内毒素检测影响因素
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法华W西C药J学'杂P志S2加2,I7(11/:79～}}0n^J,l,l:一影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法王明清四川省广元市人民医院.四川广元628000摘要:目的探讨影响细菌内毒素检查法的因素及克服方法:方法查阅文献,结合实践和实验进行阐述.结果标准品,灵敏度,器具处理后的放置时间及操作环境,条件等均对内毒素检查结果有影响.结论克服以上因素可使内毒素检查法结果更加准确,可靠.关键词:细菌内毒素;影响因素;克服方法中圈分类号:R927.12文献标识码:B文章编号:1006—0103c2oo21ol一0079—02 细菌内毒素检查法仍被2000年版中国药典继续收载,并比1995年版规定更细,要求更高.我们在实际工作中发现,当具体执行时,仍存在不少值得研究和探讨的问题-,这些问题均可影响细菌内毒素检查法结果的可靠性.1细菌内毒素工作标准品对鲎试剂灵敏度的影响细菌内毒素标准品有两种,一种为细菌内毒素国家标准品,用于标定生产厂家生产的细菌内毒素及仲裁鲎试剂的灵敏度;另一种为厂家生产的细菌内毒素工作标准品,用于标定鲎试剂的灵敏度及试验中的阳性对照.可见内毒素工作标准品的质量,直接影响鲎试剂的灵敏度.1.1实验材料和方法鲎试剂(厦门,灵敏度标示值0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号:951220);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号:950101)及超纯水.鲎试剂(福州,灵敏度标示值0.5EU?rrd～,每支01rrd,批号: 960114);细菌内毒素工作标准品(每支5EL",批号: 950913)及超纯水.其它材料按药典实验要求进行灵敏度复核用各地生产的内毒素工作标准品对其鲎试剂的灵敏度进行复核,均符合标示值.当以厦门产细菌内毒素工作标准品复核福州产鲎试剂灵敏度时,其灵敏度有所提高;当以福州产细菌内毒素复核厦门鲎试剂灵敏度时,则灵敏度有所降低,复核时.仍存在差异.蔡红等报道.也证实这一点.这种现象的发生,是鲎试剂的质量问题,还是内毒素工作标准品的质量问题,因无国家标准品仲裁,故无法定论,但作者简介:王明清.男.副主任药师,从事医院药学工作应引起重视.在实际工作中,则建议使用某厂生产的鲎试剂,就用该厂供给的内毒素工作标准品或国家标准品来标定鲎试剂灵敏度,标示值与实测值符合规定,则可用于细菌内毒素的检测,使结果正确可靠.最好避免此厂产内毒素标准品复核彼厂产鲎试剂的灵敏度或用于样品内毒素的检测1.2鲎试剂灵敏度的选择厦复核正确选择灵敏度是保证鲎法检测内毒素结果可靠性的依据.热原大多数是微生物的内毒素,其检查方法仅为限量检查.而药品因其剂型,用量不同而热原限量亦不同,如果选用的鲎试剂灵敏度低于药品内毒素限量,则出现假阴性,若高于药品内毒素限量的灵敏度,则出现假阳性,均达不到检测热原以保证药品质量的目的.所以必须确定药品的细菌内毒素限值.根据确定的药品细菌内毒素限值而选择鲎试剂的灵敏度.鲎试剂是一种生物制品,使用前必须对购回的鲎试剂按中国药典2000年版规定对其灵敏度进行复核,当复核结果符合规定时方可用于细菌内毒素检查.试验前应按药典规定作"供试品干扰试验",否则其结果可疑.2供试品调pH值在细菌内毒素检查法中,对供试品DH的调试各国药典要求不同,美国药典和英国药典均规定pH6～8,而中国药典对此未作具体规定,高国政等则认为pH的调节很有必要.因大输液所含成分对鲎法无干扰,可以不调DH,同时鲎试剂本身具有一定的缓冲能力.但除大输液以外的品种,应进行多次调与不调pH的平行对比试验及多个试验室的复试方可定论80华西药学杂志第l7卷3器具的处理及放置时间试验所用器具必须无热原化处理,2000年版药典已明确规定.工作中曾出现过同一品种使用,经无热原化处理放置24h后的器具作热原试验,出现阳性结果;复核时,器具除热原后放置12h后用于细菌内毒素检查,结果阴性故器具除热原后放置12h应立即使用,最好不超过24h.4严格控制细菌内毒素检查法的操作环境,条件和时间在中国药典2000年版二部细菌内毒素检查中,未规定在37±1℃保温60±2min前的操作环境,操作时间和室内温度,笔者认为这是药典不够完善的地方.为此,作了如下实验.鲎试剂(福州0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号: 960503);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号: 960326)及细菌内毒素检查用水(批号:960109,每支2m1).实验过程中,室内温度分别为l5℃,23℃,28℃, 30℃,32℃.操作时间分别为10,20,30min.内毒素工作标准的浓度分别为1,0.5,0.25,0.125EU? ml.于37±l℃保温60±2min,观察发现,在室温28℃以上时,随着操作时间的延长,鲎试剂的灵敏度有所提高.工作中曾出现过因放置室温不同,实验时间不同而出现假阳性的结果;复试时,室温降低, 操作时间缩短则结果阴性;临床验证,无热原反应. 因此,整个细菌内毒素检查,从溶解,稀释,混合到放人水浴保温及结果判定的总时间控制在室温28℃及以上时,不超过80rain;室温在28℃及以下时,不超过90n即保温前操作时间为28℃及以上时20min;28℃以下时30min.参考文献I郭录平浅谈影响鲎试验的因素[J:中国药学杂志1996,319 (3):1872蔡红,王豫蓉.