叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射 光 光。
定性实验 无需移液管量 皂化反应(约1ml)
加KOH数片剧烈摇均， 加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 吸收 下层呈 吸收 色，为 光。 色,为 光。 ， ,
取代反应（约1mL）
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析：
称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份 0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心 5min, 上清液在 649 ， 652 ， 665 测定 OD ，计算 Chla,Chlb 和Chl总量的值。
5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红
光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量 叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 400 500 Waverlength(nm) 600 700
a
b
• 实验步骤 1．定性分析：
加醋酸约1ml，变褐 为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变 色，为 叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝ຫໍສະໝຸດ 素的吸收光谱测定：皂化反应的上层 黄色石油醚溶液 弃上层，反复用石油醚萃取,直 到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1） （稀释，665nm OD 0.5-1）
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 • Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A6521000/34.5
叶绿素提取实验
实验二、叶绿体色素的提取、分离与性质分析一、实验目的•掌握叶绿体色素的提取方法；掌握板层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理（一）叶绿体色素：1.叶绿素叶绿素a：叶绿素b=3：12.类胡萝卜素胡萝卜素：叶黄素=2：1叶绿素：类胡萝卜素=3：1（二）叶绿素的光学性质叶绿素a在663nm有吸收峰；叶绿素b 在645nm有吸收峰。
但在蓝光区也有一个吸收峰。
胡萝卜素和叶黄素的吸收峰是在蓝光区（440nm）。
三、叶绿素含量测定：1．取新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉）混匀。
2．称取剪碎的新鲜样品1.0g ，放入研钵中，加少量石英砂及2－3ml （或80％丙酮）研成匀浆，继续研磨至组织变白，静置3－5分。
3．取滤纸1张，置漏斗中，用80％丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒人漏斗中，过滤到25ml。
4．用滴管吸取80％丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用80％丙酮定容至25ml，摇匀。
5．把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。
以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。
6 计算：按下列公式：Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663C总(mg/L) = Ca+ Cb分别计算叶绿素a、b的浓度。
四、光合色素鉴定（板层析）•支持物：硅胶层析板•流动相：石油醚：丙酮：（v：v=65：35）•步骤：1、取板划线2、点样3、配展开剂4、展开5、前沿到达2/3处时停止，取出凉干并观察各色素带计算Rf值叶绿素a：蓝绿色；叶绿素b：黄绿色；胡萝卜素：桔黄色叶黄素：黄色六：叶绿素前驱物的荧光观察七、作业1、计算你的实验中植物叶片中叶绿素的含量。
２．研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？３．画图说明叶绿体色素板层析结果，并解释原因。
实验四叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定
实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。
实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。
（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。
测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。
其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。
叶绿体色素的提取分离和理化性质
叶绿体色素的提取分离和理化性质主讲：张海森博士一、实验目的因此，测定叶绿体色素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在实际生产中也有着广泛的应用。
1、学习叶绿体色素的提取方法。
2、了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主要理化性质。
绿色植物的光合作用是离不开叶绿体色素的，了解叶绿体色素的组成和性质对于理解光合作用的本质很有帮助。
叶绿体色素分为叶绿素和类胡萝卜素两类。
它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，成为色素蛋白复合体，不溶于水，溶于有机溶剂，因此，可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
二、叶绿体色素的提取原理三、实验材料：菠菜叶片五、叶绿体色素的理化性质1.光对叶绿素的破坏作用叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当色素分子与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
水提取液暗光乙醇提取液暗光1) 取四支小试管，分别加入两种提取液2ml，稀释2-3倍；2) 各取两只试管放于暗处; 另两只试管置于强光下，进行光破坏；3) 30min后，对比观察光破坏的结果。
