RTPCR方法检测慢性粒细胞白血病bcrabl融合基因类型
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
f结 果
用白血病细胞总 BYC 为起始 物*在逆转 录酶 作用下合成 IYC*并应用在易位连接区两侧结合引 物*即引物 C3H393I*采用筑巢式 <9B的方法 检测 H9B3CH;融合及基因融合类型*第一步 <9B 以 93I为引物扩增>第二步以第一步 <9B产物为 模 板*以 C3H为引物扩增*从而得到长度为 "&%eT 或 (和)61eT的片段*长度相差 @%eT*经琼脂糖 凝胶电泳鉴定产物长度*产物长度为 "&%eT的基因 融合型为 e4Q]’>产物长度为 61eT的基因融合型为 e’Q]’+为 了 提 高 检 测 的 敏 感 性 本 文 作 者 从 如 下 几 方 面进行了探索*并对 临床 "&2例 9:;患者进 行了
慢性粒细胞白血病 *DEF.具有特征性的 CO染 色 体2即 r*0P++.2阳性率为 0,7N0’7!#"2位于 00/-的 原 癌 基 因 RlF与 ++0##的 lDA 基 因 发 生 重 组2形成 GHI=JGK融合基因4为提高 AB&CDA检测的
敏感度2从 AB&CDA的逆转录酶用量3退火温度和 扩增周期数 /方 面进行 探讨2并对 #$-例 DEF患 者 及 8’$+细 胞 株 的 GHI=JGK融 合 基 因 转 录 产 物 进 行检测2确定 GHI=JGK融合基因的融合类型4
!收稿日期" +,,/&,(&#/
!基金项目" 吉林省科技厅资助课题 *+,,/,-+%&,/.
!作者简介"万方袁数长据吉 *#0$/1.2男2吉林省榆树市人2副教授2医学博士2主要从事血液病3实体瘤发病机制及治疗的研
究4
袁长吉*等 # BFE<9B方法检测慢性粒细胞白血病 e.LQ]e0融合基因类型
@%"
! 材料与方法
"#" 材 料 $%&’细胞株 (天津血液病研究所)* 常 规 细 胞传 代培养+将 $%&’细胞及 经 ,-./00分 离 的 正常外周血单个核细胞*分别按 "1&正常人外周 血单个核细胞含 "123"143"1’3"1"及 "个 $%&’细 胞 的 比 例 相 混 合 配 成 单 个 细 胞 悬 液 备 用+临 床 标 本5取自 "66%年 %月7 "668年 %月 吉林 大 学 第一 医院血液科收治的 "&2例 9:;患 者 的 外周 血 及 骨 髓细胞+其中 "%%例 <=染色体阳性*6例 <=染色 体阴性>年龄 ’"?@&岁>有 "4’例进行了常规化疗* 4’例进行了化疗A干扰素治 疗>对 其 中的 "8例 化 疗A干扰素治疗的患者进行了 4年以上的随访观察 (干扰素用 "个月的 2例*用 4个月的 8例*用半年 以上的 &例)>"&2例中有 ’8例急变死亡+<9B引 物 *C5 %DE9F99CGC9FGF99C9CG9CFF99G
纯 >若 比 值 \ "#&*说 明 样 品 中 含 蛋 白 质 或 酚 等 其 他 吸收紫外光的杂质*应重新抽提沉淀+浓度测定后 可根据需要*取少量 BYC 样品*用 IS<9水稀释至 1#%[M;7"*以备 BFE<9B反应用+ "#% 逆 转 录 酶 反 应 经 真 空 干 燥 后 的 细 胞 BYC 用 ’%X;核糖核酸抑制剂 (BO]R-O)溶液 ^含 ’4X; 焦 碳 酸 二 已 酯* IS<9 双 蒸 水* "#’%X; BY]R-O (21_MX;7" <L/NU[])‘* "11NN/0M ;7" IFF "X;溶 解* 此 外* 再 加 入 适 量 的 逆 转 录 酶 (<L/NU[])*2’K孵育 "=后置7’1K冻存备用+ "#& 筑巢式 <9B 第一步 <9B5将上述逆转录酶 反 应 终 产 物 % X; 加 入 ’1 X; <9B 溶 液 中 ^&@NN/0M;7" FL-R+a9;Ta 8#8*"#%NN/0M;7" :[90’* "&#&NN/0M ;7"硫 酸 