粱平鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量硷查的影响初探J]中国医院药学杂志.1998.I8(2】:853高国政,颤锦值影响鲥苗内毒素测定的实验研究[』:中国药学杂志,1998.33(3):162收藕日期:200012(上接第78页)1.2.3碱液中的硫酸沙丁胺醇片的含量测定精密量取"1.2.2"项下的续滤液3ml置250ml量瓶中,加0.01mol?L氢氧化钠液稀释至刻度,摇匀,照分光光度法在244/lilt波长处测定吸光度,以沙丁胺醇的吸收系数为506计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1).1.2.4碱液中的加样回收试验取1.2.3"项下已知含量的溶液,精密加人一定量的沙丁胺醇标准溶液,同法测定.平均加样回收率为99.4%,RSD=O.73%(=4).1.2.5HPLC测定硫酸沙丁胺醇片的含量取"1.2.2"项下的续滤液5置25量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照文献..方法测定,按内标法以峰面积计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1.襄l硫酸沙丁胺醇片的含量测定结果{H=32讨论2.1从实验结果及表l可以看出,碱液法与HPLC法结果基本一致,而酸液法结果明显偏高.碱液法所用的浓度最低,酸液法次之,HPLC法所用的浓度最高.显然,改变溶液的酸碱性和检测波长,可提高其检测灵敏度.2.2采用紫外分光光度法测定硫酸沙丁胺醇片的含量,在碱液中较酸液中检测灵敏度提高7倍以上.文献[1]的测定方法改为高效液相色谱法,但操作较繁琐,灵敏度较低,且需使用对照品和内标物质此外,新版药典中硫酸沙丁胺醇注射液及硫酸沙丁胺醇胶囊的含量测定仍为灵敏度较低的吸收系数59的紫外分光光度法,均有待改进2.3试验表明,碱液法中样品宜先加水溶解过滤后再用氢氧化钠液碱化后测定,若直接将样品溶于氢氧化钠溶液中,过滤稀释后再测定,则结果偏高约5%,其原因有待进一步考证参考文献l中华人民共和国国家药典委员会中国药典【s]二部北京:化学工业出版杜,20oo.8712英国药典[s]上册199819213张晓橙喘乐宁气雾剂古量测定方法的改进J]药物分析杂志, 1992.I2(2):80收稿日期:2'001—02。
内毒素检测影响因素
关于细菌内毒素检查法中几个问题的探索本文是通过与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进行一次归纳总结。
通过工作中出现的问题有必要对以下三种情况进行交流，以加强对细菌内毒素检查法的正确理解，同时纠正一些错误的观念。
·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？·如何正确认识器皿洗涤的重要性？·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。
要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。
在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图1鲎试剂与内毒素的反应机理1、pH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。
2、器皿：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。
因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。
同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。
操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。
3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。
许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。
4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。
内毒素问题总结报告
内毒素问题总结报告1.目的1.1解决内毒素反复的问题1.2找出内毒素反复的原因2.背景从200501批次验证到200701批次验证一直存在内毒素反复不合格的问题，为了确认内毒素不合格的原因并予以解决，现进行内毒素问题筛查与解决。
3.试验过程3.1初步筛查准备SAM溶液、活化I、活化II、匀浆后溶液按照以下列表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：初步筛查结果显示为活化II步骤存在问题，下一步主要针对活化II 进行筛查。
准备活化II、溶液＋CaCl2、溶液＋EDC、清洗未匀浆、200501二楼冻干成品、200501三楼冻干成品样品，按照下表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：根据当前两次筛查结果显示，可能在活化II阶段存在干扰，其他步段无法检出干扰因素，分别针对溶液加CaCl2、EDC进行筛查，结果显示均为阴性，因此结合文献推断可能是Ca2+和β-葡聚糖组合干扰。
当前阶段，可供选择的解决方案有：1.采用物理方法排除干扰因素2.采用试剂排除干扰因素3.增大稀释倍数，采用精度更高的鲎试剂4.采用抗增液，结合更高精度鲎试剂3.3物理方法排除干扰针对活化II溶液，采取离心、过滤的方法进行试验。
离心方案为取2.4g溶液在3000rpm离心10min，然后对上清液进行浸提、稀释、检测，结果发现3000rpm离心10min无明显分层现象，且上层呈阳性；过滤方案为取2.4g溶液使用0.22um和0.45um的过滤器进行过滤，对滤液进行浸提、稀释、检测，结果发现溶液使用过滤器容易堵塞过滤器且过滤效率慢，且检测滤液呈阳性。
细菌内毒素检查法干扰试验
Es不在0.5λ—2.0λ范围内，试验无效。
7.4 结 论 依据中国药典2010版附录“细菌内毒素检查
法”，西咪替丁氯化钠注射液细菌内毒素检查干 扰试验2倍和4倍稀释液符合试验要求，对鲎试验 没有干扰。
