内毒素法
内毒素检查法凝胶法工艺流程
内毒素检查法凝胶法工艺流程
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中国药典内毒素检测方法
中国药典内毒素检测方法
中国药典（Chinese Pharmacopoeia,简称CP）是一个权威的药物
品质标准，旨在保证药品的质量和疗效。其中，内毒素检测是药品质
量控制中至关重要的一项。
内毒素（endotoxin）是一类存在于细菌细胞壁的生物大分子，主
要由脂多糖（lipopolysaccharide,简称LPS）组成。由于其高度的生
物活性和毒性，即使在极低的浓度下，内毒素也会引起严重的炎症反应，并且可能危及生命。因此，内毒素在制药过程中的检测至关重要，以保证药品安全有效。
中国药典对内毒素的检测方法主要包括两种：--细菌毒力试验和-
-内毒素检测试剂盒。下面将对这两种方法进行详细介绍。
细菌毒力试验（Bacterial Endotoxin Test,简称BET）是一种广
泛应用于内毒素检测的生物学试验方法。该方法通过使用内毒素敏感
的动物（如大鼠、兔子）或细胞（如兔子巨噬细胞）来评估药品中内
毒素的含量。基本原理是将待测样品与内毒素灵敏的试验物质相结合，
例如兔子血清或巨噬细胞。观察试验物质受损情况或动物的致死率，
以确定样品中内毒素的含量。
然而，细菌毒力试验存在一些局限性。首先，此种方法需要较长
的试验时间，从准备试剂到完成试验需要数小时至数天的时间。其次，需要大量动物或细胞，并会导致动物和细胞的伤害和死亡。另外，试
验结果具有一定的主观性，依赖于实验人员的判断和操作技巧。为了
克服这些缺点，CP中还提供了内毒素检测试剂盒的使用。
内毒素检测试剂盒（Endotoxin Test Kit）是用于内毒素检测的
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。
2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。
3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。
4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。
以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。
内毒素检测方法
内毒素检测方法
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的有毒物质，其存在会对人
体健康造成严重威胁。因此，及早发现和检测内毒素的方法至关重要。本文将介绍几种常用的内毒素检测方法，希望能对相关领域的
科研工作者和实验人员有所帮助。
首先，最常用的内毒素检测方法之一是内毒素检测试剂盒法。
这种方法的优势在于操作简单，结果快速。通常情况下，只需要将
待测样品加入试剂盒中，按照说明书进行操作，就能得到内毒素的
检测结果。然而，这种方法也存在一定的局限性，例如无法区分内
毒素的具体种类，只能判断内毒素的存在与否。
其次，内毒素检测的另一种方法是内毒素生物学检测方法。这
种方法通过利用生物学特性来检测内毒素的存在，例如利用小鼠或
大鼠来进行生物学反应检测。这种方法的优势在于能够检测到不同
种类的内毒素，并且结果比较准确。但是，这种方法也存在一些缺点，例如操作复杂、耗时较长，而且对实验动物的使用也存在一定
的伦理争议。
另外，还有一种常用的内毒素检测方法是内毒素生化检测方法。
这种方法通过利用内毒素与特定生化试剂的反应来进行检测，例如内毒素与内毒素结合蛋白的结合反应等。这种方法的优势在于能够定量检测内毒素的含量，结果比较准确。但是，这种方法也存在一些局限性，例如对实验条件要求较高，操作技术要求严格等。
综上所述，内毒素检测方法有多种，每种方法都有其独特的优势和局限性。在实际应用中，需要根据具体的实验目的和条件选择合适的内毒素检测方法。同时，也需要不断地探索和研究新的内毒素检测方法，以提高内毒素检测的准确性和效率，保障人体健康。希望本文所介绍的内毒素检测方法能够对相关领域的科研工作者和实验人员有所帮助，促进内毒素检测技术的不断进步和创新。
药典三部2015版-通则-1143细菌内毒素检查法
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素含量测定方法
内毒素含量测定方法
首先，巴氏法是一种常用的内毒素测定方法，它是利用内毒素对家兔或小鼠产生发热反应的原理进行测定。通过将待测样品与动物体内注射，观察动物是否出现发热反应来确定内毒素的含量。这种方法的优点是操作简单，结果可靠，但缺点是需要动物实验，且耗时较长。
其次，凝血酶原时间法是通过测定内毒素对凝血酶原的影响来确定内毒素含量的方法。内毒素能够激活凝血酶原，导致凝血酶原时间延长，通过测定延长的时间来计算内毒素的含量。这种方法的优点是结果快速，但需要高度纯化的内毒素标准品进行比较，且对实验操作者的技术要求较高。
另外，内毒素结合试验是一种体外测定内毒素含量的方法，通过将内毒素与其结合蛋白结合后加入特定细胞，观察细胞是否发生溶解来确定内毒素的含量。这种方法的优点是无需动物实验，结果快速，但需要高度纯化的内毒素和结合蛋白。
除了上述方法外，近年来还出现了一些新的内毒素含量测定方法，如基于免疫学原理的快速检测方法和基于生物传感器的测定方
法等，这些方法在操作简便、结果快速等方面有着一定的优势。
总的来说，内毒素含量的测定方法多种多样，每种方法都有其
适用的场景和局限性。在选择合适的测定方法时，需要根据具体的
实验要求和条件进行综合考虑，以确保测定结果的准确性和可靠性。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内
毒素检查法
标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
1143 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于
0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法
1 简述
1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定
1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；
1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：
L=K／M
式中
