小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良解读
敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖
敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞【摘要】细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1 作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道.构建Wdr1 条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况.PCR 结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre 小鼠模型构建成功.免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞.细胞形态观察结果显示:Wdr1 敲除后对细胞的形态有显著性影响.同时,划痕实验以及 CCK8 检测结果也表明:Wdr1 的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖.Wdr1 敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)012【总页数】7页(P179-185)【关键词】条件性诱导敲除小鼠;WDR1;平滑肌细胞;增殖;迁移【作者】袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞【作者单位】武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065【正文语种】中文尽管心血管疾病的预防、诊断和治疗方面取得了重大进展，但其仍为全球范围内主要的死亡原因［1］。
动脉粥样硬化是动脉粥样斑块积聚引起的以动脉管腔狭窄为主要特征的一类疾病，是大多数心血管疾病的表现并可导致心肌梗塞或中风［2］。
平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）构成了血管的主要细胞组成，也是血管病理过程的重要参与者，在动脉粥样硬化过程中伴随着平滑肌细胞的增殖、迁移等过程，且平滑肌细胞和巨噬细胞会吞噬脂质进而变成泡沫细胞［3］。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【摘要】目的:建立一种简单、高效的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)原代培养方法及体外钙化模型.方法:采用改良的组织贴块法培养小鼠VSMCs,经免疫荧光染色法鉴定后,将细胞随机分为对照组和钙化组.采用yon kossa染色及比色法检测两组细胞内钙含量.结果:培养3～5d时,可见细胞从组织块边缘爬出,7～10d后细胞融合成片;免疫荧光染色显示胞质表达特异性α-肌动蛋白;VSMCs培养至第2代细胞纯度达95％;与对照组相比,钙化组细胞的钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性明显增加(P均＜0.05).结论:改良的组织贴块法可获得高纯度的小鼠VSMCs;β-甘油磷酸钠在体外可有效诱导其钙化.%Objective:To establish a simple and efficient method for primary culture of mouse aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) and calcification model in vitro.Methods:The primary VSMCs were harvested by modified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCs were randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cells was assayed by von kossa staining and colorimetry method.Results:VSMCs migrated from explants of mouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days,VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specific mAb against mouse α-actin demonstrated VSMCs were positive.The cell purity of the 2nd generation of VSMCs was over 95％.Compared with the control group,the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly (both P ＜0.05).Conclusion:The method of modified explant-culture successfully established a effective model for primary culture of VSMCs,of which calcification in vitro could be induced by β-glycerophosphate.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(024)002【总页数】4页(P110-113)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;钙化【作者】徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【作者单位】江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R543血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要组成部分，通过协调血管收缩和舒张，控制血管压力和流速。
