内毒素的检测

主要实验材料
1.大肠杆菌，白色葡萄球菌培养物 2.含抗生素的滤纸片：
青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素 3.普通平板，细菌接种工具，培养箱
方法步骤
1.标记分区； 2.密涂接种； 3.贴药敏纸片； 4.培养； 5.结果观察。
1.标记分区
2.密涂接种
3.贴药敏纸片
4.培养
置37℃温箱， 培养18-24h。
酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的 铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 [方法]
分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培 养基中。37℃孵育24小时后观察结果。
[结果]
沿穿刺线部位呈黑褐色， 表明有硫化氢产生，为阳性以 H“2S +”表示，不变色者为阴性，
试验
以“-”表示。 大肠杆菌：变形杆菌：+
微量细菌生化鉴定管
[方法]
取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒 立小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小 时，观察结果。
[结果]
1、确定细菌是否生长 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”
表示。 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气
泡，用“ ”表示。 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”
红 试
红色为阳性，+
验
不出现红色为阴性，-
对照
大肠杆菌：+ 产气杆菌：—
3. V－P试验 葡萄糖
丙酮酸
乙酰甲基甲醇
V-P试
二乙剂酰 与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基 反应生成红色化合物
培养基变红 产气杆菌
[方法]
取出试管培养物，加入等量的李氏试剂，摇匀后 不加塞，静置30分钟观察结果。
阴性
阳性
[结果]
表示。
糖 发 酵 实 验
大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌
葡萄糖
+
乳糖
-
-
（二）IMViC试验
• 是一组试验 • 靛基质试验或称吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V
－P试验（V）和枸橼酸盐利用试验（C）可缩写为 IMViC试验，i是为了发音的需要加入的。 • 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中，可区分产气杆菌属 和大肠杆菌属 • 大肠杆菌＋＋－－；产气肠杆菌－－＋＋； 伤寒杆菌-＋－－； 痢疾杆菌-＋－－。
实验三
一、内毒素的检测 二、药敏试验 三、肠道杆菌的鉴定
• 目的
一、内毒素的检测
1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.熟悉内毒素实验的意义。
检测方法
• 家兔发热法：比较烦琐，且灵敏度不高；
• 鲎实验法：灵敏度高，可检测小于10ng/ml 的内毒素。
鲎
horseshoe crab
原理： 鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细 胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。
VBaidu Nhomakorabea 试
验
红色为阳性，+
大肠杆菌：— 产气杆菌：+
无红色为阴性，-
4. 枸橼酸盐利用试验
培养基
枸橼酸盐
铵盐
碳酸盐
氨
培养基pH上
升
溴麝香草酚蓝
呈碱性变色
培养基变蓝
产气杆菌
[结果]
深蓝色为阳性+
绿色为阴性-
枸 橼 酸 利 用 试 验
大肠杆菌：— 产气杆菌：+
（三）硫化氢产生试验
[原理] 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨
1. 吲哚试验
[原理]
色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中，某些细菌含色氨 酸酶，能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质（吲哚）。 后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形成红色。
[方法]
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中， 37℃培养24－48小时取出，在上述细菌的培养液内各加 入寇氏试剂数滴，略加振摇，静止半分钟后观察结果。
结果： 实验组出现凝固
对照组不出现凝固
内毒素检测的应用：
1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素；
2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的内毒素血症（内毒素休克）等。
二、药 敏 试 验
目的要求
1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定； 2.了解药敏试验的操作方法和意义。
原理
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂 平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解 后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度 梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被 抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试 菌对测定药物的敏感程度。
五、 结果
抑菌圈直径
操作内容
1.两人1个平板 2.密涂接种大肠杆菌，贴片，标记及培养
三、肠道杆菌的鉴定
采集标本
病
增菌培养
分离培养
革兰染色
原
菌
革兰染色
接种琼脂斜面纯培养
的
检 验 程
观 察 菌 落 特
生 化 试 验
血 清 学 试 验
动 物 试 验
序
征
分析鉴定
细菌的生化反应
• 概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代 谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化 反应试验。
[结果]
大肠杆菌为阳性 伤寒杆菌为阴性
阴性 阳性
2.甲基红试验
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
乙酰甲基甲醇（中性）
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红 大肠杆菌
pH＞5.4
甲基红试剂
培养基橘黄色
产气杆菌
[方法]
在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂 数滴，立即观察结果。
阳性
阴性
[结果]
甲
基
内毒素（LPS）
凝固酶原
凝固酶
激活
凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解状态） （凝胶状态）
• 材料： 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管
方法：（每四人两支鲎试剂，一支实验一支对照）
实 验
对 照
0.1ml溶解水+0.1ml内毒素 0.2ml溶解水
垂直放入37℃温箱，20-30分钟观察结果。
二、肠道杆菌的鉴定
实验目的： 1.熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程； 2.进一步熟练掌握革兰染色的操作； 3.学会在选择培养基中进行菌落的观察； 4.掌握肠道杆菌在双糖铁培养基上的生长
• 意义：是鉴别细菌的重要依据。
糖发酵试验
碳水化合物
甲基红试验
代谢试验
V-P试
生 碳源和氮源 化 利用试验
验 枸橼酸盐利用试验
IMViC试 验
反 应
蛋白质和氨基
吲哚试验
酸代谢试验
硫化氢试验
各种酶类试验： 尿素酶实验
抑菌试验
（一）糖发酵试验
[原理] 根据细菌分解利用糖能力的差异
表现出是否产酸产气作为鉴定菌种 的依据。是否产酸，可在糖发酵培 养基中加入指示剂溴甲酚紫（其 pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以 上呈紫色），经培养后根据指示剂 的颜色变化来判断。是否产气，可 在发酵培养基中放入倒置杜氏小管 观察。