7.5、检测浓度的选择 如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的
第二个浓度作为日常检查的浓度。
20192019年年1010月月1818日日博康wwwzjwwwzjhycomhycom2929样品内毒素05euml06ml06ml06ml06ml03ml样品03ml06ml06ml0125euml006euml003euml025euml20192019年年1010月月1818日日博康wwwzjwwwzjhycomhycom3030干扰试验加样wse对照名称05025nc20192019年年1010月月1818日日博康wwwzjwwwzjhycomhycom3131干扰试验判断的标准当es在0520包括05和20时且当et在05es20es20192019年年1010月月1818日日博康wwwzjwwwzjhycomhycom323271如所用鲎试剂灵敏度为025euml供试品为xx注射液稀释4倍wse对照名称050250125006nc结果0125es在0520且et在05es20es包括05es和20es认为供试品在该浓度下无干扰作20192019年年1010月月1818日日博康wwwzjwwwzjhycomhycom333372如所用鲎试剂灵敏度为025euml供试品为xx注射液稀释4倍wse对照名称050250125006nc结果042虽然es在0520范围内et不在05es20es范围内供试品在该浓度下有干扰作用需进行适当处理后重做试验
然后用样品西咪替丁氯化钠注射液 的4倍稀释液稀 释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支 管混合均匀连同该混合液即可得到含内毒素分别为 0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml， 含样品西咪替丁氯化钠注射液 浓度为4倍稀释液的 标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。
影响内毒素G试验结果的常见因素
影响内毒素、G试验结果的一些常见因素
一、采血严格按照无菌要求采集，须用专门配套耗材，采血后及时送检。
二、黄疸、溶血、乳糜血会影响检测结果。
三、引起细菌内毒素假阳性原因是：使用某些抗生素类药物，如磺胺类、以细菌为原料加工成的药物。
四、引起G试验假阳性原因有：
1、应用纤维素膜进行血液透析患者；
2、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；
3、某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；
4、某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；
5、抗肿瘤药物（如香菇多糖、裂殖菌多糖等）；
6、含有菌类食物。
五、隐球菌和接合菌不能检出。
六、内毒素检测的灵敏度大概为88%，特异性为90%；G试验的灵敏度为88%，特异性为85%。
七、一次检测结果不能成为确诊依据，须由临床医生根据检测结果并结合临床症状及其他检测结果综合分析。
八、G试验适用于深部真菌，浅部真菌在体内血液中含量并不增高。
九、尽管假阳性原因不清，需进行动态监测（1-3）-β-D葡聚糖的变化，可以降低假阳性的发生。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因
PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、
标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
1） 细菌内毒素标家标准品
细菌内毒素工作标准品
2） 细菌内毒素标准品效价误差
品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理 2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水
细菌内毒素检查结果准确性的
影响因素
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响
实验器皿的的影响
样品成份及理化性质的影响
实验员的影响
环境的影响
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；
鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
细菌内毒素干扰实验培训
λc=antilg(∑X／n)的计算 方法
可以用power公式
该表格未经 确认
问题？怎么用计算器按出 antilg值？antilg是lg函数的反函数，
异常结果的处理及常见的消除干扰的方法
原因
解决措施
解决有关pH的问题 二价阳离子浓度不足
内毒素聚集问题 酶、酶抑制剂问题
用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释
结果判定：
01 溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都 为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎 试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为 有效。
02
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复 核试验要求时，认为供试品在该浓度下 无干扰作用
03
其他情况则认为供试品在该浓度下存在 干扰作用。
04 若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对 试验有干扰，应将供试品溶液进行不超 过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