铵* "1NN/0M ;7" ’E巯 基已醇 (’E:S)>两种引物 (9E4D端引物>IE%D端 引物)各 411TN/0M;7">bYF<R各’11XN/0M;7" 并 加 入 1#’%_ 耐 热 IYC 扩 增 酶 (CNT0-c][* 9SF_W*%_M X;7")‘+每 管 反 应 液 上 覆 以 ’%X; 液 体石蜡+先在 <9B仪上预热 6%K3%N-O*然后 经不同温度使 IYC 变性3退火3延伸*进行 <9B反 应+第二步 <9B5取第一步反应产物 %X;*引物改 为 H和 C*其余同第一步 <9B反应+ "#@ 反应产物的测定 %X;<9B产物进 行 ’d琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 *溴 化 乙 锭 染 色 *并 经 紫 外 线 下 摄 影 * 观 察 结 果 +为 了 提 高 检 测 残 留 白 血 病 细 胞 的 敏 感 性 * 以正常细胞中含 $%&’细胞数的比 例的 不同标 本的 检出率*来探讨最适逆转录酶浓度及 <9B过程中最 适退火3延伸温度以及 <9B周期 4个方面对检出率 的 影 响* 同 时 用 BFE<9B 的 方 法 检 测 临 床 "&2例 9:;患 者 e.LQ]e0的 融 合 形 式+ 观 察 NBYC 的 融 合类型*并探讨其与治疗及预后的关系+
E4D>H5%DE9CGC999FGCGG9F9CCCGF9CGC
E4D> 95 %DEG9FF9F999FGC9CF99GFGE4D>
I5 %DE9GCG9GG9FF9C9F9CGC99E4D+ "#’ 骨髓及外周血单个核细胞分离 将骨髓(或外 周 血)沿管壁加到 ,-./00分离液上层*两者比例约为 ’J"*"8K*’111LMN-O7"离心 ’1N-O>用滴管吸 取 单 个 核 细 胞 层* 加 入 包 含 &N; "&21培 养 液 的 "%N;离心管中混匀*"111LMN-O7"离心 "1N-O> 弃上清*取沉淀>加 "N;小牛血清混匀*取 "滴细 胞 混 悬 液 于 记 数 板 中 记 数 后*将 细 胞 数 调 整 到 "P "1&M N;7 "备 用 + "#4 核酸制备 取 %N;细胞变性液溶解细胞*移 到 %1N;离心管中*加入等量的苯酚溶液*"Q"1量 乙酸钠*"Q%量的氯仿E异戊醇 (26J")混合液*振 摇 "1R*置冰浴 "%N-O+2K "1111LMN-O7"离心 ’1N-O+弃上清*沉淀物溶于 1#%N;变性液中*移 至 "#%N;STTUO/LV管中*加等体积异丙醇*颠倒 混 匀*7’1K*再次沉淀 "=以上+弃上清*沉淀物 溶 解 于 7 ’1K <HW溶 液 中* 加 ’1 X; 乙 酸 钠 (’N/0M ;7 ")*双 倍 体 积 无 水 乙 醇 *摇 匀 *置 7 81K 冰 箱*41N-O+2K3"1111LMN-O7"离心 ’1N-O+ 弃 上清*沉淀 (BYC)经真空干燥*溶于 ’1X;IS<9 水 中 *置 7 81K 冰 箱 待 用 +整 个 操 作 过 程 需 要 无 菌 + "#2 BYC 定量 用分光光度法测定*在 ’&1ON和 ’81ON 两个波长下读数*在 ’&1ON 的读数用于计 算样品中的核酸浓度*Z值为 "相当于21N[M;7" 的 BYC+估万计方数样据品纯度5纯度取决于Z’&1QZ’81比值* 若比值接近 ’*说明吸收主要由于核酸*即 BYC 较
%’,
第 /,卷 第 ’期 +,,-年 0月
吉 林 大 学 学 报*医 学 版 . ym{IfJKmtyHale Waihona Puke BaiduKifLfizoIxiru*EoviHifo9virimf.
!文章编号" #$%#&’(%)*+,,-.,’&,%’,&,/
:mK*/, em*’ ;oqr*+,,-
567895方法检测慢性粒细胞白血病 :;<=>:?融合基因类型
袁长吉2迟宝荣2姚 程2易永林 *吉林大学第一医院血液肿瘤科2吉林 长春 #/,,+#.