小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定
小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定范晶晶【摘要】To study a new simple mechanical method for the isolation and culture of Mouse myometrial smooth cells （mMSMCs） in order to provide a experimental model for study the physiology and pathology of MSMCs. A new mechanical method was used to isolate mouse myometrial smooth. And then type Ⅰ collagenase and trypsin were used to isolate mMSMCs. More than 90%of the dissociated cells exhibited initial viability. The surviving cells were observed by phase con- trast microscope and verified by immunofluorescence staining. After 3 days of incubation, primary cultures of cells attached the wall of the incubation dishes, and reached confluence with 2 weeks. The cells grew with spindle--shape and showed typi- cal ＂hill-valley＂ pattern under phase contrast microscope. Immunofluorescence staining for smooth musclea--actin shewed positive reaction in more than 98% attached cells. The mMSMCs cultured in this experiment survive well, with highly puri- ty, and can serve the further studies of physiology and pathology.%为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型，试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。
吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
小鼠阴茎血管平滑肌细胞介导ED的研究
小鼠阴茎血管平滑肌细胞介导ED的研究近年来，随着人们生活水平的提高，男性勃起功能障碍的发病率也越来越高。
勃起功能障碍，也即勃起功能障碍症，或称为阳痿，是指男性在性兴奋和心理刺激下，无法使阴茎勃起硬度足以完成性交，或勃起持续时间不足以完成性交，造成男性性生活满意度下降。
根据研究发现，勃起功能障碍并非是单一的疾病，它可能由许多因素导致，其中包括糖尿病、高血压、精神疾病和代谢疾病等等。
然而，最近的研究表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞可能是导致勃起功能障碍的一个重要因素。
下面我将就此进行深入介绍。
一、小鼠阴茎血管平滑肌细胞的作用小鼠阴茎血管平滑肌细胞是组成阴茎海绵体的主要 cell 类型。
阴茎海绵体是阴茎内的一个柔性组织，其内有很多的血管，平滑肌细胞位于海绵体内部的血管壁上。
经实验表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的收缩和松弛状态是影响勃起功能的一个重要因素。
二、小鼠阴茎血管平滑肌细胞与勃起功能障碍的关系勃起功能是阴茎在性刺激下的生理反应，其主要是由阴茎海绵体平滑肌细胞的松弛所引起的。
近年来，许多研究表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能异常可能导致勃起功能障碍的发生。
具体表现为：在小鼠阴茎血管平滑肌细胞中，缺少了一种名为 ROS 的分子，这个分子可以促进平滑肌细胞的松弛。
缺失 ROS 分子，就会使得海绵体中的平滑肌细胞不能完全舒张，继而影响勃起功能。
此外，多项研究发现，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的变性也可能导致勃起功能障碍的发生。
三、研究小鼠阴茎血管平滑肌细胞的机制由于小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能与勃起功能紧密相关，因此研究其机制非常重要。
从细胞的角度来看，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能主要受到几种分子的调控。
比如，一些 vasoactive 的分子，比如硝酸酯类化合物和孕胎素等，可以作为平滑肌细胞舒张剂，从而增强勃起功能。
而另外一些物质，比如 G-蛋白和磷脂酰肌醇三磷酸等，都可以调节小鼠阴茎血管平滑肌细胞的兴奋和缩放。
改良组织块贴壁法培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞及生物学鉴定
分 离小 鼠胸 、 腹主动脉 ， 采 用 改 良组 织 块 贴壁 法 获得 主 动脉 ＶＳ ＭＣ， 胰 蛋 白酶 消化 传 代 ， 差 速 贴 壁
科 学研 究 提 供 实验 材 料 。 方 法
