PCR构建融合基因方法的建立
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关键词 : 融合基因 一步 PCR法 模板浓度 引物浓度
Establishment and O ptim iza tion of PCR M ethods for Con structing Fusion Gene
Chen Guoliang Bai Xingjun Zhao Rong Lei Hongliang Chen Zongli
引物名称 g1 g2 g3 g4
表 1 扩增所用引物 引物序列 (5′23′) TAA AAT GTC GCC TGC TGA AAA TG ttc gat tca gca ctt gca gTA ACA AC百度文库 TCA CCA AGG CCT CC gga ggc ctt ggt gat gtt gtt aCT GCA AGT GCT GAT GAA TCG AA ATC GAT GGT ACC AGC AGG CGG TGT ATT TTT ATC G
以 ssⅢ ( gi: 1911165 ) 和 ssⅡ ( gi: 48927499 ) 基 因的 cDNA 全序列为依据 ,考虑到采用 PCR 拼接两 个基因片段及最终试验目的 ,最终确定选择用于拼 接的 cDNA 片段 ssⅢ基因 ORF中 2 164 - 2 407 bp 之间的片段 (244 bp ) , ssⅡ基因 ORF中 161 - 441 bp 之间的片段 (281 bp ) 。采用 O ligo6. 0分析软件对其 进行引物设计 ,并依次为命名为 g1、g2, g3、g4,其碱 基组成如表 1所示 。 PCR 引物合成和 DNA 序列测 定由上海生物工程公司完成 。
( College of L ife S cience Yan’an U niversity, Shaanx i Engineering & Technolog ical R esea rch Center for Conversation & U tilization of R egiona l B iolog ical R esou rces, Yan’an 716000)
相同末端酶切位点的 DNA 片段进行连接 [ 2 ] 。这不 仅需要对 DNA 片段的限制性酶切位点有所了解 ,而 且对于过长片段连接有时很难找到合适的内切酶对 DNA 片段进行酶切 [ 3 ] ,对于过短的片段又增加了连 接和鉴定的难度 ,同时在连接过程中还引入了不必 要的酶切位点碱基序列 ,因此 ,在某种程度上限制了 该方法的应用 。为了克服传统的融合基因重组构建 方法的缺陷 ,出现了以聚合酶链式反应为基础的片 段拼接技术 ———融合 PCR 技术 [ 4 ] ;但其在应用过程 中还有诸多缺陷 ,如首先必须应用特异性引物 [ 5, 6 ] 对各片段进行独立扩增 、分别纯化 、回收才能进行融 合扩增 ;一般要进行两步 PCR 反应 ,延长了试验时
模板 ssⅡ ssⅢ
备注
引物中 大 写 序 列 为 扩 增 片 段 的 特异性引物序列 ,小写序列为相 邻片段的互补序列
在进行 ssⅢ、ssⅡ基因片段的 PCR 融合中 ,以 不同浓度的扩增片段 (不回收 )以及含有目的基因 的质粒 (W Y01、W Y02)为模板 ,分别以不同浓度的 引物 ,采用相应的扩增体系及参数进行扩增 ,期待 找出一个简便 、经济 、有效的 PCR 构建融合基因的 方法 。 1. 3 以 PCR产物 (不回收 )为模版构建融合基因
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN
2010年第 8期
PCR构建融合基因方法的建立
陈国梁 白兴俊 赵蓉 雷鸿亮 陈宗礼
(延安大学生命科学学院 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心 ,延安 716000)
摘 要 : 以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术 ———融合 PCR 技术是一种新的基因片段融合技术 。以含有马铃薯 块茎两种淀粉合成关键酶 ssⅡ和 ssⅢ基因为模板 ,利用融合 PCR 对其进行融合拼接 ,初步建立以 PCR 产物 (不回收 )及一步 PCR法融合基因的构建方法 ,并对融合基因构建时 PCR产物 (不回收 )的使用量及一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度 等条件进行优化 。结果表明 ,以不回收的 PCR产物为模板构建融合基因时 PCR产物 (不回收 )的使用量在 10 - 20 ng范围内 为佳 ;一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度在 25 - 1 000 nmol/L为宜 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
210
生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2010年第 8期
Ab s tra c t: Fusion PCR technology is a new way used for constructing fused gene, based on fragment2sp licing techniques. Two cru2 cial genes of potato tuber starch synthesis key enzyme ssⅡand ssⅢ were emp loyed as the temp lates to construct a fused gene w ith a one2step method of fusion PCR , in which intermediate PCR p roducts were not subject to DNA gel2extraction. The results showed that, the amount of intermediate PCR p roducts should be around 10 - 20 ng used in fusion PCR. It is app rop riate to construct fusion gene by one2 stepPCR w ith the intermediate p rimer concentration at 25 - 1 000 nmol/L.