!摘 要" 目的@提高 AB&CDA检测慢性粒细胞白血病 *DEF.残留白血病细胞的敏感性2探讨最适逆转录酶用量3 最适退火及延伸温度以及 CDA周期数2确定 GHI=JGK的融合类型2并研究其与预后的关系4方法@通过改变 CDA条件2 将常规用量的逆转录酶减少到常规的 #=-*’L.2退火温度由原来的 ’,M增加至 $,M2反应周期数由原来的 /,周期 增加到 -’周期2检测临床 #$-例 DEF患 者 标 本4结 果@可 使 残 留 白 血 病 细 胞 的 检 出 率 由 原 来 的 #,1-提 高 至 #,1’N #,1$4#’’例 CO染 色 体 阳 性 的 患 者 中 发 现 GHI=JGK融 合 基 因 类 型 2其 中 G/=J+型 %(例 2G+=J+型 ’-例 2G/=J+和 G+=J+两 型均有者为 +/例P0例 CO染色体阴性病例 中2G/=J+型 #例2G+=J+型 /例2两 型 均 有 #例2阴 性 -例 *即 CO1 GHI1 DEF.4结论@几乎所有 DEF患者都有 GHI=JGK融合基因2并存在不同类型2有少部分患者体内同时存在两类不同嵌 合体的白血病细胞2即两种不同的突变细胞株2预示着患者预后差4 !关键词" 白血病2髓性2慢性=诊断P聚合酶链反应PGHI=JGKP原癌基因 !中图分类号" A%//Q%+ !文献标识码" R
|:[U<>;U@ }~!"#$%&" BmifHIoJxorOoxofxirizirumtIoxiv{JKKo{’osiHHoKKxvoroHrimfifHOImfiHsuoKmHuriHKo{’osiJ *DEF.qJriofrx(irOAB&CDA2rOomqrisJKvmxomtIozoIxorIJfxHIiqrJxo2mqrisJKJffoJKifg2o)rofximfrosqoIJr{Io2Jfv CDA HuHKox(oIoxr{viovrmHmftiIs GHI=JGKt{xovgoforuqox*+"$,-./ BOIm{gOHOJfgifgrOoCDA Hmfvirimfx2rOo vmxomtIozoIxorIJfxHIiqrJxo(JxvoHIoJxovrmmfo&0{JIroImtIm{rifovmxox*’L.2 rOoJffoJKifgrosqoIJr{Io(Jx ifHIoJxovtIms ’,M rm$,M2JfvrOof{sGoImtIoJHrimfHuHKox(JxifHIoJxovtIms /,rm-’*RKK#$-DEF qJriofrx (oIoo)Jsifov*1"/23$/ GHI=JGKt{xovgoforuqox(oIotm{fvif#’’qJriofrx(irOqmxirizoCOHOImsmxmso2mtJKK%( HJxox(oIoG/=J+ ruqo2’-HJxox(oIoG+=J+ ruqo2Jfv+/HJxox(oIoGmrOG/=J+ JfvG+=J+ ruqox*nt0fogJrizoCO HOImsmxmso2#HJxo(JxG/=J+ ruqo2/HJxox(JxG+=J+ ruqo2#HJxo(JxGmrOG/=J+ JfvG+=J+ ruqox2 Jfv-HJxox(oIo fogJrizo*CO&GHI&DEF.*4-5#32/%-5 RKsmxrJKKrOoDEF qJriofrxHJfGotm{fvrOJrrOouOJzoGHI=JGKt{xovgofo2 to( OJzor(m’ifvxmtHOisoIJKo{’osiHHoKKx*r(m’ifvxmts{rJrimfJKHoKKKifox.* 6Tb_W<\[@Ko{’osiJ2suoKmiv2HOImfiH=viJgfmxixPqmKusoIJxoHOJifIoJHrimfPGHI=JGKPqImrm&mfHmgofox
STUT;UVWXWY:;<=>:?YZ[T\]TXT^>UUT<X[VX^>UVTXU[_VU‘ ;‘<WXV;abT?W;bUV;?TZcTaV>:b567895
dLRe DOJfg&hi2DjklJm&Imfg2dRn DOofg2dkdmfg&Kif *poqJIrsofrmtjosJrmKmguJfvnfHmKmgu2wiIxrjmxqirJK2yiKifLfizoIxiru2DOJfgHO{f#/,,+#2DOifJ.