法进行细胞纯化 ， 倒 置 相 差 显 微 镜 观 察 细 胞 形 态及 生 长 情 况 ， 并 用 苏木 素一 伊 红（ ＨＥ ） 染 色法 和 免 疫 荧光 法进 行 鉴 定 。 结 果 该 方 法 成 功 分 离 出小 鼠 主 动 脉 Ｖ Ｓ ＭＣ， 细胞 生 长 旺盛 ， 活 性 良好 ， 呈放 射 状 、 典型“ 峰一 谷” 样 生长 ， ＨＥ 染 色细 胞 呈 梭 形 ， 细胞 质 丰 富 ， 核 大而圆形或椭圆形， 细 胞 免 疫 荧光 显 示 特 异 性 的 细 胞 质 内 平 滑肌 肌 动蛋 白 阳性 表 达 。 结论 本方法简单、 经济 、 可靠， 可 在 体 外
血管平滑肌细胞原代培养
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞成分，具有调节血管管径和维持血管壁稳定的重要作用。
血管平滑肌细胞的原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的常用方法之一，同时也是研究血管再生和维修的基础。
1. 材料（1）动物组织：小鼠主动脉、人体脐带血。
（2）DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、0.1%胶原酶、1%抗生素-抗菌素、无菌PBS。
（3）T-25培养瓶、15毫升离心管、1毫升离心管、细胞计数板、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、培养皿等。
2. 方法①用消毒剂清洁手部等操作区域，将小鼠主动脉取出，去除外膜和内膜，将中层切成0.5毫米大小的小块。
②将小鼠主动脉碎片与0.25%胰酶和0.1%胶原酶混合液在37℃下消化3小时。
③将消化液离心，将沉淀用DMEM培养基混合后分装在T-25培养瓶中，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗菌素。
④将培养瓶放置在37℃的细胞培养箱中培养，每天更换一次培养基，至细胞达到80%-90%的密度时进行传代。
①将人脐带血收集入无菌离心管中，用相同容量的PBS混合，离心15分钟，去除上清液。
3. 结果经过数天的培养，小鼠主动脉或人脐带血管平滑肌细胞可在培养瓶中生长形成典型的“山川”式形态，细胞密度逐渐增加。
细胞在培养基中会分泌胶原和纤维蛋白等胶原成分，这些成分有助于维持细胞外基质的稳定性和促进细胞分裂生长。
经过多次传代后，细胞的生长速度将明显加快，并且会逐渐转化为诱导型平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白和舒张激肽受体等标记物质。
4. 结论血管平滑肌细胞原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的重要方法。
通过原代培养可以维持细胞的稳定生长，并且可以进行多次传代，以获得更多的细胞，更好地研究细胞功能。
本实验采用小鼠主动脉和人脐带血作为来源，通过胰酶和胶原酶的消化分离获得血管平滑肌细胞，然后进行培养，可得到较为纯净的细胞。
在培养的过程中，需要注意细菌、真菌和病毒的污染，以及细胞的密度和培养基的更换等。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法，从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
血管平滑肌细胞原代培养
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是一类组成血管壁的细胞，对调节血管的收缩和扩张起着重要作用。
其原代培养是进行相关功能和分子机制研究的必要手段之一。
本文将从原代培养的优点，培养方法，细胞检测和应用等方面进行介绍。
一、原代培养的优点血管平滑肌细胞原代培养是从组织中分离出血管平滑肌细胞，并在体外环境中进行繁殖和生长的过程。
相比于细胞系，原代培养有以下优点：1.细胞纯度高；2.种群亲缘关系稳定；3.细胞表型稳定；4.研究结果具有可靠性和可比性；5.研究范围广泛。
二、血管平滑肌细胞原代培养的方法血管平滑肌细胞原代培养主要包括以下步骤：1.组织的消化和细胞的分离；2.细胞培养和子培养；3.细胞的验证与鉴定。
1.组织的消化和细胞的分离组织消化是细胞培养基础环节，主要利用一些酶类消化酶溶解组织细胞膜上的蛋白聚糖，使得以上葡萄糖酸、胶原酶等酶能够快速地分离出单个的细胞。
其中，血管平滑肌细胞的消化方式一般有两种：机械法和消化法。
机械法是使用刀片或振荡器等器械将组织切碎，并筛选出合适的细胞；消化法则是将组织切成小块，利用酶类溶解器，如胰蛋白酶、胶原酶等消化液，将细胞释放出来。
2.细胞培养和子培养细胞培养是指将原代培养得到的细胞在适切的培养条件下持续维持生长状态的过程，包括培养基的配制、细胞的分离和接种、试验原理与评价、细胞状态的维持以及检测鉴定等一系列过程。
此过程需注意的问题有细胞的密度、培养时间、细胞饱和度及细胞的分裂活性等。
3.细胞的验证与鉴定细胞原代培养过程中，细胞的鉴定与验证能够大致分为两个方面：构象和分子水平。
其中包括细胞表型的检测与鉴定、细胞的生长状态，如细胞生长曲线、生长速率以及细胞周期等标定，以及细胞的弹性、细胞结构性质等重要参数的检测。
三、血管平滑肌细胞原代培养的应用血管平滑肌细胞原代培养的应用范围较广，除了常见的药理学实验外，主要应用于以下方面：1.血管病理生理研究方面血管平滑肌细胞在血管病理生理研究中发挥着重要作用。
关于小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定
关于小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定【摘要】目的探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法，为进一步实验研究提供相应的技术手段。
方法手术显微镜辅助下取小鼠主动脉，去除外膜及脂肪组织，将血管剪成1 mm×1 mm大小的组织块，用植块法在含20% 胎牛血清的DMEM培养液中培养。
倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征，免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor，vWF）鉴定。