Key wo rd s: Fusion gene One2step PCR Concentration of temp late Concentration of p rimer
随着对植物代谢网络日渐全面的认识 ,应用基 因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取 得了可喜的进展 。目前对次生代谢途径进行基因修 饰的策略主要是通过导入单个 、多个靶基因 ,使宿主 植物合成新的目标物质或通过反义 RNA 和 RNA 干 涉等技术降低靶基因的表达水平 ,从而抑制竞争性 代谢途径 ,改变代谢流和增加目标物质的含量 ,以提 高特定化合物的积累 [ 1 ] 。通过基因工程手段实现 研究目标 ,一般均需构建含有两个或两个以上融合 基因的多价载体 ,而传统的融合基因重组构建是以 限制性内切酶和 DNA 连接酶为基础 ,即通过限制酶 将两个 DNA 分子进行酶切后 ,用连接酶将两个具有
以质粒 Y1,质粒 Y2为模板 ,配成 25μL的反应 体系 (含 Taq酶缓冲液 、dNTP、Taq酶 、组成融合基 因的各个基因片段的上下游引物 g1、g2, g3、g4 各 1μL ) , 94℃ 4 m in、95℃ 55 s、50℃ 45 s、72℃ 50 s, 进行 5个循环 , 72℃ 5 m in, 5个循环后 ,反应参数变 为 95℃ 55 s、54℃ 1 m in、72℃2 m in,循环 5次 , 72℃ 5 m in,另加入 25μL 的反应溶液 (含 Taq酶缓冲液 , dNTP, Taq酶 、所设计融合基因的上 、下游引物引物 , 即 g1、g4 各 1 μL ,浓度为 10 μmol/L ) ; 95℃ 55 s、 54℃ 1 m in、72℃ 2 m in,循环 30次 , 72℃ 10 m in, 4℃ 保存 。依据一步 PCR 法构建融合基因的原理及影 响因素 ,为了获得较好的融合效果 ,我们对该过程的
1 材料和方法
1. 1 菌种 、质粒及工具酶 菌株 E. coli DH5α;质粒 Y1 (含 ssⅢ基因 ) ,质粒
Y2 (含 ssⅡ基因 )均由本实验室提供 ; pGEM 2T Vec2 tor克隆载体购自 Promega 公司 。试验所需的限制
性内切酶 、连接酶和 Taq聚合酶均购自宝生物 (大 连 )工程公司 ;小量 DNA 胶回收试剂盒 、标准 DNA 2 M arker购自天为时代公司 。 1. 2 引物设计
从上述经琼脂糖凝胶电泳检测大小合适的 PCR 融合产物中选取融合片段进行回收 ,并与 T2easy载体 连接转化、筛选 ,并进行双酶切鉴定 。将酶切和 PCR 鉴定后将所得阳性克隆子送往上海生物技术有限责 任公司进行测序 。
间 ,增加了试验成本及操作程序等 。为此 ,在融合 PCR方法的基础上 ,以含有马铃薯块茎两种淀粉合 成关键酶基因 ssⅡ和 ssⅢ为材料 ,利用融合 PCR 对 其进行基因片段融合拼接 ,初步建立起以 PCR 产物 (不回收 )及一步 PCR法融合基因的构建方法 ,并对 构建时作为模板的 PCR 产物 (不回收 )使用量及一 步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度用量等条 件进行优化 ,以便建立起一种经济 ,有效 ,快速方便 的基因融合方法 ,供相关研究人员参考 。
ssⅢ、ss Ⅱ片 段 (不 回 收 ) 的 加 入 量 依 次 以 0. 05、 0110、0. 15、0. 20、0. 25、0. 50、1. 0、1. 5、2. 0 μL 等体 积混合 (对应的 DNA 量分别约 2、4、6、8、10、20、40、 60、80 ng)进行扩增并取 5 μL 扩增产物进行电泳 检测 。 1. 4 一步 PCR法构建融合基因
收稿日期 : 2010203201 基金项目 :延安大学专项科研基金项目 ( YDK2008217) ,延安大学大学生科技创新训练项目 ( YD20092208) 作者简介 :陈国梁 ,男 ,讲师 ,研究方向 :植物生物技术 ; E2mail: glc9359@163. com 通讯作者 :陈宗礼 , E2mail: zongli_chen@ yahoo. com. cn