L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定
供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：
MVD＝CL/λ
L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
细菌内毒素检查法标准操作规程
细菌内毒素检查法标准操作规程
目的：
建立细菌内毒素检查的基本操作，为细菌内毒素检查人员提供正确的操作规程。
2.依据：
《中华人民共和国药典》2000年版二部。
3.范围：
本标准适用于细菌内毒素检查的操作。
4.职责：
QC细菌内毒素检查人员对本标准的实施负责。
5.程序：
5.1. 定义：
5.1.1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，
以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
5.1.2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定
其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。
5.1.4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24
小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
5.2. 实验设备：电热干燥箱（50~300±1）℃、电热恒温水温箱。
实验用具：注射器(精度0.02ml)、针头、试管架、白胶布、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、注射器盒、时钟。
试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。
5.3. 用具除热原：试验中所用的试管、注射器、针头、金属直镊等冲洗干净，置电热干燥箱中（注射器、针头、金属直镊等放入注射器盒中封好，再放入干燥箱中），经250℃加热30分钟，除去热原。
内毒素方法验证方案
一、验证目的
确保氯化钠注射液细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
二、适用范围
适用于本公司氯化钠注射液的细菌内毒素检测方法。
四、内容
1 实验材料及用具
1.1电子天平
1.2电热恒温干燥箱
1.3试管恒温仪
1.4水银温度计
1.5旋涡混合器
1.6鲎试剂
供应商:
批号：
灵敏度：
规格：
1.7细菌内毒素国家标准品
供应商:中国药品生物制品检定所提供
批号：
效价：
1.8细菌内毒素检查用水
供应商:
批号：
规格：
1.9实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。
2 实验准备
2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用生活饮用水将残留洗液彻底洗净，再用注射用水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中，然后放置入电热恒温干燥箱。
2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置电热恒温干燥箱后，将电热恒温干燥箱调至250℃，待电热恒温干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待电热恒温干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用,否则须再次干烤。
3 具体验证步骤
3.1鲎试剂灵敏度复核
3.1.1目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确，并考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
3.1.2操作方法
3.1.2.1细菌内毒素标准溶液的制备
将1支细菌内毒素标准品（140EU/支）完全溶解于1ml细菌内毒素检查用水中(置漩涡混合器上混合15分钟)，其浓度为140EU/ml，用这个浓度连续稀释制备1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml (每步稀释过程均应在旋涡混合器上混合30秒钟)四个浓度的细菌内毒素标准浓度。
2000年版中国药典 《细菌内毒素检查法》
E. 细菌内毒素检查法
中国药典2000年版二部附录
本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。以细菌内毒素国际标准品为基准，经过协作标定，使其与国际标准品单位含义一致。细菌内毒素国家标准品用于标定细菌内毒素工作标准品和标定、仲裁鲎试剂灵敏度。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量的相当效价。每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。细菌内毒素工作标准品用于鲎试剂灵敏度测定及试验中的阳性对照。
试验准备
试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃或180℃干烤适当的时间，也可用其它适宜的方法。试验操作过程应防止微生物的污染。
鲎试剂灵敏度复核
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ<[b]>),将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素检查用水①溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度,即2λ<[b]>、λ<[b]>、0.5λ<[b]>和0.25λ<[b]>备用，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟，按“检查法”项下试验,每一稀释液平行做4管,如最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度测定值(λ<[c]>)。
ΣX λ<[c]>＝log<-1>───
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法.