光对叶绿素破坏的操作步骤：2.提取液中各成分分离：用色层分析的原理加以分离因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在流动相和固定相之间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿体色素的结构决定了它们极性的不同，因而在滤纸上的迁移速率不同。
叶绿体色素叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b叶黄素胡萝卜素问题：请根据这四种色素分子的结构比较它们极性的大小。
步骤：（1）取圆形滤纸1张，用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔。
（滤纸直径为11cm）（2）另取一张长方形滤纸条（5cm×1.5cm），沿纸条长边方向涂抹色素，风干后，重复涂抹数次。
十次涂抹之后，沿长边方向卷成纸捻。
（3）纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使之与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。
（4）将康维皿置于培养皿内，向康维皿中央小室加入推动剂。
实验三叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定.ppt
×100%
样品重量（mg）×1000
▪ 稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1
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实验报告
▪ 1.试述叶绿体色素的吸收光谱特点及生理意 义。
▪ 2.在皂化反应中加入乙醚有什么作用？
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理化性质测定
▪ 将上一个实验中提取的 叶绿体色素溶液适当稀 释后，进行以下实验：
▪ 1.荧光现象的观察。 ▪ 取l支试管加入浓的叶
绿体色素提取液，在直 射光下观察溶液的透射 光与反射光颜色有何不 同，可观察到反射出暗 红色的荧光。
▪ 2.氢和铜对叶绿素分子中镁 的取代作用
▪ 方法一；取两支试管。第 一支试管加叶绿体色素提取 液2mL，作为对照。第二支 试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇 匀，观察溶液颜色变化。当 溶液变竭后，再加入少量醋 酸铜粉末，微微加热，观察 记录溶液颜色变化情况，并 与对照试管相比较。解释其 颜色变化原因。
▪ 叶绿素中的镁可以被氢 离子所取代而成褐色的 去镁叶绿素。去镁叶绿 素遇铜则成为铜代叶绿 素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏，故常 用此法制作绿色多汁植 物的浸渍标本。
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实验步骤(1)
▪ 根据朗伯一比尔定律，某有 ▪ 今欲测定叶绿体色素混合
色溶液的吸光度D与其中溶 液浓度C和液层厚度L成正 比，即：
的水分）和流动相（有 的盐，产生的盐能溶
机推动剂）间具有不同 的分配系数，所以移动 速度不同，经过一定时 2021间/3/4后，可将各种色素分 开。
于水中，可用此法将 叶绿素与类胡萝卜素 分开。
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实验原理
▪ 叶绿素与类胡萝卜素都具有 光学活性，表现出一定的吸 收光谱，可用分光光度计精 确测定。叶绿素吸收光量子 而转变成激发态，激发态的 叶绿素分子很不稳定，当它 变回到基态时可发射出红光 量子，因而产生荧光。叶绿 素的化学性质很不稳定，容 易受强光的破坏，特别是当 叶绿素与蛋白质分离以后， 破坏更快，而类胡萝卜素则 较稳定。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。
研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。
本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。
材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。
方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。
2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。
3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。
4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。
5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。
6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。
7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。
加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。
加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。
通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。
叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。
这种反应也证实了叶绿体的存在。
叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。
叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。
乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。
这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定1 实验目的（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；（2）验证叶绿体素的理化性质。
2 实验原理2.1 叶绿素的提取叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。
2.2 叶绿素的分离薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