“合适”的样品是指样品必须不含有可测出的细菌内毒素。具体的讲就是在干 扰试验（或干扰试验的预试验）中用样品（或样品的稀释液）所做的阴性管（NPC管）不 能凝，如凝说明本批样品不适合用来做干扰试验。有部分实验者认为只要用家兔热原检查 结果阴性的样品就可用于干扰试验。这不可靠，因为家兔法不如细菌内毒素检查法灵敏， 不能保证在干扰试验（或干扰试验的预试验）中样品的细菌内毒素不被检出。
编号
内毒素浓度/被加 稀释用液 稀释倍 所含内毒素 平行管数
入内毒素的溶液
数
的浓度
A
无/供试品溶液
——
——
——
2
B
2λ/供试品溶液 供试品溶 1
2λ
2
液
2
1λ
2
4
0.5λ
干细胞细菌内毒素超标的可能原因
【干细胞细菌内毒素超标的可能原因】干细胞技术作为一项备受关注的生物医学领域，近年来取得了巨大的发展成就。
干细胞的应用范围越来越广泛，然而，在干细胞的应用过程中，细菌内毒素超标的情况时有发生，给干细胞研究和应用带来了很大的困扰。
那么，干细胞细菌内毒素超标的可能原因是什么呢？1. 操作不当导致的细菌污染在实验室中进行干细胞培养和扩增的过程中，如果操作不当，比如无菌操作规范不严、培养条件不合理等，就会导致细菌的污染，从而引发内毒素超标的问题。
实验室环境的卫生状况和操作人员的培训水平也会直接影响细菌污染的情况。
2. 原料污染在干细胞培养的原料中，比如培养基、添加剂等，如果存在细菌污染或本身就含有内毒素，就会成为细菌内毒素超标的潜在原因。
制备和储存这些原料的条件如果不合理也会导致原料污染，进而影响干细胞培养的质量。
3. 干细胞自身特性干细胞作为一种特殊的细胞类型，其生长特性和分化能力决定了在培养的过程中容易受到细菌内毒素的影响。
一些细胞培养过程中的压力条件、营养物质供应等因素也会影响干细胞对内毒素的敏感性，从而导致内毒素超标的情况。
4. 实验设备不合格实验室中的培养设备、检测设备如果不符合规范要求，就会影响到细菌内毒素的检测和控制。
不合格的设备可能会导致细菌内毒素超标的情况发生，带来一定的安全隐患。
总结回顾：在干细胞研究和应用过程中，细菌内毒素超标的问题一直是一个备受关注的难题。
要解决这一问题，就需要从操作规范、原料质量、细胞特性和设备条件等多个方面进行全面评估和控制。
只有加强对这些可能原因的监测和管理，才能更好地提高干细胞培养的质量和安全性。
个人观点：在解决干细胞细菌内毒素超标问题的过程中，需要加强实验室规范管理、培训操作人员、完善原料质量监控和优化培养条件等方面的工作。
加强相关法规的制定和执行力度，也是非常重要的。
这样才能更好地保障干细胞研究和应用的安全和可持续发展。
结语：干细胞细菌内毒素超标问题是一个复杂而严峻的挑战，需要科研人员共同努力，不断提高技术水平和安全意识，才能更好地推动干细胞研究和应用的进步。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素课件
•21
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•22
3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•11
2） 器皿的正确处理
2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水 分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用 自来水将残余的洗液洗净，再用蒸
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
活
鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH 力
在6.5-8.0；pH ≤3 或≥10时，
酶活性受到抑制。
PH
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
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PH对反应速度的影响:
影响酶原的激活；
影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的 活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构 使其变性失活。
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•29
谢 谢!
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
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•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•31
鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 标示值是否准确？
•细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
•2
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法(译自英国药典版，等同欧洲药典版。
见原文之附录BP2004EP5XIV A方法)2.6.14.本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法限度试验方法的制定者希望弄清楚，如在--.生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。
细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的(,,,试验)。