以质粒 Y1和质粒 Y2为模板扩增出 ssⅢ、ssⅡ 基因片段 ,并以 ssⅢ、ssⅡ基因片段的 PCR 产物 (不 回收 )等体积混合为模板 ,配成 25 μL 的反应体系 (含 Taq 酶 缓 冲 液 、dN TP、Taq 酶 ) , 94℃ 4 m in、 95℃ 40 s、54℃ 1 m in、72℃ 1. 5 m in扩增 5个循环 (不加任何引物 ) 。5个循环后 ,另加入 25μL 的反 应溶液 (含 Taq酶缓冲液 , dN TP, Taq酶以及所设 计融合基因的上 、下游引物即 g1、g4 各 1 μL ,浓度 为 10 μmol/L ) 。 94℃4 m in; 95℃40 s、54℃ 45 s、 72℃ 1 m in、循环 30次 ; 72℃10 m in, 4℃保存 。为了 得到单一的融合基因片段 ,对经 PCR 扩增所得到的
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2010年第 8期
陈国梁等 : PCR构建融合基因方法的建立
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4条引物浓度进行了调整 ,分别用浓度为 10 000、 2 000、1 000、500、200、100、50、25 nmol/L 进行融合 试验 ,扩增后分别取 5μL 进行电泳检测 。 1. 5 融合基因片段与 T载体的连接及测序
Establishment and O ptim iza tion of PCR M ethods for Con structing Fusion Gene
Chen Guoliang Bai Xingjun Zhao Rong Lei Hongliang Chen Zongli
引物名称 g1 g2 g3 g4
表 1 扩增所用引物 引物序列 (5′23′) TAA AAT GTC GCC TGC TGA AAA TG ttc gat tca gca ctt gca gTA ACA AC百度文库 TCA CCA AGG CCT CC gga ggc ctt ggt gat gtt gtt aCT GCA AGT GCT GAT GAA TCG AA ATC GAT GGT ACC AGC AGG CGG TGT ATT TTT ATC G
以 ssⅢ ( gi: 1911165 ) 和 ssⅡ ( gi: 48927499 ) 基 因的 cDNA 全序列为依据 ,考虑到采用 PCR 拼接两 个基因片段及最终试验目的 ,最终确定选择用于拼 接的 cDNA 片段 ssⅢ基因 ORF中 2 164 - 2 407 bp 之间的片段 (244 bp ) , ssⅡ基因 ORF中 161 - 441 bp 之间的片段 (281 bp ) 。采用 O ligo6. 0分析软件对其 进行引物设计 ,并依次为命名为 g1、g2, g3、g4,其碱 基组成如表 1所示 。 PCR 引物合成和 DNA 序列测 定由上海生物工程公司完成 。
( College of L ife S cience Yan’an U niversity, Shaanx i Engineering & Technolog ical R esea rch Center for Conversation & U tilization of R egiona l B iolog ical R esou rces, Yan’an 716000)
相同末端酶切位点的 DNA 片段进行连接 [ 2 ] 。这不 仅需要对 DNA 片段的限制性酶切位点有所了解 ,而 且对于过长片段连接有时很难找到合适的内切酶对 DNA 片段进行酶切 [ 3 ] ,对于过短的片段又增加了连 接和鉴定的难度 ,同时在连接过程中还引入了不必 要的酶切位点碱基序列 ,因此 ,在某种程度上限制了 该方法的应用 。为了克服传统的融合基因重组构建 方法的缺陷 ,出现了以聚合酶链式反应为基础的片 段拼接技术 ———融合 PCR 技术 [ 4 ] ;但其在应用过程 中还有诸多缺陷 ,如首先必须应用特异性引物 [ 5, 6 ] 对各片段进行独立扩增 、分别纯化 、回收才能进行融 合扩增 ;一般要进行两步 PCR 反应 ,延长了试验时
模板 ssⅡ ssⅢ
备注
引物中 大 写 序 列 为 扩 增 片 段 的 特异性引物序列 ,小写序列为相 邻片段的互补序列