2.3 叶绿素理化性质测定叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。
2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
叶绿体色素实验
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定实验一、叶绿体色素的提取、分离1.实验名称叶绿体色素的提取、分离实验2.实验原理叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。
本实验采用酒精提取。
层析法原理： K=Cs/Cm。
3.实验试剂与材料新鲜菠菜叶体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1）天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸4.实验步骤1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，待干后再次划线，重复3,4次。
在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。
改好缸盖。
待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
5.实验结果与分析滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是：橙黄色胡萝卜素（最快）黄色叶黄素蓝绿色叶绿素a（最多）黄绿色叶绿素b（最慢）二.理化性质1.实验目的验证叶绿素的理化性质。
2.实验原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
叶绿素实验方案
叶绿体色素的提取、分离、理化性质鉴定及含量测定朱玉娟 10121910227摘要：叶绿素是植物最主要的一种光合色素，分为叶绿素a 、b 两种，存在于高等植物的叶绿体中。
本实验首先利用有机溶剂抽提的方法提取色素，然后制备铜代叶绿素，并观察色素提取液、铜代叶绿素、皂化叶绿素甲醇溶液的吸收光谱，并且对黄色素与绿色素进行分离。
最后用分光光度法测定叶绿素a 、b 的含量。
实验材料：自选植物新鲜叶片实验器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1ml ）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯等实验试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸铜、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等实验方法:1. 色素的提取通过研磨让细胞裂解，用有机溶剂丙酮抽提色素2．叶绿素的理化性质分析2.1 铜代反应制取铜代叶绿素2.2利用分光计观察铜代叶绿素以及皂化叶绿素甲醇溶液的吸收光谱2.3 萃取法分离黄色素与绿色素3. 叶绿素含量的测定用分光光度计分别测量色素丙酮溶液在663、645、440处的OD 值，利用Lambert -beer 定律计算各色素含量实验步骤:1. 色素的提取取鲜叶4g ，加入10ml 丙酮以及少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，用漏斗过滤，向滤液中再加入20ml 丙酮溶液并过滤，即为色素提取液，放于暗处备用2. 铜代反应3. 绿色素与光色素的分离3.1取20ml色素提取液加到装有20ml乙醚的分液漏斗中，摇匀。
3.2沿漏斗边缘加入30ml蒸馏水，轻轻摇匀，静置10min，溶液即分为两层，弃下层3.3再用蒸馏水冲洗乙醚溶液一次，弃下层水相3.4加入8ml30%KOH甲醇过饱和溶液，用力摇动漏斗5min以上，皂化后颜色变为棕褐色，静置10Mim，取少量皂化叶绿素进行4.3步3.5 加蒸馏水约10ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别收集并保存4.观察色素溶液的吸收光谱4.1.观察色素提取液的吸收光谱4.2.观察2中得到的铜带叶绿素的吸收光谱4.3.观察3.4步中的皂化叶绿素甲醇溶液的吸收光谱，用甲醇将溶液稀释一倍比较之5.叶绿素a、b含量的测定5.1. 取鲜叶0.5g，加丙酮5ml及少许碳酸钙和石英砂研磨成匀浆，匀浆转入量筒中，用80%丙酮洗涤研钵，并定容至10ml5.2. 取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用5.3. 取上述提取液4ml，以80%丙酮作对照，分别测量663nm/645nm/440nm处的光密度值5.4. 按照Lambert-beer定律分别计算色素提取液中叶绿素a、b及叶绿素a+b的浓度，类胡萝卜素浓度，再根据稀释倍数计算每克鲜重叶片中色素的含量。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。
2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
实验一_叶绿素的提取、理化性质和含量测定
一、实验原理叶绿素是植物光合作用色素，主要有chla chlb ，不溶于水,可溶于酒精.丙酮和石油醚。
叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应。
叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇( 植醇，phytol) 的“尾巴”。
卟啉环中的镁原子可被H＋、Cu2 ＋、Zn2 ＋所置换。
用酸处理叶片，H＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。
去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。
人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。
叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。
原因是当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited state）。
叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光。
寿命很短。
处于第一三线态的叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光。
二、实验目的1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法。
2．观察叶绿体中的各种色素。
3．掌握叶绿素的物理和化学性质三、实验用品1．材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜结晶、KOH-甲醇溶液等。