用白血病细胞总 BYC 为起始 物*在逆转 录酶 作用下合成 IYC*并应用在易位连接区两侧结合引 物*即引物 C3H393I*采用筑巢式 <9B的方法 检测 H9B3CH;融合及基因融合类型*第一步 <9B 以 93I为引物扩增>第二步以第一步 <9B产物为 模 板*以 C3H为引物扩增*从而得到长度为 "&%eT 或 (和)61eT的片段*长度相差 @%eT*经琼脂糖 凝胶电泳鉴定产物长度*产物长度为 "&%eT的基因 融合型为 e4Q]’>产物长度为 61eT的基因融合型为 e’Q]’+为 了 提 高 检 测 的 敏 感 性 本 文 作 者 从 如 下 几 方 面进行了探索*并对 临床 "&2例 9:;患者进 行了
慢性粒细胞白血病 *DEF.具有特征性的 CO染 色 体2即 r*0P++.2阳性率为 0,7N0’7!#"2位于 00/-的 原 癌 基 因 RlF与 ++0##的 lDA 基 因 发 生 重 组2形成 GHI=JGK融合基因4为提高 AB&CDA检测的
敏感度2从 AB&CDA的逆转录酶用量3退火温度和 扩增周期数 /方 面进行 探讨2并对 #$-例 DEF患 者 及 8’$+细 胞 株 的 GHI=JGK融 合 基 因 转 录 产 物 进 行检测2确定 GHI=JGK融合基因的融合类型4
!收稿日期" +,,/&,(&#/
!基金项目" 吉林省科技厅资助课题 *+,,/,-+%&,/.
!作者简介"万方袁数长据吉 *#0$/1.2男2吉林省榆树市人2副教授2医学博士2主要从事血液病3实体瘤发病机制及治疗的研
究4
袁长吉*等 # BFE<9B方法检测慢性粒细胞白血病 e.LQ]e0融合基因类型
@%"
! 材料与方法
"#" 材 料 $%&’细胞株 (天津血液病研究所)* 常 规 细 胞传 代培养+将 $%&’细胞及 经 ,-./00分 离 的 正常外周血单个核细胞*分别按 "1&正常人外周 血单个核细胞含 "123"143"1’3"1"及 "个 $%&’细 胞 的 比 例 相 混 合 配 成 单 个 细 胞 悬 液 备 用+临 床 标 本5取自 "66%年 %月7 "668年 %月 吉林 大 学 第一 医院血液科收治的 "&2例 9:;患 者 的 外周 血 及 骨 髓细胞+其中 "%%例 <=染色体阳性*6例 <=染色 体阴性>年龄 ’"?@&岁>有 "4’例进行了常规化疗* 4’例进行了化疗A干扰素治 疗>对 其 中的 "8例 化 疗A干扰素治疗的患者进行了 4年以上的随访观察 (干扰素用 "个月的 2例*用 4个月的 8例*用半年 以上的 &例)>"&2例中有 ’8例急变死亡+<9B引 物 *C5 %DE9F99CGC9FGF99C9CG9CFF99G
纯 >若 比 值 \ "#&*说 明 样 品 中 含 蛋 白 质 或 酚 等 其 他 吸收紫外光的杂质*应重新抽提沉淀+浓度测定后 可根据需要*取少量 BYC 样品*用 IS<9水稀释至 1#%[M;7"*以备 BFE<9B反应用+ "#% 逆 转 录 酶 反 应 经 真 空 干 燥 后 的 细 胞 BYC 用 ’%X;核糖核酸抑制剂 (BO]R-O)溶液 ^含 ’4X; 焦 碳 酸 二 已 酯* IS<9 双 蒸 水* "#’%X; BY]R-O (21_MX;7" <L/NU[])‘* "11NN/0M ;7" IFF "X;溶 解* 此 外* 再 加 入 适 量 的 逆 转 录 酶 (<L/NU[])*2’K孵育 "=后置7’1K冻存备用+ "#& 筑巢式 <9B 第一步 <9B5将上述逆转录酶 反 应 终 产 物 % X; 加 入 ’1 X; <9B 溶 液 中 ^&@NN/0M;7" FL-R+a9;Ta 8#8*"#%NN/0M;7" :[90’* "&#&NN/0M ;7"硫 酸 铵* "1NN/0M ;7" ’E巯 基已醇 (’E:S)>两种引物 (9E4D端引物>IE%D端 