在进行 ssⅢ、ssⅡ基因片段的 PCR 融合中 ,以 不同浓度的扩增片段 (不回收 )以及含有目的基因 的质粒 (W Y01、W Y02)为模板 ,分别以不同浓度的 引物 ,采用相应的扩增体系及参数进行扩增 ,期待 找出一个简便 、经济 、有效的 PCR 构建融合基因的 方法 。 1. 3 以 PCR产物 (不回收 )为模版构建融合基因
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN
2010年第 8期
PCR构建融合基因方法的建立
陈国梁 白兴俊 赵蓉 雷鸿亮 陈宗礼
(延安大学生命科学学院 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心 ,延安 716000)
摘 要 : 以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术 ———融合 PCR 技术是一种新的基因片段融合技术 。以含有马铃薯 块茎两种淀粉合成关键酶 ssⅡ和 ssⅢ基因为模板 ,利用融合 PCR 对其进行融合拼接 ,初步建立以 PCR 产物 (不回收 )及一步 PCR法融合基因的构建方法 ,并对融合基因构建时 PCR产物 (不回收 )的使用量及一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度 等条件进行优化 。结果表明 ,以不回收的 PCR产物为模板构建融合基因时 PCR产物 (不回收 )的使用量在 10 - 20 ng范围内 为佳 ;一步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度在 25 - 1 000 nmol/L为宜 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
210
生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2010年第 8期
Ab s tra c t: Fusion PCR technology is a new way used for constructing fused gene, based on fragment2sp licing techniques. Two cru2 cial genes of potato tuber starch synthesis key enzyme ssⅡand ssⅢ were emp loyed as the temp lates to construct a fused gene w ith a one2step method of fusion PCR , in which intermediate PCR p roducts were not subject to DNA gel2extraction. The results showed that, the amount of intermediate PCR p roducts should be around 10 - 20 ng used in fusion PCR. It is app rop riate to construct fusion gene by one2 stepPCR w ith the intermediate p rimer concentration at 25 - 1 000 nmol/L.
Key wo rd s: Fusion gene One2step PCR Concentration of temp late Concentration of p rimer
随着对植物代谢网络日渐全面的认识 ,应用基 因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取 得了可喜的进展 。目前对次生代谢途径进行基因修 饰的策略主要是通过导入单个 、多个靶基因 ,使宿主 植物合成新的目标物质或通过反义 RNA 和 RNA 干 涉等技术降低靶基因的表达水平 ,从而抑制竞争性 代谢途径 ,改变代谢流和增加目标物质的含量 ,以提 高特定化合物的积累 [ 1 ] 。通过基因工程手段实现 研究目标 ,一般均需构建含有两个或两个以上融合 基因的多价载体 ,而传统的融合基因重组构建是以 限制性内切酶和 DNA 连接酶为基础 ,即通过限制酶 将两个 DNA 分子进行酶切后 ,用连接酶将两个具有