结果60 h后，相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出，12天左右细胞开始融合成片，免疫染色相关抗原检测呈阳性。
结论用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。
【关键词】小鼠血管内皮细胞原代培养Abstract： Objective To develope an efficient protocol for the isolation and culture of vascular endothelial cells from mouse aorta. Methods The aorta was removed from mice under an operation microscope，with the periadventitial fat and connective tissue cleared of carefully. The vessel was opened longitudinally and cut into small 1 mm×1 mm cubes. The cubes were placed on six-well plates with the intima side down and covered with a little DMEM containing 20% fetal bovine serum. The cell growth was evidenced by revealing the morphological characteristics and immunological marker VIII factor (or von Willebrand factor， vWF). Results Endothelial cells were found migrate out of the aortic cubeafter 60 h， forming confluent monolayer of a cobblestone pattern when observed under inverted phase-difference microscope about 12 days later. Immunohistochemical labeling showed the characteristic positive reaction to vWF in the cytoplasm of the new cells. Conclusion A reliable methodis described to isolate and propagate vascular endothelial cells from mouse aorta by cultivating small tissue cubes.Key words: mice；vascular endothelial cells； culture在异种器官移植中，移植物血管内皮细胞是受体血流首先接触的组织，也是受体抗体攻击的主要靶细胞［1］。
小鼠主动脉平滑肌细胞原代培养常见问题及处理对策
狭 窄等心血管疾病的核心病理变 化， 以Ｖ Ｓ ＭＣ 为 实 验 对 象 ， 研 究调控 Ｖ Ｓ ＭＣ增 殖 及 迁 移 的 信 号 转 导 机 制 ， 以及寻 找 Ａ Ｓ和 Ｐ Ｃ Ｉ 术 后 再 狭 窄 的分 子 治 疗 靶 点 是 目前 研 究 的重 点［ １ ］ 。因此 ， 提高 Ｖ Ｓ ＭＣ培 养 成 功 率 ， 增强细胞生物 学活性 ， 保 证 细 胞 质 量 是 进 行 分 子 生 物 学 研 究 的 重 要 基 础 。 在 利 用 组 织 块 贴 壁 法 培 养 小 鼠 主 动 脉 ＶＳ ＭＣ过 程 中 ， 作者通 过实践和摸 索， 对 Ｖ Ｓ ＭＣ 原 代 培 养过 程 中 常 见 问 题 进 行 了 分 析 ， 提 出了解决方 法 ， 现 综
细胞 爬 满 瓶 底 还 是 选 择 进 行 传 代 是 大 多 数 初 次 原 代 培 养 者 面
临 的一 个 问题 。笔 者 尝 试 过 继 续 观 察 等 待 细 胞 爬 面 瓶 底 。 发 现 原来 细胞 生 长 密 集 的地 方 ， 细胞 已经融合成 一 片， 细 胞 形 态 不
规则 ， 部 分 细 胞 已 经 老 化 。经 胰 酶 消 化 后 细 胞 抱 成 一 团 ， 很 难
过 程 中要 注 意无 菌操 作 ， 器具不 能交叉使 用 ， 所 使 用 的 培 养 基 和 平 衡 盐 溶 液应 含 １％青 霉 素 、 链 霉素［ ２ ］ 。
述于下 。 Leabharlann 孔内的组 织块 上， 迫使组 织块贴 壁。在原 代培养 前 ３天 ， 切勿
轻 易 挪 动 培养 瓶 ／ 板， 因为 培 养 液 的晃 动 容 易 导 致 组 织 块 松 动 、 漂 浮 。在 原代 培 养 第 ４ 、 ５天 可 首 次 换 液 ， 吸 取 废 液 和加 入 液 体 时 动 作要 缓 慢 ， 避 免 将 已贴 壁组 织块 从 壁 上 脱 落 下 来 ［ ５ ］ 。
小鼠主动脉平滑肌细胞的培养
小鼠主动脉平滑肌细胞的培养
周晓莉;雷寒;柳青
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2005(025)006
【摘要】目的建立一种小鼠主动脉平滑肌细胞体外培养方法,为相关疾病的研究提供实验材料.方法采用组织贴块法、胰酶消化法进行细胞原代及传代培养,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并通过形态学特征及免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果90%的组织块接种存活,第5代的平滑肌细胞纯度达98%以上.相差显微镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫细胞化学染色显示特异的α平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论本法简便、可靠,培养的平滑肌细胞纯度高、性能好.
