改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

Abstrac t O b jective T o explore a m ore effic ientw ay on prim a ry cu ltu re of rat v ascu lar sm oo thm usc le ce lls( V SM Cs) . M e thods T he prim ary cu lture o f rat V SM C s w as conducted by a mod ified tissue explant technique, in w hich the m edium w as a com bination of h igh g lucose DM EM and PDGF - B. The V SM Cs w ere identified by ce llm orpho logy and immunohisto chem istry. R esu lts T he specific h ill and va lley aspect o fV SM Cs cu ltured by tissue explant technique w as observed in 4~ 6 days , and passage of V SM Cs in prim ary culture and subcu lture w as in 2 w eeks and 1 week respective ly. Imm unoh istochem istry data show ed that there w as a large num ber of brown m yofil am ent in the intracy top lasm of V SM C s. Conclusion T he prim ary cu lture of rat V SM C s was conduc ted by a m odified tissue explant tech n ique, in wh ich the m edium w as a comb ination of h igh g lucose DM EM and PDG F - B. By using this m odified tissue explan t techn ique, w e can obta in h igh ly pure and be tter activ e V SM Cs, and sho rten the cyc le o f VSM Cs cu lture.
结果 1. 细胞生长形态学结果: 原代培养时, 血管组织 块接种 4~ 6天后可见组织块旁有少许细胞游出, 约 2周细胞达亚融合状态。传代培养时, 约 5 ~ 7 天细 胞可达亚融合状态。镜下观察细胞呈梭形、星型或不 规则形, 以梭形为主, 细胞核呈卵圆形。原代培养细 胞体积较小, 折光性强; 传代后, 随着传代次数增加, 细胞增大, 折光性减弱。细胞呈贴壁生长, 对数生长 期形成 峰 - 谷 的生长特征 (图 1) 。
医学研究杂志 2011年 1月 第 40卷 第 1期
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改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养
丁洪飞 黄胜超 李建文 陈小东 陈宝英 吴 平
摘 要 目的 探讨提高大鼠血管平滑肌细胞原代培养效率的方法。方法 采取组织块贴壁法进行原 代培养, 高糖 DM EM 培 养基中加入血小板源性生长因子 - B ( plate le t- der ived g row th fac to r- b, PDGF - B) , 用细胞形态学及免疫组织化学法对血管平 滑肌细胞鉴定。结果 原代培养, 4~ 6天可见细胞长 出, 2周 可以传 代; 传代培 养, 1周 可以传 代 1次。 镜下可 见细胞以 梭形为 主, 呈 峰 - 谷 状生长, 免疫组化染色可见细胞浆内 有大量 染成棕 黄色的 肌丝。结论 在采 用组织 块贴壁 法进行 培养时, 加入 PDGF - B 培养, 可获得纯度高、活性好的血管平滑肌细胞, 并 缩短了培养周期。
胰酶和 0. 02% EDTA 的 胰酶 细胞 消化液 ( 江苏碧 云天 生物技 术研究所, 中国 ); 双抗 (青霉 素 - 链霉素 溶液 ) ( 江苏 碧云天 生物技术 研究 所, 中国 ); Dห้องสมุดไป่ตู้ EM 高糖 培养 基 ( 上海 英骏 生物 技术有限公司, 中国 ); 抗大鼠 a- SM - actin单克隆抗体 ( SIG M A, 美国 ); PDGF - B ( R&D 公司, 美国 )。
基金项目: 广东省自然科学基金项目 ( 8152402301000015) 作者单位: 524001 湛江, 广东医学院附 属医院血管外科 ( 丁洪飞、 黄胜超、李建文、陈小东 ); 肿瘤中心 ( 陈宝英 ) ; 医学研究中心 (吴平 ) 通讯作者: 李建文, 电子信箱: gdyfyw jk@ 163. com
图 1 第 5代的血管平滑肌细胞 ( ∃ 200)
2. 免疫组化结果: 细胞用抗 actin进行免疫组化
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染色后, 镜下可见全部胞质内肌动蛋白染成棕黄色, 呈丝状顺着 细胞长 轴平行 排列, 细胞 核不着 色 ( 图 2)。
图 2 平滑肌细胞肌动蛋白免疫组化染色 ( ∃ 1000)