将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。
反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、和温度;反应要求有一定量pH 的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。
采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。
下面五种方法将在后面文章中介绍;方法:凝胶法;限度试验A方法:半定量凝胶法B方法:动力学浑浊法C方法:动力学发色肽方法D方法:发色肽终点法E当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法。
次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在A 专门文献中特别提到。
很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。
试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。
检测前的准备工作中，必须证实如下内容:1——所以的设备器皿不吸附内毒素。
——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的(定量法)。
——干扰素的排除;如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。
除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。
在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。
本试验包括如下试剂和标准溶液制备:标准细菌内毒素BRP;与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。
细菌内毒素检查常见干扰及消除
常见干扰及消除湛江安度斯生物有限公司2016年7月实验助手APP授权发布BET干扰的普遍性！70%！•一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围，在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行BET；有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除。
2干扰的表现•凝胶法ChP（2015年）规定无干扰条件：当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
3干扰的类型•抑制–供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性。
•增强–供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。
4光度法的判断？无干扰可接受范围：50%≤回收率≤200%抑制：回收率＜50%增强：回收率＞200%550%200%无干扰增强抑制鲎试剂内毒素 二价阳离子浓度不足聚集高渗透压酶、酶抑制剂LAL-RM 脂质体吸附洗涤剂表面活性剂pH值干扰的因素！pH值的影响鲎试剂中的酶需要在 pH值6~8的范围内才能正常反应，极端的pH环境影响酶的活性，造成抑制一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品的pH值的调节，但这不足以解决所有样品的pH问题测定以1:1为比例混合的样品稀释液+鲎试剂的pH值 以获得准确的pH值7解决有关pH的问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•用缓冲液制备供试品3•用酸、碱或缓冲液来调节pH8二价阳离子浓度不足Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg2+离子，内毒素将无法激活鲎试剂的酶。
供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），造成抑制常见的螯合剂有：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物等9解决二价阳离子浓度不足问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•使用含Mg 2+或Ca 2+离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂含量3•注意过高的二价阳离子（如Ca 2+）浓度可能会带来抑制10高渗透压问题较高浓度的糖或者盐通常会抑制鲎试剂反应，如50%葡萄糖或5%氯化钠溶液。
凝胶法细菌内毒素检查及干扰综述
凝胶法细菌内毒素检查及干扰综述细菌内毒素是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分之一，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。
凝胶法测定细菌内毒素，作为《中国药典》的“仲裁”方法，具有简单、经济、快速等特点，已成为细菌内毒素检查的常用方法。
但是凝胶法是一种基于鲎试剂中的多个酶蛋白在模拟的生理环境下进行的反应，反应过程中会受到各种干扰因素的影响。
1.凝胶法细菌内毒素的检查1.1细菌内毒素标准溶液的制备取标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，开启过程中注意防止玻璃碎屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解内溶物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后进行稀释，制备成对应浓度的细菌内毒素标准品溶液。