【总页数】4页(P564-567)
【作者】周晓莉;雷寒;柳青
【作者单位】重庆医科大学,第一医院心内科,重庆,400016;重庆医科大学,第一医院心内科,重庆,400016;重庆医科大学,第一医院中心实验室,重庆,400016
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.11
【相关文献】
1.表达人载脂蛋白AI小鼠主动脉平滑肌细胞的培养及意义 [J], 谷素敏;李汇华;佘铭鹏
2.改良组织块贴壁法培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞及生物学鉴定∗ [J], 何蔺;刘涛;王浩宇;任丽蓉
3.小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定 [J], 辛教;张耀中;林筝;张颖;秦彦文
4.小鼠主动脉平滑肌细胞原代培养常见问题及处理对策 [J], 倪伟
5.家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖 [J], 徐仓宝;张亚萍;王亚文
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改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养
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医 研 杂 ２１ 月 学 究 志 ０ 年１ 第４卷 第１ １ Ｏ 期
・ 论
善 ・
改 良大 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 的 原 代 培 养
丁洪飞 黄胜超 李建文 陈 小 东 陈 宝英 吴 平
摘 要 目 的 探 讨 提 高 大 鼠 血管 平 滑 肌 细 胞 原 代 培 养效 率 的方 法 。方 法 采 取 组 织 块 贴壁 法进 行 原 代 培 养 ， 糖 Ｄ Ｅ 高 Ｍ Ｍ
酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞
２ ０ １ ３ 年第 ２ ６ 卷第 １ ３ 期
Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎ ｏ ｒ ＆Ｐ ｒ ａ ｃ网 １ ６ ８ １
酶联合消化法培养小 鼠主动脉 平滑肌原代细胞
倪 伟 刘 涛 王浩宇 刘丽华 陈桂秀 周振宇
ａ ｌ ｉ ｃ ｅ ． Ｃｏ ｎ ｌｕ ｃ ｓ ｉ ｏ ｎ ： Ｔｈ ｉ ｓ ｎ ｅ ｗ ｍｅ ｔ ｈ ｄ ｏ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｃ ｏ ｎ ｓ ｉ ｄ ｅ ｒ ａ ｂ ｌ ｅ ｎ ｕ ｍｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ － ｐ ｕ ｒ ｉ ｔ ｙ ａ ｏ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ｍｏ ｏｔ ｈ ｍｕ ｓ ｃ ｌ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ．
状生长， 平行排列呈峰谷状， 免疫荧光显示胞浆内 Ｓ ＭＡ蛋白表达阳性。结论。 该酶联合消化法可在体外短时间内
获取数量可观 、 高纯度 的主动脉平滑肌 细胞 。 关键词 小 鼠 血管平 滑肌 细胞 原 代培养 酶消化 中图分类号 ： Ｒ ３ ２ ９ ． ２ 文 献标 识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ｏ １ — ７ ５ ８ ５ （ ２ Ｏ １ ３ ） １ ３ － １ ６ ８ １ － ０ ３
Ｐｒ ｉ ｍａ ｒ ｙＣｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇＭ ｏ ｕ ｓ ｅＡｏ ｒ ｔ ｉ ｃ Ｓ ｍｏ ｏ ｔ ｈＭｕ ｓ ｃ ｌ ｅＣｅ ｌ ｌ ｓ ｂ ｙＣｏ ｍｂ ｉ ｎ ｅ ｄＥ ｎ ｚ ｙ ｍｅＤｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｏ ｎ
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动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定
东南大学学报（医学版）J Southeast Univ（Med Sci Edi）2011，Aug；30（4）：537-540mice［J］．Nature，1994，367（6464）：645-648．［4］BHATIA M，BONNET D，MURDOCH B，et al．A newly discov-ered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulat-ing activity［J］．Nat Med，1998，4（9）：1009-1010．［5］LUCIA R V，DARIO G L，EMANUELA P，et al．Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells［J］．Na-ture，2007，445：111-115．［6］SWAMINATHAN S K，OLIN M R，FORSTER C L，et al．Iden-tification of a novel monoclonal antibody recognizing CD133［J］．Elsevier BV，2010，361（1-2）：110-115．［7］唐权，窦骏，顾宁．