引物)各 411TN/0M;7">bYF<R各’11XN/0M;7" 并 加 入 1#’%_ 耐 热 IYC 扩 增 酶 (CNT0-c][* 9SF_W*%_M X;7")‘+每 管 反 应 液 上 覆 以 ’%X; 液 体石蜡+先在 <9B仪上预热 6%K3%N-O*然后 经不同温度使 IYC 变性3退火3延伸*进行 <9B反 应+第二步 <9B5取第一步反应产物 %X;*引物改 为 H和 C*其余同第一步 <9B反应+ "#@ 反应产物的测定 %X;<9B产物进 行 ’d琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 *溴 化 乙 锭 染 色 *并 经 紫 外 线 下 摄 影 * 观 察 结 果 +为 了 提 高 检 测 残 留 白 血 病 细 胞 的 敏 感 性 * 以正常细胞中含 $%&’细胞数的比 例的 不同标 本的 检出率*来探讨最适逆转录酶浓度及 <9B过程中最 适退火3延伸温度以及 <9B周期 4个方面对检出率 的 影 响* 同 时 用 BFE<9B 的 方 法 检 测 临 床 "&2例 9:;患 者 e.LQ]e0的 融 合 形 式+ 观 察 NBYC 的 融 合类型*并探讨其与治疗及预后的关系+
E4D>H5%DE9CGC999FGCGG9F9CCCGF9CGC
E4D> 95 %DEG9FF9F999FGC9CF99GFGE4D>
I5 %DE9GCG9GG9FF9C9F9CGC99E4D+ "#’ 骨髓及外周血单个核细胞分离 将骨髓(或外 周 血)沿管壁加到 ,-./00分离液上层*两者比例约为 ’J"*"8K*’111LMN-O7"离心 ’1N-O>用滴管吸 取 单 个 核 细 胞 层* 加 入 包 含 &N; "&21培 养 液 的 "%N;离心管中混匀*"111LMN-O7"离心 "1N-O> 弃上清*取沉淀>加 "N;小牛血清混匀*取 "滴细 胞 混 悬 液 于 记 数 板 中 记 数 后*将 细 胞 数 调 整 到 "P "1&M N;7 "备 用 + "#4 核酸制备 取 %N;细胞变性液溶解细胞*移 到 %1N;离心管中*加入等量的苯酚溶液*"Q"1量 乙酸钠*"Q%量的氯仿E异戊醇 (26J")混合液*振 摇 "1R*置冰浴 "%N-O+2K "1111LMN-O7"离心 ’1N-O+弃上清*沉淀物溶于 1#%N;变性液中*移 至 "#%N;STTUO/LV管中*加等体积异丙醇*颠倒 混 匀*7’1K*再次沉淀 "=以上+弃上清*沉淀物 溶 解 于 7 ’1K <HW溶 液 中* 加 ’1 X; 乙 酸 钠 (’N/0M ;7 ")*双 倍 体 积 无 水 乙 醇 *摇 匀 *置 7 81K 冰 箱*41N-O+2K3"1111LMN-O7"离心 ’1N-O+ 弃 上清*沉淀 (BYC)经真空干燥*溶于 ’1X;IS<9 水 中 *置 7 81K 冰 箱 待 用 +整 个 操 作 过 程 需 要 无 菌 + "#2 BYC 定量 用分光光度法测定*在 ’&1ON和 ’81ON 两个波长下读数*在 ’&1ON 的读数用于计 算样品中的核酸浓度*Z值为 "相当于21N[M;7" 的 BYC+估万计方数样据品纯度5纯度取决于Z’&1QZ’81比值* 若比值接近 ’*说明吸收主要由于核酸*即 BYC 较
%’,
第 /,卷 第 ’期 +,,-年 0月
吉 林 大 学 学 报*医 学 版 . ym{IfJKmtyHale Waihona Puke BaiduKifLfizoIxiru*EoviHifo9virimf.
!文章编号" #$%#&’(%)*+,,-.,’&,%’,&,/
:mK*/, em*’ ;oqr*+,,-
567895方法检测慢性粒细胞白血病 :;<=>:?融合基因类型
袁长吉2迟宝荣2姚 程2易永林 *吉林大学第一医院血液肿瘤科2吉林 长春 #/,,+#.
