动物细胞工程

动物细胞工程第一章动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念1.动物细胞工程的定义动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进行各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化（产生新型生物个体）的技术体系，是生物技术（生物工程）的重要组成部分。

狭义细胞工程指对细胞个体进行的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进行的各种操作。

2.动物细胞工程研究的主要内容以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的研究。

(1)狭义细胞工程：研究体外分离、培养、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。

(2)组织工程：研究体外培养、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。

(3)器官工程：研究体外培养、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。

(4)动物胚胎工程：研究动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。

3.动物细胞工程研究的意义(1)是动物繁殖的重要技术手段加快动物繁殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物(2)是人类辅助生殖技术的重要组成部分体外受精—胚胎移植技术，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段对精子或卵子进行遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使若干个动物性状进行有机组合，产生新的生物个体；(4)生产药物直接培养细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进行遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物（生物反应器）；(5)保存珍惜动物资源由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)提供人类器官移植的材料人类器官移植发展很快，目前可以进行心脏、肝、肾脏移植，可以进行皮肤、角膜、骨髓细胞移植。

三、动物细胞工程讲授的主要内容1.动物细胞、组织培养2.动物细胞融合3.动物细胞重组4.向细胞内引入高分子物质5.动物细胞冷冻保存6.动物胚胎工程四、动物细胞工程实验（实习）内容1.实验仪器设备的识别与使用2.动物细胞培养用液的制备3.动物胎儿成纤维细胞分离与培养4.动物细胞常规检查和生物学检测5.培养细胞的冻存与复苏五、动物细胞工程研究取得的重要进展1.精液采集、精液冷冻与人工授精技术的成熟和发展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了基础；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培养技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产提供了技术支撑；5.胚胎干细胞与组织干细胞成功分离、体外扩增与诱导分化研究的成功，为人类医学发展提供了宝贵的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞（细胞转染基因）技术的成功，为转基因动物的生产创造了条件；7.胚胎嵌合技术一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有新性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。

细胞融合技术为单克隆抗体及其它药物生产，创造了条件；9.细胞重组技术一方面，细胞核与细胞质互换，研究细胞质对细胞核基因表达及组织发育的影响，另一方面，利用细胞核移植技术生产克隆动物与胚胎，为转基因动物生产创造条件。

第二章动物细胞与组织培养概论一、培养的基本概念动物组织细胞1.组织培养（Tissue culture）组织培养是指从动物体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物组织生存、生长并维持其结构与功能的过程。

2.细胞培养（Tissue culture）细胞培养是指从动物体内取出组织，分离获得细胞，并模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物细胞生存、生长，增殖并维持其结构与功能的过程。

3.器官培养（organ culture）器官培养是指从动物体内取出器官，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物器官生存、生长并维持其结构与功能的过程。

二、动物组织细胞培养的作用1.可以长时间观察和研究活细胞的生命活动；2.理化环境可以人工控制；3.遗传性状均一；4.对外界环境刺激反应灵敏；5.省费用；6.为动物繁殖新技术提供理论依据和技术支撑；7.是动物遗传育种的重要技术手段； 8.为医学移植提供材料：细胞、组织、器官；9.利用细胞培养，生产生物制品（药物如疫苗，抗体）； 10.保存珍惜动物遗传资源； 11.研究生命科学奥秘三、动物细胞在体外培养过程中发生的变化1.环境不同2.细胞与细胞联系不紧密3.细胞容易发生突变4.细胞群落结构趋于单一性5.体外培养的细胞与体内细胞相比较，基因组及遗传物未发生改变，但遗传物质的表达发生了改变。

6.形态发生一系列变化（2小时）（1）从分离到附着球形（圆形）→扁平状（延展细胞）→极性细胞（纺锤形、三角形，多角形）（2）细胞器和细胞核集中于细胞中央，胞质外周包裹透明状胶体（细胞骨架）（3）活细胞形态在光学显微镜下，细胞均质而透明，结构不明显，在相差显微镜下，可以看到细胞轮廓和内部结构，细胞中含有一个或两个细胞核核仁。

（4）弱（死）细胞形态细胞轮廓增强，细胞质中出现颗粒脂滴和空泡。

7.培养细胞对生存环境要求更严格，更脆弱，由于缺少保护机制和解毒机制，细胞需要无毒、无污染的环境。

四、体外培养细胞的类型1.根据培养细胞生长是否需要支持物，细胞分为两种类型（1）贴附型细胞：在体外培养过程中，需要附着在支持物上的细胞，被称为贴附型细胞。

如成纤维型细胞，上皮型细胞，游走型细胞（可以移动），多型细胞（神经细胞，难以确定稳定状态）。

（2）悬浮细胞：在体外培养过程中，不需要支持物，需要悬浮在培养液中的的细胞，被称为悬浮细胞。

如红细胞，白细胞。

2.根据培养细胞生物学特性，将培养细胞分为：神经细胞、上皮细胞、脂肪细胞、血细胞（红细胞、白细胞）、淋巴细胞、心肌细胞、骨骼细胞、生殖细胞五、组织培养细胞的生长和增殖过程1.体外培养细胞不同代数指数期细胞生长规律（1）原代培养期从动物体内取出新鲜组织，分离获得细胞，细胞在体外初次培养生长至第一传代期，细胞开始分裂，指数期细胞数量较少，大多数为异质细胞（不同类型细胞），为2倍体。

