闭塞性细支气管炎小鼠模型的建立与评价

闭塞性细支气管炎小鼠模型的建立与评价李松1，邹琳2，符州3，王莉佳4，代继宏3儿童发育疾病教育部重点实验室1，重庆医科大学儿童医院临床分子中心2，重庆医科大学儿童医院呼吸中心3重庆医科大学儿童医院呼吸实验室4，[摘要] 目的探讨建立闭塞性毛细支气管炎（BO）小鼠动物模型的方法。

方法将40只 SPF级C57BL/6雄性小鼠(6-8w)随机分为对照组和模型组两组。

模型组的构建采用初次气管内滴注二乙酰（DA）（490mg/ml，500mg/kg）1次，对照组采用已消毒的蒸馏水代替，其余实验条件和方法均相同，饲养于SPF级动物中心，至第3天和第7天收集标本。

饲养期间观察小鼠一般状态，监测两组体重变化、肺功能改变；支气管肺泡灌洗、细胞计数及炎性细胞分类计数；病理切片、HE染色等。

结果模型组小鼠给予DA（500mg/kg）后1天可出现吼喘、呼吸加快等表现。

模型组小鼠BALF液炎性细胞总数及分类计数可见：3天以中性粒细胞为主，7天以淋巴和单核细胞为主（p＜0.05）；病理切片HE染色可见典型的BO改变（气道上皮脱落严重；细支气管管腔内及管腔周围3天可见大量炎性细胞浸润，伴肺泡急性出血，气道上皮大部分脱落，管腔严重闭塞；7天可见管壁增厚，炎症细胞浸润明显，类纤维化表现）。

结论 C57BL/6小鼠给予气管内滴注DA（500mg/kg）1次，可于第7天观察到典型的急性期BO改变。

[关键词] 闭塞性细支气管炎；二乙酰；小鼠；模型Establishment and evaluation of model of bronchiolitis obliteransLi Song1, Zou Lin2, Fu Zhou3, Wang Lijia4, Dai Jihong3（1Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood of Ministry of Education, 2Center for Clinical Molecular Medicine, 3Center of Respiratory Disorders,4Laboratory of Respiratory Disorders ,Children’s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing, 400014, China）[Abstract] Objective Explore the establishment of bronchiolitis obliterans (BO) methodof mouse animal model. Methods Fourty C57BL/6 mice ( SPF )were randomly divided into normal control group and BO model group ,20 mice per group. BO group intratracheal 作者简介李松，硕士研究生，E-mail：qwe130********@通信作者代继宏，主任医师，博士，E-mail：danieljh@instillation with Diacetyl(DA) (490mg/ml，500mg/kg),once.The control group with distilled water instead of sterile, the rest of the experimental conditions and methods are the same, keeping in SPF class animal center, to 3 and 7 days to collect specimens.Then General stateof the mice was observed during feeding, monitoring groups weight changes, lung function; bronchoalveolar lavage, cell counts and inflammatory cell count, pathology sections,HE staining. Results After the model group mice were given DA (500mg/kg) at the first day can occur roar breath, rapid breathing and other symptoms. BALF fluid and total number of inflammatory cells are observed that 3 days dominated by neutrophils, 7 days are main of lymphoid cells and monocytes (p<0.05); HE staining can see the typical BO changes (severe tracheal epithelium denudation; visible within the first three days lumen bronchial lumen andthe surrounding inflammatory cell infiltration, with acute alveolar hemorrhage, airway epithelial shedding most, severe occlusion of the lumen ;seventh days can visible wall thickening and inflammatory cells infiltration, similar fibrosis class performance). Conclusion Intratracheal instillation DA (500mg/kg) one time can establish a stable and typical murine model of bronchiolitis obliterans.[Key words] bronchiolitis obliterans；diacetyl ; mouse; model闭塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans,BO)是气道炎性损伤所致的慢性呼吸道疾病[1]，表现为小气道纤维增殖性病变使管腔狭窄，并最终闭塞，患者出现进行性、不可逆的气流受阻。