1.2加入样品取0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃碎屑落入瓶内。
八支鲎试剂每两支分为一组，第一组每支加入0.2ml检查用水溶解，作为阴性对照，第二组每支先加入0.1ml检查用水溶解，后加入制备好的标准品溶液0.1ml，作为阳性对照。
第三组每支先加入0.1ml检查用水溶解，后加入0.1ml的样品溶液。
第四组每支先加入0.1ml的样品溶液，后加入制备好的标准品溶液0.1ml。
最后分别轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
1.3孵育加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃恒温器中，确保安瓿瓶放入底部，保温60±2分钟。
1.4判断结果观察并记录结果。
将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，避免振动，每管缓缓倒转180°观察，2，4组管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱，为阳性，1，3组未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并能从管壁滑脱，为阴性。
表明该样品内毒素合格。
2.凝胶法干扰因素2.1 鲎试剂的干扰因素2.1.1PH值的影响鲎试剂与内毒素的反应是一个复杂的酶促反应，鲎试剂中的酶要求PH值在6-8的范围内才能正常反应，极端的PH环境会影响酶的活性。
内毒素检测方法
内毒素检测方法一、内毒素的检测方法常用的检测内毒素的方法有以下几种：1.凝胶法：通过鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）与内毒素发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶）的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
2.动态浊度法；浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
内毒素与鲎试剂中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原变成凝固蛋白（即产生凝胶），使液体的浊度发生变化，通过动态观察浊度变化速率检测。
3.终点显色法:通过由于细菌内毒素激活鲎试剂（鲎试剂中含有C 因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐），使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。
4.动态显色法:内毒素可激活鲎试剂引起一系列酶促反应，产生黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm），在一定时间内，动态观察对硝基苯胺（pNA）的生成量，与细菌内毒素浓度成正相关。
但此方法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
5.其他检测方法：还有一些直接测定内毒素定量的方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫学方法（如火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法等）等，这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化；还有一些间接测定的方法，如生物学方法利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF，通过间接测定IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量；化学发光法：应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量；流式细胞术：应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。
内毒素检测影响因素
关于细菌内毒素检查法中几个问题的探索本文是通过与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进行一次归纳总结。
通过工作中出现的问题有必要对以下三种情况进行交流，以加强对细菌内毒素检查法的正确理解，同时纠正一些错误的观念。
·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？·如何正确认识器皿洗涤的重要性？·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。
要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。
在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图1 鲎试剂与内毒素的反应机理1、pH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。
2、器皿：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。
因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。
同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。
操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。