（2）传代期当原代细胞在体外培养，密度达到最大，出现片层时，将细胞群消化分离成单个细胞或多个细胞，在体外培养生长至饱和密度的过程，传代期可以持续进行数十代。

处于传代期细胞指数期细胞数量最大，细胞生长分裂速度最高。

（3）衰退期有限细胞系细胞开始衰老，分裂增殖能力下降，指数期细胞数量下降的过程。

2.同代数细胞分裂增殖规律（1）滞留期细胞质收缩，呈球形，细胞开始悬浮于培养液，随后，附着性细胞活细胞开始附着，具有代谢与运动能力，但不分裂。

（2）指数增长期细胞分裂旺盛，细胞分裂速度增加，细胞数量快速增加，细胞活力最大，细胞相互连接形成片层。

（3）平台期由于密度增大，细胞相互之间密切接触产生抑制效应导致细胞分裂速度减小，死亡速度增加，细胞数量处于稳定时期，细胞数量达到最大。

细胞有活力但分裂停止。

（4）衰老期由于密度制约，养分供应不足，细胞衰老死亡数量增加，细胞分裂速度减慢，细胞数量开始减少。

3.单个细胞生长过程（1）A 间期（2）G1期：DNA合成前期（3）S期：DNA合成期（4）G2期DNA合成后期，细胞分裂前期（5）M期：细胞分裂期（有丝分裂前、中、后、末期）4.培养细胞生长特点（1）贴附、伸展大多数哺乳类动物细胞在动物体内生长分裂发育过程中，需要附着在基质上，体外培养的许多细胞，也趋向于附着在细胞支持物上，如细胞附着在胶原蛋白、玻璃或塑料上。

（2）接触抑制在一般情况下，体外培养的细胞在生长过程中发生分裂和增殖，正常细胞不断运动，其外周细胞膜呈现一些特征性触褶运动，当两个细胞相互靠近时，另一个细胞停止运动并向另一个方向离开，当一个细胞被其他细胞包围不能运动时，细胞膜触褶运动和分裂增殖将会受到抑制。

（3）密度依赖性任何细胞分裂增殖，都需要一定的细胞密度，细胞密度过小，对细胞分裂增殖不利。

细胞密度过大，对细胞增殖也不利。

细胞密度对细胞分裂增殖的不可缺少的作用称为细胞密度的依赖性。

在细胞生活过程中，细胞个体之间存在着形态的和机能的联系，如上皮细胞之间存在桥粒，细胞之间存在着能量、物质和信息交换。

（4）细胞基质（Extracellular Matrix：ECM）细胞基质对于细胞生长、分裂、增殖与分化具有重要的作用。

体外培养细胞和定向诱导细胞分化时，必须考虑细胞基质的作用。

六、体外培养细胞生存的必须条件1.环境无污染，无毒环境无污染、无毒是保证培养细胞生存的首要条件。

环境无污染，是指在细胞培养过程中，培养液、培养器皿以及操作各个环节无细菌、病毒以及衣原体等有害物质进入。

环境无毒是指在细胞培养过程中，培养液、培养器皿以及操作各个环节无有毒有害物质进入培养系统。

2.温度体外培养的细胞只有保持在一定的恒温条件下，才能分裂、增殖和生长，环境温度过低或过高，都不利于细胞的生长。

一般情况下，促使细胞快速增殖的环境温度为动物的体液温度，对于哺乳类动物，体外培养细胞的理想温度是35℃～ 37℃，鸟类动物培养细胞理想温度是38.5℃。

3.CO2和O2 5% CO2对于大多数哺乳类动物细胞来说是适宜的。

4.pH值大多数细胞适宜于在7.2—7.4条件下生长，PH值低于6.8，高于7.6，对细胞分裂增殖都不利。

5.渗透压大多数细胞生长需要一定的渗透压，渗透压对于保持细胞膜的完整性以及维持细胞正常的代谢，具有重要作用。

大多数培养细胞所需要的渗透压为260 ～ 320mmol/l。

七、细胞体外培养所需的营养物质1.糖类主要为单糖如葡萄糖2.氨基酸精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺。

3.维生素维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，生物素4.促生长因子与激素促进细胞分裂、增殖与分化的蛋白质、类固醇类物质5.矿物质 K、Na、Ca、Mg、P、S，Fe、Cu、Zn、Se、Cr、Mn、Mu6.水用于细胞培养的水，需要无毒、无菌，一般用二蒸水或四蒸水。

八、与细胞工程有关的术语1.细胞株（cell细胞strain）：形态均一，生长增殖比较稳定，生物性状稳定独特的一群细胞。

2.细胞系（cell line）：形态均一，生长增殖比较稳定，生物性状稳定独特的一群细胞，能不断的经过传代而扩增。