!摘 要" 目的@提高 AB&CDA检测慢性粒细胞白血病 *DEF.残留白血病细胞的敏感性2探讨最适逆转录酶用量3 最适退火及延伸温度以及 CDA周期数2确定 GHI=JGK的融合类型2并研究其与预后的关系4方法@通过改变 CDA条件2 将常规用量的逆转录酶减少到常规的 #=-*’L.2退火温度由原来的 ’,M增加至 $,M2反应周期数由原来的 /,周期 增加到 -’周期2检测临床 #$-例 DEF患 者 标 本4结 果@可 使 残 留 白 血 病 细 胞 的 检 出 率 由 原 来 的 #,1-提 高 至 #,1’N #,1$4#’’例 CO染 色 体 阳 性 的 患 者 中 发 现 GHI=JGK融 合 基 因 类 型 2其 中 G/=J+型 %(例 2G+=J+型 ’-例 2G/=J+和 G+=J+两 型均有者为 +/例P0例 CO染色体阴性病例 中2G/=J+型 #例2G+=J+型 /例2两 型 均 有 #例2阴 性 -例 *即 CO1 GHI1 DEF.4结论@几乎所有 DEF患者都有 GHI=JGK融合基因2并存在不同类型2有少部分患者体内同时存在两类不同嵌 合体的白血病细胞2即两种不同的突变细胞株2预示着患者预后差4 !关键词" 白血病2髓性2慢性=诊断P聚合酶链反应PGHI=JGKP原癌基因 !中图分类号" A%//Q%+ !文献标识码" R
|:[U<>;U@ }~!"#$%&" BmifHIoJxorOoxofxirizirumtIoxiv{JKKo{’osiHHoKKxvoroHrimfifHOImfiHsuoKmHuriHKo{’osiJ *DEF.qJriofrx(irOAB&CDA2rOomqrisJKvmxomtIozoIxorIJfxHIiqrJxo2mqrisJKJffoJKifg2o)rofximfrosqoIJr{Io2Jfv CDA HuHKox(oIoxr{viovrmHmftiIs GHI=JGKt{xovgoforuqox*+"$,-./ BOIm{gOHOJfgifgrOoCDA Hmfvirimfx2rOo vmxomtIozoIxorIJfxHIiqrJxo(JxvoHIoJxovrmmfo&0{JIroImtIm{rifovmxox*’L.2 rOoJffoJKifgrosqoIJr{Io(Jx ifHIoJxovtIms ’,M rm$,M2JfvrOof{sGoImtIoJHrimfHuHKox(JxifHIoJxovtIms /,rm-’*RKK#$-DEF qJriofrx (oIoo)Jsifov*1"/23$/ GHI=JGKt{xovgoforuqox(oIotm{fvif#’’qJriofrx(irOqmxirizoCOHOImsmxmso2mtJKK%( HJxox(oIoG/=J+ ruqo2’-HJxox(oIoG+=J+ ruqo2Jfv+/HJxox(oIoGmrOG/=J+ JfvG+=J+ ruqox*nt0fogJrizoCO HOImsmxmso2#HJxo(JxG/=J+ ruqo2/HJxox(JxG+=J+ ruqo2#HJxo(JxGmrOG/=J+ JfvG+=J+ ruqox2 Jfv-HJxox(oIo fogJrizo*CO&GHI&DEF.*4-5#32/%-5 RKsmxrJKKrOoDEF qJriofrxHJfGotm{fvrOJrrOouOJzoGHI=JGKt{xovgofo2 to( OJzor(m’ifvxmtHOisoIJKo{’osiHHoKKx*r(m’ifvxmts{rJrimfJKHoKKKifox.* 6Tb_W<\[@Ko{’osiJ2suoKmiv2HOImfiH=viJgfmxixPqmKusoIJxoHOJifIoJHrimfPGHI=JGKPqImrm&mfHmgofox
STUT;UVWXWY:;<=>:?YZ[T\]TXT^>UUT<X[VX^>UVTXU[_VU‘ ;‘<WXV;abT?W;bUV;?TZcTaV>:b567895
dLRe DOJfg&hi2DjklJm&Imfg2dRn DOofg2dkdmfg&Kif *poqJIrsofrmtjosJrmKmguJfvnfHmKmgu2wiIxrjmxqirJK2yiKifLfizoIxiru2DOJfgHO{f#/,,+#2DOifJ.