癌干细胞研究现状［J］．东南大学学报：医学版，2005，24（4），276-279．［8］SHMELKOV S V，st CLAIR R，LYDEN D，et al．AC133/ CD133/Prominin-1［J］．Int Biochem Cell Biol，2005，37（4）：715-719．［9］KOV S V，JUN L，st CLAIR R，et al．Alternative promoters reg-ulate transcription of the gene that encodes stem cell surface protein AC133［J］．Blood，2004，103（6）：2055-2061．［收稿日期］2011-02-18［修回日期］2011-03-15［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81070571）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2009279）［作者简介］刘晶（1985-），女，湖北随州人，在读硕士研究生。
《基于RNA-Seq的哮喘小鼠气管平滑肌组织转录组分析及小鼠气管平滑肌细胞的原代培养和鉴定》
《基于RNA-Seq的哮喘小鼠气管平滑肌组织转录组分析及小鼠气管平滑肌细胞的原代培养和鉴定》一、引言哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子参与。
近年来，随着高通量测序技术的发展，RNA-Seq技术在哮喘研究中的应用越来越广泛。
本文旨在通过RNA-Seq技术对哮喘小鼠气管平滑肌组织进行转录组分析，并同时开展小鼠气管平滑肌细胞的原代培养和鉴定工作，以期为哮喘的发病机制研究提供新的思路和实验依据。
二、材料与方法1. 实验动物与分组选用SPF级BALB/c小鼠，随机分为正常对照组和哮喘模型组。
2. 哮喘模型建立通过雾化吸入过敏原等方法建立哮喘模型。
3. RNA-Seq技术进行转录组分析提取哮喘小鼠和正常小鼠的气管平滑肌组织RNA，进行高通量测序，并对数据进行生物信息学分析。
4. 小鼠气管平滑肌细胞的原代培养和鉴定（1）原代培养：取小鼠气管平滑肌组织，进行消化、离心、接种等步骤，培养平滑肌细胞。
（2）鉴定：通过免疫荧光、Western blot等方法鉴定培养的细胞为平滑肌细胞。
三、实验结果1. RNA-Seq转录组分析结果通过对哮喘小鼠和正常小鼠的气管平滑肌组织进行RNA-Seq 分析，我们发现哮喘组中多个与炎症、免疫、细胞增殖等相关的基因表达发生显著变化。
这些基因的差异表达可能参与了哮喘的发病过程。
2. 小鼠气管平滑肌细胞的原代培养和鉴定结果（1）原代培养：成功培养出形态良好、生长旺盛的小鼠气管平滑肌细胞。
（2）鉴定：通过免疫荧光和Western blot等方法鉴定，确认培养的细胞为平滑肌细胞，且纯度较高。
四、讨论本研究通过RNA-Seq技术对哮喘小鼠气管平滑肌组织的转录组进行了分析，发现多个与炎症、免疫、细胞增殖等相关的基因表达发生显著变化。
这些结果提示我们，哮喘的发病可能与这些基因的表达异常有关。
同时，我们还成功培养了小鼠气管平滑肌细胞，并进行了鉴定。
这些细胞可以为后续的机制研究提供重要的实验材料。
小鼠颈动脉平滑肌细胞处理方法
小鼠颈动脉平滑肌细胞处理方法小鼠颈动脉平滑肌细胞处理方法及细胞说明书仅供参考，具体操作还需要根据到货时细胞密度，细胞生长状态等具体情况，酌情处理。
一．小鼠颈动脉平滑肌细胞贴壁细胞客户接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。
肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
显微镜观察细胞，当细胞融汇80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。
如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。
严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
用PBS2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
1000rpm,5min离心，重悬细胞。
换新的细胞培养瓶，37℃,5%CO2培养。
二．小鼠颈动脉平滑肌细胞悬浮细胞1.接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。
2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒）。
5.1000rpm,5min离心，重悬细胞。
换新的细胞培养瓶和新鲜培养基，37℃,5%CO2培养精品资料欢迎下载。
小鼠肺细小动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定以及低氧对其增殖与凋亡的影响
小鼠肺细小动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定以及低氧对其增殖与凋亡的影响虞晓明;郭瑞;唐江锋;黄晓颖;王良兴【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】目的：建立一种方法简单、重复性好、培养周期短的小鼠肺细小动脉平滑肌细胞（ PASMCs ）原代培养及传代方法，并初步探索低氧下小鼠PASMCs 的增殖与凋亡情况。
方法：无菌条件显微镜下分离小鼠肺细小动脉，经胶原酶I消化结合血清铺底法培养PASMCs。
传代过程中弃除对细胞损伤大的离心步骤。
倒置相差显微镜观察细胞形态，免疫细胞化学法和免疫荧光染色法进行α-平滑肌肌动蛋白鉴定，CCK-8显法及TUNEL法测定低氧下PASMCs的增殖与凋亡情况。