BO是严重威胁人类健康的呼吸道疾病。

对患者气道造成显著不可逆损害，目前尚无有效防治手段，所带来的社会卫生支出较高，应高度重视，积极寻找病因、发病机制及有效治疗手段。

成功的动物模型是研究BO发病机制、干预的重要手段，本研究将探讨建立BO小鼠模型的方法，观察病理学等指标改变，为今后的研究打下基础。

1 材料和方法：1.1 实验材料：选取6-8周清洁级雄性小鼠，C57BL/6，40只，购于重庆医科大学实验动物研究中心，按体重随机分为2组，动物饲养和实验均于动物实验室屏障环境进行，实验时室温(22±1℃) ，湿度(47±2）%。

对照组:control组、模型组：BO组；小鼠饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物研究中心，SPF动物房；所有实验操作均按照实验动物指南进行。

1.2 主要试剂与仪器：戊巴比妥钠粉剂（sigma公司）；二乙酰（diacetyl,DA,sigma，美国）；乙酰甲胆碱（sigma，美国）；MPA生物信号采集分析系统（上海奥尔科特生物有限公司）；显微外科手术器械（苏州医疗器械厂）；常温离心机（eppendorf AG),数码照相系统（leica DFC 420，Germany),光学显微镜（OLYMPUS,Japan），BMJ-Ⅲ型包埋机（常州中威电子仪器厂），石蜡切片机（leica，Germany），制冰机（Cainelius), Count star自动细胞计数仪（IC 1000)。

1.3 实验分组及动物模型的制备：SPF级雄性C57BL/6小鼠，40只， 6-8周，随机分成两组，每组10只；模型组：初次气管内滴入二乙酰（DA）（500mg/kg）；对照组：以消毒的蒸馏水（500mg/kg）代替DA气管内滴入，分别于3、7d处理，实验中观察小鼠一般情况。

1.4 小鼠行为学观察：每天观察小鼠一般情况及体重，并做好记录。

1.5 肺功能测定：分别于第3天和第7天用无创肺功能体描仪行小鼠气道高反应性检测，待检测的小鼠先雾化吸入乙酰甲胆碱（美国Sigma公司），一次由低浓度开始（0、3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml），每个浓度雾化3min、休息2min、连续记录5min并取其平均值。

用呼吸曲线penh值表示不同质量浓度乙酰甲胆碱后的气道高反应性。

1.6 外周血和支气管肺泡灌洗液（BALF）的获取：分别于3、7d后，眼球取血，血液静置2h，2500r/min离心10min，留取血清冻存于-80℃待检。

颈椎脱臼法处死小鼠，行支气管肺泡灌洗（每次注入已消毒过滤且预冷的PBS 0.5mlx3次，回抽率达85%以上），置于10ml EP管中，4℃,2500r/min 5min离心 ,弃上清，沉渣用1ml预冷的PBS重悬，吸取细胞悬液加入细胞计数板，400倍镜下计数炎性细胞总数；剩余细胞悬液再次离心（4℃,2500r/min 5min），弃上清，取少许沉渣涂片。

1.7 炎性细胞计数及分类计数：将细胞涂片进行瑞士染色，油镜下计数巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及其他炎性细胞数。

1.8 肺组织HE染色及图像分析:各组取结扎小鼠肺组织，取下置于10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，切片4um，苏木素-伊红（HE）染色、光镜下观察病理改变。

1.9 统计学处理采用SPSS17.0统计软件，数据以 ±ｓ表示，多组建均数比较采用单因素方差分析，方差齐星组建两两比较采用LSD法，方差不齐则用Dunnett’s T3法。

2 结果2.1 小鼠行为学观察于首次气管内滴注DA 1天后实验组小鼠可出现吼喘、呼吸加快，抓口鼻等表现，第2d出现少许适应，仍有吼喘加重、呼吸加快等阳性反应；对照组无以上症状出现。

2.2 小鼠体重变化如图1所示：模型组小鼠体重于第0-3天下降最明显，从第4天后出现回升趋势,但仍低于对照组（p ＜0.05）；对照组体重基本无改变。

图1 各组小鼠体重变化比较（P﹤0.05）2.3 小鼠气道高反应变化结果如图2A、B所示模型组第3天肺功能明显高于对照组（4倍），和病理改变相一致；第7天dose 50时明显高于对照组（5.5倍），有统计学意义。