讨论 目前血管平滑肌细胞的原代培养有两种方法, 分 别是酶消化法和组织块贴壁法。虽然酶消化法的培 养周期短, 但酶的作用时间难掌握, 而且酶本身对细 胞有毒性, 这限 制了酶消化法 的广泛应用 [ 2] 。国内 应用最广泛的是组织块贴壁法, 组织块贴壁法具有操 作简单、经济实用、获得的细胞数较多、细胞活性好的 优点, 其主要不足之处是培养周期长。我们经过反复 摸索, 并借鉴前人的经验, 采用组织块贴壁法, 在培养 液中加入 PDGF - B, 缩短了培养周期。 PDGF - B是一种重要的促细胞分裂剂, 通过组 织局部的特异性血小板源生长因子受体 ( PDGFR ) 发 挥作用, 可以刺激多种细胞分裂和增生。 PDGF - B 能刺激血管平滑肌细胞分裂增生, 通过刺激胶原合成 和胶原酶的活化作用调节胞外基质的更新, 最终促进 DNA 合成和细胞裂解、增生 [ 3] 。 PDGF - B主要来源 于血小板, 单核 - 吞噬细胞、血管内皮细胞等细胞也 可以分泌。离体培养的血管平滑肌细胞本身不表达 PDGF - B, 但 PDGFR 在血管平滑肌细胞细胞膜上有 丰富表达 [ 4] ; 而且培养基中 的血清往往不是 自体血 清, 血清在加工、存储过程很多细胞因子被破坏, 因此 加入外源性细胞生长因子 PDGF - B是解决细胞生长 缓慢的对策。 PDGF - B 除了促进细胞增生外, 还影 响细胞 的表型。但 PDGFR 的代谢 快, PDGF - B 与 PDGFR 结合后, 形成的复合物很快进入胞内, 并迅速 降解。细胞在无 PDGF - B的培养基中培养后, PDGF - B的作用立即消失, 对后续的实验不产生影响 [ 5] 。 此外, 我们还在一些细节上对血管平滑肌细胞原
2. 方法: ( 1)原代培养: 用 1g /L 戊巴比 妥纳注射 入 SD 大 鼠的腹腔内, 麻醉大鼠后, 将除头部外的大鼠全部 身体浸泡在 75% 乙醇溶液中约 3m in。在无菌动物手术台上迅速分离取出 全段腹主动 脉, 置于含 100U /L 青 霉素、100m g /L 链 霉素、4! 的无菌 DM EM 溶液 中。转 移到 细胞 培养 室的 超净 工作 台操 作, 用含有双抗的 PBS液反复冲洗去除血管的血污, 用消毒牙 签插入血管腔内 来回抽插两 次去 除内 皮细胞, 然 后用 眼科镊 小心剥除血管外膜。纵行剪开血管 , 再用 PBS液漂洗 2次, 在 含有 少 量 DM EM 液的 培 养皿 里, 用 显微 手术 剪 将血 管 剪成 0 5~ 2mm2 大小 的组织块, 用吸管将组织块 移入培养 瓶, 并均 匀地摆布在瓶底, 组织块间的间距约 5mm。翻转培养 瓶, 向瓶 内加入含 20% 胎牛血清、10 g /LPDG F - B及双 抗 ( 100U /L 青 霉素、100mg /L 链霉 素 ) 的 DM EM 培 养基 4~ 5m ,l 静 置 37! 5% CO2 的培养箱中 4~ 5h。当组织块变干与培养瓶底壁黏附 后, 缓慢将培养瓶翻转平放使培养液刚浸过 组织块, 再静置在 培养箱里 4天后, 取出换液。第 1次换液后, 每 1~ 2天观 察 1
关键词 血管平 滑肌细胞 细胞培养
Im provem ent of R at Vascular Sm oothM uscle Cells in P rim ary Culture D ingH ongfei, H uang Shengchao, L i J ianw en, Chen X iaodong, Chen B aoying, W u P ing. A ff iliated H osp ital of Guangdong M edical College, Guangdong 524001, China
材料与方法
1. 材料: ( 1)实 验动 物: 清洁 级 SD 大鼠, 雌 雄不 限, 月龄 约 1个月, 体 重 100 ~ 120g (由 广 东医 学 院 实验 动 物 中 心提 供 ) 。 ( 2) 实验仪器: 超净工作台 ( 苏州净化 设备集团, 中国 ); 细胞培养箱 ( NUA IRE U S AUTOFLOW, 美国 ); 倒置显微镜 ( O LYM PU S, 日本 ); 显微照 相设 备 ( N IKON, 日本 )。 ( 3 )实 验试 剂: 胎牛血清 (杭州西季青生 物制品公司, 中国 ); 含有 0. 25%
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JM ed R es, Jan 2011, V o .l 40 N o. 1
次, 当培养液变黄时进行换液, 每次换液 只换 2 /3, 保留 1 /3原 培养液。 ( 2)传代培 养: 待 细胞生 长至亚 融合状 态时, 进行传 代。弃去旧培养液, 用 PBS液 冲洗 细胞 2 次, 去除 残余血 清, 加入胰酶细胞 消 化液, 略 盖 过细 胞即 可, 在 倒置 显 微镜 下观 察, 见细胞收缩稍变圆 时, 立即翻 转培 养瓶吸 净胰 酶消化 液, 加入含胎牛血清的培 养液终止消化。用无菌吸管反 复吹打瓶 底, 使细胞完全脱落成细胞悬液, 按 1#2或 1#3左右 的比例分 装接种到新培养 瓶, 加 入含 20% 胎牛 血清、10 g /L PDGF - B 及双抗的 DM EM 培养基适 量, 静置于 培养 箱中 培养, 每 1 ~ 2 天取出在倒置显微镜 下观 察, 当培 养液变 黄时, 进 行换液, 当 细胞融合达 75% 以上 时进 行传代。 ( 3)细 胞的 纯化: 如 果取 材时去除全部的外膜 和内膜 组织, 培 养时以 血管 平滑 肌细胞 为 主, 仅有 少许 其他 细胞 时, 无需 特殊 处理, 让 其自 然纯 化。 若有较多的内皮细胞 或成纤 维细 胞混 杂生长 时, 可采 用机械 刮除法 ( 即镜下标记混杂细胞生长区域, 用玻璃棒在 该区域反 复推刮破坏细胞 )和差异贴壁法 ( 即多次 短时间 的分装 培养 ) 纯化。 ( 4)细胞形态学鉴定: 根据大鼠血管平滑肌细胞的生物 学特点, 在倒置相差显微镜下观察细胞形态、排列方 式及生长 特点等。 ( 5)细胞免疫组织化学鉴定: 将第 2代细胞悬液接种 到预放置盖 玻片 的培 养 板中, 用 不 含 PDG F - B 的 培养 基培 养, 待细胞贴壁生长 融合 达 90% 左右 取出 盖玻 片, 用 PBS液 漂洗 5m in∃ 3次, 用 4% 甲醛固定 20m in, 同上法 漂洗, 然后按 免疫组化试剂盒说明 进行免 疫组 化染 色, 用 显微 镜及 图像分 析仪观察结果。