免疫组化的基本步骤

免疫组化步骤

1.4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，

贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；

2.加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）

30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

3.加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞

的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；

4.加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，

4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；

5.加入0.01MKPBS稀释的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6.加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三

次；

7.加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行

观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入

0.01MKPBS终止反应；

8.梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

免疫组化主要步骤

1.洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等

除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于

石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左

右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组

织的载玻片置于40°C温水中。

4.捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡

受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒

精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.

6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性

的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中

5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl 血清封闭液）。

8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加

一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS

后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。

10.加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后

加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。

11.加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS

后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）A：DAB B：H2O2 C：磷酸

缓冲液

12.复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为

半分钟，植物组织3-5min。

13.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒

精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

14.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一

侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

免疫组化操作步骤

一. 免疫组化（LP 法）操作步骤：

1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色, 将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10-15 分钟。

4. 缓冲液洗5min/2 次。

5. 滴加Ultra V Block ，在室温下孵育5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。）

6. 缓冲液洗5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育1 －2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）

8. 缓冲液洗5min/2 次。

9 ．滴加Primary Antibody Enhancer( 增强子) , 在室温下孵育20 分钟。

10 ．缓冲液洗5min/2 次。

11 ．滴加HRP Polymer( 酶标二抗) ，在室温下孵育30 分钟。

（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）

12 ．缓冲液洗5min/2 次。

13 ．向1ml DAB Plus Substrate ( 或AEC Plus Substrate) 中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）, 混匀后滴加到切片上，孵育3 －15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）