3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。
许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。
G试验影响因素
一、假阳性影响因素 其他假阳性因素：
① 两性霉素B脂质体：作用于真菌细胞壁成分甘露聚 糖和甘露聚糖蛋白质复合体使之结构不稳定以致胞 壁破坏，可能造成G值增高； ② 哌拉西林：有临床反馈引起GM试验假阳性的药物哌 拉西林-他唑巴坦可以引起G试验假阳性； ③ 临床反馈美罗培南可以起血清葡聚糖水平升高； ④ 医用纱布引起G试验阳性结果。
IFI现状
检测项目 涂片培养检测 可操作性 简单 检测周期 >5d 检测成本 低 敏感性 低 <30% 特异性 一般 综合性评价 **
组织病理学检测
影像学检测 分子生物学检测 (PCR技术)
复杂
简单 一般
3d
2h 2h
较高
较高 高
高
低 高
低
低 低
*
* **
血清学检测 (G/GM试验)
简单
2h
低
高
一般
1.2 输注免疫球蛋白
文献表明静脉输入IgG 10g可使血浆G浓度升到达 300 pg/ml以上，足以误诊为侵袭性真菌感染（IFI）。
结论：免疫球蛋白可引起BG水平的大幅升高。
2. Ogawa, M, Int. J. Hematol, 2004, 80:97–98.
一、假阳性影响因素
2. 1 药物-克拉维酸
7.O. Albert, Eur J Clin Microbiol Infect Dis ,2011,30:1453–1460.
一、假阳性影响因素
4. 污染-血液透析与纤维素膜
因透析时使用的纤维素膜含有葡聚糖成分， 文献报道其可以引起BG水平的升高。
8. Kanda, H.,Kidney Int, 2001, 60:319–323.
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
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在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
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由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
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2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
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5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
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1） 器皿的选择标准
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二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
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2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
细菌内毒素检查结果准确性的 影响因素
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一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
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1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
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4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
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1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
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内毒素检测影响因素
1．有些物质对鲎试剂一内毒素凝胶反应有干扰作用，得出假阳性结果。
据报道：氨基酸、抗生素、碳水化合物、电解质、维生素、络合剂和添加剂产生抑制干扰；二价阳离子、右旋糖酐一40、鲎试剂反应物质、某些蛋白质、凝血酶等则能产生强化干扰得出假阳性结果。
2．葡聚糖的存在可致阳性结果，却不引起家兔发热，具有葡聚糖结构的物质包括血制品里的白蛋白、抗凝血酶、免疫球蛋白等故目葡聚糖及其类似物又称真菌多糖，这些成分在药品制备过程中有可能存在，此外．抗凝血酶、胰蛋白酶，免疫球蛋白、多棱苷酸、棕榈酰右旋糖酐磷酸盐、铜铵人造膜、纤维索膜等都能与TAL发生凝胶反应．导致实验结果的假阳性；
3．弃G因子鲎试剂排除了某些激活G因子这一旁路的干扰，使鲎试剂对内毒素发生反应具有专一性．去G因子鲎试剂即是一种只对内毒素起反应，而对r1—31一B—D—Glucan及类似物不起反应的鲎试剂因此．在有条件的情况下，采用去G因子鲎试剂，也是减少假阳性发生的有欢方法之～。
4．鲎试剂与内毒素的反应的最适宜pH值在6．5—8．0；TAL最佳反应pH值为6．5～7，低于5．7时TAL几乎没有反应活性，pH小于3或大于9时，酶的活性受到抑制，直接检查，甚至改变整个酶分子系统使其变性失活。
故鲎试验时，供试品pH最好应预调到6．5—7．0为好。