兰花叶病毒、特点、应用、实验方法、优势、可靠性、发展方向1. 引言1.1 环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增技术，具有不需要设备、操作简单、快速高效、价格低廉等优点。
该技术通过特定的环介导引物在等温条件下进行核酸扩增，能够快速而准确地检测出目标病毒的存在。
在小苍兰花叶病毒的检测中，环介导等温扩增技术可以有效地提高检测的灵敏度和准确性，为病害的早期预警和控制提供了有力的工具。
本文将重点介绍环介导等温扩增技术在小苍兰花叶病毒检测中的应用，并探讨该技术在植物病毒检测领域的前景和发展方向。
通过对环介导等温扩增技术的介绍和小苍兰花叶病毒特点的分析，我们可以更好地理解该技术在病毒检测中的作用和意义。
2. 正文2.1 引言在我们将探讨如何利用环介导等温扩增技术来检测小苍兰花叶病毒。
小苍兰花叶病毒是一种常见的植物病毒，会导致苍兰花叶片出现病变，严重影响植物生长和产量。
及时准确地检测该病毒对保护作物的健康至关重要。
通过这些内容的讨论，我们旨在阐明环介导等温扩增技术在小苍兰花叶病毒检测中的重要性和可行性，为植物病害的早期预防和控制提供有力支持。
2.2 环介导等温扩增技术简介环介导等温扩增技术是一种新兴的分子生物学方法，其主要特点是在恒温条件下进行核酸扩增。
环介导等温扩增引物设计
环介导等温扩增引物设计环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种常用的核酸扩增技术，其最大的优势是可以不受限地在恒定温度下进行反应。
为了实现快速、准确、可靠的DNA扩增，合理的引物设计是至关重要的。
下面就环介导等温扩增引物的设计进行详细介绍：一、引物长度引物长度对扩增效率和特异性有很大影响。
通常建议引物长度在18-24bp之间，太短的引物会导致扩增效率低下，太长的引物则容易出现多个峰或非特异性扩增。
因此，在长度的选择上需要平衡扩增效率和特异性，一般来说，20bp左右的引物是比较适合的选择。
二、引物序列选择引物序列选择需要保证具有较低的自身互补性和互补性。
通常情况下，引物中应避免出现多个重复序列，避免引物间形成二级结构或者嵌套回路，可以通过NCBI的Primer BLAST或DNAMAN等软件进行序列比对，评估引物设计的准确性。
三、环结构设计与PCR引物不同，LAMP引物一般会在5’端和3’端添加的特殊序列（FIP和BIP）和环的序列。
它们是设计LAMP的关键部分，必须确保它们的特异性和互补性。
FIP和BIP序列需要匹配到目标序列上，而F1c和B1c环序列主要用于在反应过程中拉开靶DNA，为DST和DHT提供起始端。
四、引物浓度引物浓度对LAMP反应影响也很大，它的作用是影响LAMP反应的灵敏度和特异性。
在引物浓度过高时，会出现非特异性扩增和产生大量的非特异性产物；而在引物浓度过低时，则可能影响LAMP反应的灵敏度。
因此，在引物浓度的选择上也需要进行优化。
综上所述，环介导等温扩增引物设计是一项较为关键的技术，涉及到引物长度、序列选择、环结构设计和引物浓度等方面。
在实际操作中，需要根据样品特点和实验要求来进行引物设计。
同时，还需要结合实验优化引物浓度以及其他实验条件，以获得高灵敏度和高特异性的扩增结果。
实时荧光等温扩增技术
60℃2小时 (LA-200) 40cycles
条件同上
阳性对照组（含有待测基因的拷贝数已知的质粒）
临床样本
浊度 亮度
阳性样本
阴性样本
含待测基因的 质粒阳性对照
应用
LAMP 法已经被广泛应用于动物胚胎性别 鉴定，人、动物和植物致病微生物以及寄生 虫的检测，转基因食品，疾病基因诊断，环 境监测食品卫生检疫及基因芯片的开发。
RT-LAMP不会受到提取RNA过程中的污染 物的限制，该文献提示现行的核酸提取方法 过于复杂，需要开发更简单的程序。
疟原虫的检测
在该文献中，研究者直接将50uL的血液在99℃加热十 分钟，然后吸取2uL上清液直接做LAMP 。为了验证这种 方法，研究者又提取这些样本的DNA，并进行了PCR。
PCR(DNA提 LAMP（裂 sensitivity
环介导等温扩增技术(LAMP)
学生： 罗乐 指导老师：聂凯老师
2000年，日本学者Notomi 等发明了一种全新的 核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal ampபைடு நூலகம்ification ，LAMP)。该法能在等温条 件下高特异，高灵敏的扩增DNA。其特点是针对靶 基因的六个区域设计4种特异性引物，利用一种链 置换DNA聚合酶在等温条件（65℃左右）保温一小 时，即可完成核酸扩增反应。
RNA模板：只需在里面加入逆转录酶即可反应。
RT-LAMP扩增FMDV结果的检测方法
LAMP能扩增1-10个拷贝的起始模板浓度 ；RT-LAMP的灵敏度比end-point RT-PCR高10 倍，比常规RT-PCR高10-100倍。从反应速度来 看，RT-LAMP胜过于TaqMan-RT-PCR,而且利用 将96孔板放在实时热循环仪上操作，可以实 现样本的高通量检测。
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环介导等温扩增反应的操作过程（标准法）
环介导等温扩增法的操作步.5h
等温扩增 检测
1、试剂配制 2、DNA/RNA提取 3、环介导等温扩增反应（扩增） 4、检测
约1.5h
环介导等温扩增反应的检测
琼脂糖凝胶电泳检测
DNA扩增实例
NTC
PS：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。