2．仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、研钵、试管、具塞锥形瓶等等。
四、方法和步骤1、叶绿体色素的提取• 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或碳酸钙和10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素。
• 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。
• 沿分液漏斗的壁小心加入30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。
叶绿素试验
叶绿素含量的测定(分光光度法) 三、叶绿素含量的测定(分光光度法)
(一)原 理
叶绿素a 叶绿素 a 、 b在红光区的 最大吸收峰分别为665nm和 665nm 最大吸收峰分别为 665nm 和 649nm nm， 649nm ， 类胡萝卜素的最大 吸收峰为470nm，据朗伯－ 470nm 吸收峰为 470nm ， 据朗伯 － 比尔定律，求出叶绿素a 比尔定律 ， 求出叶绿素a、 及类胡萝卜素含量。 b及类胡萝卜素含量。 13.95A 88A Ca = 13.95A665 - 6.88A649 24.96A 32A Cb = 24.96A649 - 7.32A665 Cx. 05Ca 114. Cx.c = (1000A470 - 2.05Ca - 114.8Cb) / 245 1000A
(三)方法与步骤
称取0.1g左右的鲜 称取0.1g左右的鲜 0.1g 剪碎，放入研钵中。 叶，剪碎，放入研钵中。 加少许碳酸钙和少量的 石英砂( 石英砂(中和细胞中的 酸，防止镁从叶绿素分 子中移出) 95%乙 子中移出)与1ml 95%乙 在研钵中快速研磨。 醇。在研钵中快速研磨。 再加95% 95%乙醇洗涤残渣 再加95%乙醇洗涤残渣 中的色素，过滤。 中的色素，过滤。在 25ml的容量瓶里定容至 25ml的容量瓶里定容至 25ml， 25ml，滤液即为色素提 取液。 取液。
(二)方法与பைடு நூலகம்骤
用移液管取叶绿素 提取液注入比色杯中， 提取液注入比色杯中， 以95%乙醇作为参比溶 95%乙醇作为参比溶 根据实验要求， 液。根据实验要求，选 用相应的波长在分光光 度计上测定光密度。 度计上测定光密度。
（三）结果与计算
样品中叶绿素含量(mg/g) 样品中叶绿素含量(mg/g) =比色杯中叶绿素浓度×稀释倍数×定容体 比色杯中叶绿素浓度×稀释倍数× 样品量(g鲜重) (g鲜重 积/样品量(g鲜重)
叶绿素含量的测定
植物叶绿体色素的提取、分离、及含量测定（一）叶绿体色素的提取一、实验目的1．掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
2．了解皂化-萃取提取β−胡萝卜素原理。
3. 了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素原理。
二、实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。
在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。
它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
叶绿素的基本结构见图47.1。
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。
在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。
所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。
类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。
胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。
β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A 在端链失去两分子水结合而成。
叶绿体色素的提取理化性质与含量测定
2）取代反应
卟啉环中旳Mg处于不稳定旳状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg能够被H+所取代而成褐色旳去镁叶绿 素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色旳铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。
7. 思索题
1）用不含水旳有机溶剂提取植物材料尤其是干材料旳叶绿 体色素往往效果不佳，原因何在？
2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？ 3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸
收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b旳定量分析？为何？
加入少许碳酸钙旳目旳是为了预防在研磨过程中，叶绿素受到破坏。 详细旳情况是这么旳：叶绿体中旳色素所处旳环境具微碱性，试验中， 因为研磨会使细胞构造遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性旳 细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素旳分子构造遭到破坏， 使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液旳 酸性，可起到保护叶绿素旳作用 。
5. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+旳取代作用
1）吸收叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇 匀，观察溶液颜色旳变化。 （成果与分析4.1）
2）当溶液变褐色后，倾出二分之一于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉， 水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同步加热）旳一管相比 较。（成果与分析4.2）
试验 叶绿体色素旳提取、理化性 质与含量测定
1. 试验目旳及意义
➢ 提取叶绿体色素 ➢ 分析叶绿素旳物理、化学性质 ➢ 测定叶绿素旳含量 ➢ 提取和测定植物组织中旳光合色素是研究光
叶绿体中色素的提取和分离 - 四川大学.