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法.供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准.
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0。005EU/ml（用于光度测定法）,且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6。0～8.0的范围内为宜,可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值.酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制.缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素检测方法
内毒素检测方法
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的毒素，它对人体和动物的健康造成严重危害。因此，对内毒素的检测显得尤为重要。本文将介绍几种常见的内毒素检测方法，希望能够对相关领域的研究人员和实践者提供一些帮助。
首先，最常用的内毒素检测方法之一是内毒素检测试剂盒法。这种方法简单易行，无需复杂的实验设备和操作技术，适用于实验室和野外条件。通过将待测样品与内毒素检测试剂盒中的试剂发生反应，根据颜色变化或者光学密度的变化来判断内毒素的含量。这种方法操作简便，结果直观，因此被广泛应用于内毒素检测领域。
其次，生物学法也是一种常见的内毒素检测方法。生物学法主要是利用动物或
者细胞对内毒素的反应来进行检测。例如，利用小鼠腹腔注射待测样品，观察小鼠的生理反应来判断内毒素的毒性。这种方法对内毒素的检测非常敏感，但是由于涉及动物实验，受到了伦理和法律的限制。
另外，生物传感器技术也在内毒素检测领域发挥着重要作用。生物传感器是一
种能够将生物信息转化为可测量的信号的装置，利用生物传感器可以实现对内毒素的高灵敏度检测。通过改变生物传感器的生物识别元件，可以实现对不同类型内毒素的检测，具有很高的应用前景。
最后，分子生物学方法也是内毒素检测的重要手段之一。PCR法和基因芯片技
术可以实现对内毒素基因的检测和分析，从而判断样品中是否存在内毒素。这种方法具有高度的特异性和灵敏度，能够准确地检测出内毒素的存在，并且可以对内毒素的种类进行鉴定。
综上所述，内毒素检测是保障食品安全和医药卫生的重要环节，各种内毒素检
测方法各有优劣。在实际应用中，可以根据具体的情况选择合适的方法进行检测。希望本文介绍的内毒素检测方法能够为相关领域的研究和实践提供一些参考，推动内毒素检测技术的发展与进步。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
美国药典细菌内毒素法27版中文
生物检测实验
<85> 细菌内毒素检测
♦本文中部分内容与欧洲药典和/或日本药典的相应的内容是一致的，那些不一致的内容则用符号（♦♦）标明。♦
本文提供一种检测或定量可能出现在样品中的细菌内毒素的实验，它使用从鲎（美洲鲎或东方鲎）的循环阿米巴细胞的抽提液中制备的鲎试剂。♦1
细菌内毒素实验有两种技术：基于凝胶形成的凝胶法和光度测定法。后一种方法包括浊度法——基于一内源性基质断裂后的浊度变化；和显色基质法——基于一个带有生色团的合成肽断裂后颜色的变化。除非文中另有说明，否则可用上述方法中的任何一种。若检测结果存在争议，除非文中另有说明，以凝胶法结果为准。
在凝胶法技术中，反应的终点是将供试品稀释液与平行稀释的参考内毒素进行直接比较得到的，内毒素的量用USP内毒素单位（USP-EU）表示。[注：1 USP-EU等于1 IU 的内毒素]
由于有专门制备的浊度法或显色法鲎试剂，因此也可按照要求使用这些检测方法。这些试验方法要求先建立一条标准回归曲线，供试品的内毒素含量通过该曲线求得。试验过程包括将内毒素和对照溶液与鲎试剂的反应管按照预先设定的时间恒温孵育，以及在适当波长用分光光度计读取吸光度。在终点浊度法检测中，孵育期结束时应立刻读取读数；在终点显色法检测中，在到达预先设定的反应时间时，添加酶停止反应试剂使反应停止后再读取读数。在动态浊度和显色法中，在整个反应期间始终对光密度的进行测定，而百分比值是通过这些读数来确定的。
器械和玻璃用具
所有玻璃用具和耐热材料应置于热空气烤箱中有效除热原，♦2通常使用的最少时间和最低温度为30分钟，250℃。如果使用塑料用具，如微孔板和自动加样器配套的吸头之类的，应确认其不含可测内毒素并不会干扰试验。 [注：在这一章中，“管”这个词泛指其它任何容器，如微量孔板的孔]
内毒素方法开发
内毒素方法开发
内毒素是一种毒性蛋白质，它可以抑制细胞的生长和增殖，并对细胞的正常功能产生不利影响。内毒素的研究可以帮助我们了解细胞的生物学机制，以及疾病的发生和发展。
内毒素方法的开发是研究内毒素的重要手段，它可以帮助我们更好地了解内毒素的毒性机制，以及它们如何影响细胞的生长和增殖。
内毒素方法的开发主要包括两个方面：一是研究内毒素的毒性机制，二是研究内毒素的生物学效应。首先，研究内毒素的毒性机制，可以通过研究内毒素的结构和功能，以及它们如何与细胞结构和功能相互作用，来了解内毒素的毒性机制。其次，研究内毒素的生物学效应，可以通过研究内毒素如何影响细胞的生长和增殖，以及它们如何影响细胞的正常功能，来了解内毒素的生物学效应。
内毒素方法的开发是研究内毒素的重要手段，它可以帮助我们更好地了解内毒素的毒性机制，以及它们如何影响细胞的生长和增殖。此外，内毒素方法的开发还可以为研究疾病的发生和发展提供重要的研究依据，从而为疾病的预防和治疗提供有效的指导。