结果：形态学观察、免疫细胞化学法和免疫荧光染色法鉴定均表明培养的细胞为PASMCs。
与大鼠传代后的PASMCs典型的“峰-谷”样生长相比，传代后的小鼠PASMCs形态各异，没有此典型“峰-谷”规律。
原代培养后5～7 d即传代，依据细胞活性可传3～5代。
CCK-8法显示，与常氧组24 h比较，低氧组A值升高（P＜0．05）。
TUNEL法结果显示低氧24 h后凋亡率较常氧组下降（P＜0．05）。
结论：胶原酶I消化结合血清铺底法培养小鼠PASMCs，方法简单，培养周期短，重复性好，是一种值得推广的小鼠PASMCs体外培养方法。
低氧可以促进小鼠PASMCs的增殖，抑制小鼠PASMCs的凋亡。
【总页数】5页(P1724-1728)【作者】虞晓明;郭瑞;唐江锋;黄晓颖;王良兴【作者单位】温州医科大学附属第一医院呼吸循环重点实验室，浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸循环重点实验室，浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸循环重点实验室，浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸循环重点实验室，浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸循环重点实验室，浙江温州325000【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.大鼠肺细小动脉平滑肌细胞培养新方法的建立及血小板衍生因子对其增殖迁移的影响 [J], 朱宁;赵旭勇;向贻佳;曾春来2.大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究 [J], 钱国清;王良兴;陈婵;黄晓颖;叶舒婷3.不同低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响 [J], 张昱;黄以哲;刘瑞欣;张伟4.阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖凋亡的影响 [J], 蒋凌志;张庆光;钟华5.大鼠原代肺动脉平滑肌细胞的分离鉴定及低氧对其增殖的影响 [J], 张凤玉; 姚德山; 李如君; 王军; 丁昌平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
[ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20
【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%
以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。
吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士
【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养
Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.
Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult
在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
1 材料与试剂
1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。
1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。
1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。
1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
1．5 ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。
1．6 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam,Vistavision），荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。
2 方法
2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部, 打开胸、腹腔 , 暴露心脏。
2．2 ５ mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。
2．3 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。
2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。
2．5 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。
2．6 眼科剪将血管快速剪成１～２ mm2 大小后用胶原酶消化３～４ h（组织块变成细胞团即可）。
2．7 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。
2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。
于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。