叶绿体中色素的提取、理化性质 的鉴定和含量测定
一、实验原理
1. 叶绿体中主要色素是叶绿素和类胡萝卜素
2. 种类：叶a 、 叶b
• 结构： 双羧酸酯
含与N、碱M反g应的生极成性叶头
• •
物理性质：不溶于水，易叶溶绿于绿醇有素非机盐极溶、剂性叶尾醇
• 化学性质：皂化反应
和甲醇。
•
置换反应
• •
叶光功绿 合能素 色：a素吸）的收光光学能性、质电子传递镁、可光等被能置銅转换、化。氢（少量
荧光现象和磷光现象
• 荧光现象：叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而 在反射光下呈红色的现象。
• Chl + hν
• 基态 光子能量
• chl*激发态
叶绿素、类胡萝 卜素的含量测定
二、实验步骤
叶片10g
研磨
SiO2和CaCO3、10+20ml丙酮
丙酮提取液
NaCL水溶液，分层
20ml石油醚萃取、蒸馏水洗
可见光光谱
对光合作用有效光的波长是400~700 nm
荧光(fluorescence） : CHL从第一单线态回到 基态所发射的光。
磷光(phosphorescence）:CHL从第一三单线 态回到基态所发射的光。
叶绿素的荧光和磷光现象说明 叶绿素能被光所激发， 而叶绿素的激发是
将光能转变为化学能的第一步。
要求：实验作业当堂交
石油醚提取液
色素的石油醚提取液置暗处或用黑纸包好备用。
光破坏作用 2 叶绿素的荧光 % KOH甲醇溶液
去镁叶绿素 1ml
HCL滴加 醋酸铜结晶
分光光度法测定叶绿素和类胡萝 卜素的含量
• P 53
三、作业
实验3 叶绿体色素的提取、分离、性质
实验三叶绿体色素的提取、分离、性质及含量一、实验目的1、掌握叶绿体色素的提取方法；2、掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；3、掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验仪器及材料仪器及试剂：吹风机、定性滤纸、脱脂棉、火柴、碘钨灯、95%乙醇、汽油、醋酸铜、浓盐酸、CaCO3材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称菠菜叶子10g，加少许石英砂、CaCO3、乙醇研磨，研成匀浆，过滤，用乙醇定容至50ml，分装于5个试管内。
2、分离用滤纸条浸色素提取液（试管1），吹干，反复多次；将带色素的滤纸条卷成灯芯，将表面皿放在培养皿内，注上汽油，把灯芯浸在汽油内，加盖，色素层分清后，取下吹干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。
用铅笔标出各种色素的位置和名称。
3、叶绿体色素吸收光谱曲线取1ml提取液于比色杯中（试管2），加3ml95%乙醇。
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实验报告
课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型： 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 姓名： 专业： 学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期：
一、实验目的和要求 二、实验内容和原理
三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析 七、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。
2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。
二、实验内容和原理
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：
1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2、皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
COOCH 3 COO -
C 32H 30ON 4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH
COOC 20H 39 COO -
3、取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )
褐色 绿色
4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
5、定量分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b 及总量，而652可直接用于总量分析。
根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与吸光值之间有如下的关系： OD 1=Ca*k a1+C b *k b1 OD 2=Ca*k a2+C b *k b2
查阅文献得，叶绿素a 和b 的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下。
波长/nm
比吸收系数k
叶绿素a 叶绿素b
663 82.04 9.27
645 16.75 45.60 将数值代入式子得：OD663=82.04*Ca+9.27*Cb OD645=16.75*Ca+45.60*Cb
经整理后，得到式子：Ca=0.0127 OD663 - 0.00269 OD645 Cb=0.0229 OD645 - 0.00468 OD663
三、主要仪器设备
天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等
四、操作方法与实验步骤
1、定性分析：
鲜叶5g+95%30ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。
皂化反应(3ml) ：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml分层后观察
取代反应（1）：加醋酸约2ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1）
反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）
两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰
3、叶绿素定量分析：
鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。
五、实验数据记录和处理
1、定性分析：
观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。
皂化反应(3ml) ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。
下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。
取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色，为铜代叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
图 1 图2图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范
围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。
图二在450nm 以及475nm 波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。
3、叶绿素定量分析：
将数值代入式子，计算得：
Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645=12.7*0.1735-2.69*0.067=2.02 mg/L Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=22.9*0.067-4.68*0.1735=0.722 mg/L CT (mg/L) = Ca+ Cb =2.74 mg/L
Chla 含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.01 mg/g.FW Chlb 含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=0.361 mg/g.FW Chl 总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.37mg/g.FW
六、实验结果与分析
1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。
2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片中，叶绿素a 的含量大约是叶绿素b 的三倍左右。
3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是以下几个原因造成的：1.研磨的充分程度不同 2.所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别
七、讨论、心得
1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？
叶绿素有基态（G ），第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3），光子吸收必须遵守普朗克定律。
被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。
蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2，而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。
2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？
因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。
波长/nm 645 652
663 OD
第一组
0.066 0.094 0.175 第二组 0.068 0.093 0.172 平均
0.067
0.0935
0.1735。