环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设 计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度 下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合 成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65℃），经一个步骤 即可完成。其扩增效率极高，可在15~60min内实现109~1010 倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的 有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。
环介导等温扩增反应的检测
荧光目视试剂检测
钙黄绿素 Mn2+
DNA聚合酶 扩增反应
dNTPs Mg2+
钙黄绿素
Mn2+ P2O74-
﹣+
焦磷酸锰（白色沉淀）
钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增 反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解 除，发出黄绿色荧光。
环介导等温扩增反应的检测
B1c B2c B3c 3’ B3 Primer B3 3’ 5’
1. FIP: FIP引物在3’末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相同序列的区段。 2. F3 Primer: F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。 3. BIP: BIP引物在3’末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段
环介导等温扩增法所需的试剂
DNA扩增
RNA扩增
模板DNA 引物
FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶
dNTPs 反应缓冲液
模板DNA
引物 FIP F3 BIP B3
链置换型DNA聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液
PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。
。
4. B3 Primer: B3引物含有与目标DNA上的B3序列相同的区段。
环介导等温扩增引物如何设计？
关于各引物的设计，需要专门的支持软件：Primer Explorer。设计 中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。
引物设计要点
F2、B2、F3、B3的3’末端应极力避免AT碱基连续或过多。 扩增领域为F2~B2区段间，引物应该在200bp以内。 包含F2/B2在内的环状部分的长度在40~60bp范围内。 各区段的Tm值应该在60~65℃之间。 若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。 引物应避免二次结构发生。 各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。
环介导等温扩增反应的检测
应用浊度检测
﹣+
阴性
阳性
扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩 增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物 ，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。
dNTPs DNA Polymerase P2O74- +2Mg2+
DNA-(dNMP)n+nP2O7 MgP2O7(白色沉淀)
应用浊度的实时检测
如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁） 的浊度进行测定。
LAMP与普通PCR的比较
缺点
灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程
中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。
引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增 方法。
环介导等温扩增有哪些优点？
优点
不需要使双链DNA先变性成单链，省时。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。 不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本 低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不 一的片段，检测方法简单。
Principle of Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增法为已知基因的检测提供“简便、快速、 准确、廉价”的基因检测方法
什么是环介导等温扩增？
环介导等温扩增
环介导等温扩增是“Loop-Mediated Isothermal Amplifi -cation”的简称，是一种“简单、快速、准确、廉价”的基因扩 增方法。
环介导等温扩增引物如何设计？
引物的设计
首先在靶基因的3’末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5’末端 设定B1、B2、B3三个区段，针对这6个区段可以设计4个引物。
FIP
F1c
5’
F2
3’
BIP
B2
3’
B1c
5’
3’ F3c F2c F1c Target DNA B1 B2 B3 5’
5’ F3 F2 F1 F3 Primer F3 5’ 3’
具体引物设计信息请参照网页：http://primerexplorer.jp/e/
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系