以质粒 Y1,质粒 Y2为模板 ,配成 25μL的反应 体系 (含 Taq酶缓冲液 、dNTP、Taq酶 、组成融合基 因的各个基因片段的上下游引物 g1、g2, g3、g4 各 1μL ) , 94℃ 4 m in、95℃ 55 s、50℃ 45 s、72℃ 50 s, 进行 5个循环 , 72℃ 5 m in, 5个循环后 ,反应参数变 为 95℃ 55 s、54℃ 1 m in、72℃2 m in,循环 5次 , 72℃ 5 m in,另加入 25μL 的反应溶液 (含 Taq酶缓冲液 , dNTP, Taq酶 、所设计融合基因的上 、下游引物引物 , 即 g1、g4 各 1 μL ,浓度为 10 μmol/L ) ; 95℃ 55 s、 54℃ 1 m in、72℃ 2 m in,循环 30次 , 72℃ 10 m in, 4℃ 保存 。依据一步 PCR 法构建融合基因的原理及影 响因素 ,为了获得较好的融合效果 ,我们对该过程的
1 材料和方法
1. 1 菌种 、质粒及工具酶 菌株 E. coli DH5α;质粒 Y1 (含 ssⅢ基因 ) ,质粒
Y2 (含 ssⅡ基因 )均由本实验室提供 ; pGEM 2T Vec2 tor克隆载体购自 Promega 公司 。试验所需的限制
性内切酶 、连接酶和 Taq聚合酶均购自宝生物 (大 连 )工程公司 ;小量 DNA 胶回收试剂盒 、标准 DNA 2 M arker购自天为时代公司 。 1. 2 引物设计
从上述经琼脂糖凝胶电泳检测大小合适的 PCR 融合产物中选取融合片段进行回收 ,并与 T2easy载体 连接转化、筛选 ,并进行双酶切鉴定 。将酶切和 PCR 鉴定后将所得阳性克隆子送往上海生物技术有限责 任公司进行测序 。
间 ,增加了试验成本及操作程序等 。为此 ,在融合 PCR方法的基础上 ,以含有马铃薯块茎两种淀粉合 成关键酶基因 ssⅡ和 ssⅢ为材料 ,利用融合 PCR 对 其进行基因片段融合拼接 ,初步建立起以 PCR 产物 (不回收 )及一步 PCR法融合基因的构建方法 ,并对 构建时作为模板的 PCR 产物 (不回收 )使用量及一 步 PCR法构建融合基因的中间引物浓度用量等条 件进行优化 ,以便建立起一种经济 ,有效 ,快速方便 的基因融合方法 ,供相关研究人员参考 。
ssⅢ、ss Ⅱ片 段 (不 回 收 ) 的 加 入 量 依 次 以 0. 05、 0110、0. 15、0. 20、0. 25、0. 50、1. 0、1. 5、2. 0 μL 等体 积混合 (对应的 DNA 量分别约 2、4、6、8、10、20、40、 60、80 ng)进行扩增并取 5 μL 扩增产物进行电泳 检测 。 1. 4 一步 PCR法构建融合基因
收稿日期 : 2010203201 基金项目 :延安大学专项科研基金项目 ( YDK2008217) ,延安大学大学生科技创新训练项目 ( YD20092208) 作者简介 :陈国梁 ,男 ,讲师 ,研究方向 :植物生物技术 ; E2mail: glc9359@163. com 通讯作者 :陈宗礼 , E2mail: zongli_chen@ yahoo. com. cn
以质粒 Y1和质粒 Y2为模板扩增出 ssⅢ、ssⅡ 基因片段 ,并以 ssⅢ、ssⅡ基因片段的 PCR 产物 (不 回收 )等体积混合为模板 ,配成 25 μL 的反应体系 (含 Taq 酶 缓 冲 液 、dN TP、Taq 酶 ) , 94℃ 4 m in、 95℃ 40 s、54℃ 1 m in、72℃ 1. 5 m in扩增 5个循环 (不加任何引物 ) 。5个循环后 ,另加入 25μL 的反 应溶液 (含 Taq酶缓冲液 , dN TP, Taq酶以及所设 计融合基因的上 、下游引物即 g1、g4 各 1 μL ,浓度 为 10 μmol/L ) 。 94℃4 m in; 95℃40 s、54℃ 45 s、 72℃ 1 m in、循环 30次 ; 72℃10 m in, 4℃保存 。为了 得到单一的融合基因片段 ,对经 PCR 扩增所得到的
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2010年第 8期
陈国梁等 : PCR构建融合基因方法的建立
211
4条引物浓度进行了调整 ,分别用浓度为 10 000、 2 000、1 000、500、200、100、50、25 nmol/L 进行融合 试验 ,扩增后分别取 5μL 进行电泳检测 。 1. 5 融合基因片段与 T载体的连接及测序