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细菌内毒素检查法标准操作规程
1 目的
建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。
2 范围
适用于细菌内毒素的检验操作。
3 职责
3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责；
3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。
4 定义
无
5 内容
5.1 概述与原理
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。
细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。
5.2 仪器与用具
5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。
5.2.2 细菌内毒素标准品
细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。
5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。
5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。
5.2.5 试验器具
5.2.5.1 试管，称量瓶、取样勺等内毒素检查所使用的器具洗净后，需经250℃干热灭菌30分钟以上，以去除可能存在的外源性内毒素。
5.2.5.2 微量移液器或移液关等需使用量程的，需经过校验，符合试验要求。5.2.5.3 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用表明应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
5.2.5.4 恒温水浴锅：试验开始前应先把恒温水浴锅温度调到37℃，进行预热。
5.2.5.5 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在
6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用适宜的酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子
5.3 鲎试剂灵敏度复核试验
5.3.1 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
5.3.2按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
5.3.3 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。
5.3.4将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
5.3.5将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min±2min。
5.3.6将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（十）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。保温和拿取试管过程应避免受到振动,造成假阴性结果。
5.3.7 试验结果计算
当最大浓度2λ的4管均为阳性，最低浓度0.25λ的4管均为阴性，阴性对照为阴性时试验认为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λC=lg-1(∑X/4)
注：式中X为反应终点浓度的对数值（1g），反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
5.3.8 结果判断
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
5.4 干扰试验
药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时用以验证供试品是否存在干扰作用。
5.4.1 干扰试验预试验
预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰试验提供依据。
5.4.1.1 将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD＝cL∕λ。
5.4.1.2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。保温（60±2）min后，观察并记录结果。
5.4.1.3 结果判断
5.4.1.3.1当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验为有效。
5.4.1.3.2当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。
5.4.1.3.3当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在于扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD＝CL∕λ），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。