排阻色谱法
排阻色谱分离原理
排阻色谱分离原理排阻色谱法是一种常用的分离方法，其原理基于分子筛机制，通过固定相和流动相之间的相互作用，实现对不同分子大小的物质的分离。
本篇文档将详细介绍排阻色谱分离原理，主要包含以下四个方面：分子筛机制、凝胶色谱柱、分子进入色谱柱、分子筛效应。
分子筛机制排阻色谱法的核心是分子筛机制。
分子筛是一种具有固定孔径的细孔材料，类似于分子大小的筛子。
当流动相通过固定相时，固定相对流动相中的分子进行筛选，只有符合孔径要求的分子才能进入固定相，而较大或较小的分子则无法进入。
因此，不同大小的分子在流动相和固定相之间的分配系数不同，从而实现分离。
凝胶色谱柱凝胶色谱柱是排阻色谱法中最常用的色谱柱之一。
凝胶色谱柱的固定相是由交联聚合物制成的凝胶颗粒，这些颗粒具有三维网络结构。
当流动相流经凝胶色谱柱时，分子通过与凝胶颗粒的相互作用进入固定相。
由于不同大小的分子与凝胶颗粒的相互作用不同，因此它们在色谱柱中的移动速度也不同，从而实现分离。
分子进入色谱柱在排阻色谱法中，分子进入色谱柱的过程主要受到分子大小和极性的影响。
极性分子更容易与固定相中的极性基团相互作用，从而更容易进入固定相。
相反，非极性分子则更容易与固定相中的非极性基团相互作用，从而更难进入固定相。
因此，不同极性的分子在进入色谱柱时的移动速度也不同，从而实现分离。
分子筛效应在排阻色谱法中，分子筛效应也是实现分离的重要因素之一。
当流动相中的分子流经固定相时，只有符合孔径要求的分子才能进入固定相。
如果固定相的孔径较小，那么只有较小的分子才能进入固定相；如果固定相的孔径较大，那么较大的分子也可以进入固定相。
因此，不同大小的分子在流动相和固定相之间的分配系数不同，从而实现分离。
这种效应被称为“分子筛效应”。
总之，排阻色谱分离原理是基于分子筛机制实现的。
通过选择合适的固定相和流动相，可以实现对不同大小和极性的分子的分离。
在实际应用中，排阻色谱法被广泛应用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。
简述分子排阻色谱法的原理及应用
简述分子排阻色谱法的原理及应用
分子排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC），也称为凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC），是一种常用的色谱技术，用于分离和测定高分子化合物的分子量分布和平均分子量。
原理：
分子排阻色谱法基于分子在固定填料（凝胶）中的渗透性差异进行分离。
凝胶填料由多孔性材料组成，具有一定的孔径大小范围。
样品溶液中的大分子无法进入较小的孔径，因此在填料中被排除，而小分子可以进入更多的孔径，因此渗透性更高。
样品通过色谱柱时，较大的分子被更快地排除，而较小的分子则渗透更深。
这样，样品中不同分子大小的组分就可以在色谱柱中被分离开来。
应用：
分子排阻色谱法广泛应用于高分子化合物的分析和质量控制。
以下是一些主要应用领域：
分子量测定：通过与一系列已知分子量的标准品进行比较，可以确定待测样品的相对分子量或相对分子量分布。
分子量分布：分析样品中分子量的分布情况，得到分子量分布曲线，了解高分子化合物的多分散性。
质量控制：用于确定产品的一致性和稳定性，检测分子量分布的变化。
聚合物合成：跟踪聚合反应过程中高分子的分子量变化，评估聚合度和反应进程。
蛋白质研究：分析蛋白质的聚合态、聚集性质和分子量分布。
总之，分子排阻色谱法在高分子化学、生物化学、药物研究和其他领域中，对于分析高分子化合物的分子量和分子量分布具有重要的应用价值。
分子排阻色谱法(sec)文献
分子排阻色谱法(sec)文献
分子排阻色谱法（SEC）是一种常用的色谱技术，用于分离高分
子化合物。
SEC的原理是根据溶液中高分子溶质与填料孔隙的互相
排斥作用来进行分离。
这种技术在生物化学、药物研究、聚合物科
学等领域得到了广泛应用。
以下是一些关于SEC的文献：
1. "Size-exclusion chromatography of polymers"，作者，J.
C. Giddings，出版年份，1981。
这篇文献是关于聚合物的分子排阻色谱法的经典著作，介绍了SEC在聚合物研究中的原理、方法和应用。
2. "Characterization of protein aggregates by size exclusion chromatography"，作者，M. L. Manning等，出版年份，2010。
这篇文献介绍了利用SEC对蛋白质聚集物进行表征的方法，对
于生物制药和生物化学领域的研究具有重要意义。
3. "Size-exclusion chromatography of liposomes:
problems and possibilities"，作者，A. K. Bangham等，出版年份，1978。
这篇文献讨论了利用SEC对脂质体进行分离和分析的问题和可能性，对于药物传递系统的研究具有重要参考价值。
以上文献涵盖了SEC在不同领域的应用，从聚合物到蛋白质和脂质体的分离和分析，展示了SEC作为一种重要的分离技术在科学研究中的广泛应用。
SEC技术的不断发展和改进将进一步推动相关领域的研究和应用。
分子排阻色谱法的分离原理
分子排阻色谱法的分离原理
分子排阻色谱法的分离原理：
①分子排阻色谱SEC亦称凝胶渗透色谱GPC是一种基于分子尺寸差异进行分离的液相色谱技术广泛应用于聚合物小分子蛋白质等大分子物质的分析；
②SEC的核心部件为填充有微孔凝胶的色谱柱这些凝胶珠内部含有不同孔径大小的通道；
③当样品溶液被泵入柱中后随流动相一起流经凝胶珠大分子由于尺寸限制无法进入较小孔径只能在珠外间隙中流动；
④较小分子则可以进入较大孔径内部路径较长因此在柱中停留时间增加；
⑤由于路径长度不同各组分在柱中滞留时间存在差异从而实现按分子量从大到小依次流出；
⑥检测器通常采用示差折射率RID检测器或紫外UV检测器根据流出物浓度变化记录洗脱曲线；
⑦通过与标准样品比较可以计算出未知样品的分子量分布重均分子量数均分子量等参数；
⑧在聚合物分析中SEC能够提供关于分子量分布支化程度等重要信息帮助研究人员优化合成工艺；
⑨对于蛋白质多糖等生物大分子SEC可用于纯化鉴定分子量测定等研究工作中；
⑩实验过程中需注意选择合适孔径的凝胶以及流动相比例以确
保分离效果；
⑪完成一次分析后还需对色谱柱进行再生处理去除残留样品恢复初始分离能力；
⑫总结SEC作为一种高效简便的分离手段在高分子科学生物医药等领域发挥着重要作用。
分子排阻色谱法;吸附
分子排阻色谱法;吸附分子排阻色谱法（Size-exclusion Chromatography，SEC）是一种常见的色谱分析技术，它基于样品分子在分离柱中的不同透过程度，实现对分子的分离和鉴定。
而吸附则是SEC分析中的一个重要概念，它影响着样品分子与固定相之间的作用，从而对分离结果产生重要影响。
一、分子排阻色谱法的原理及特点分子排阻色谱法基于分子在柱中孔隙的不同透过程度，将分子进行分离。
具体而言，较大分子由于体积较大，无法进入小孔隙，因此在柱中的透过程度较低，保持在较早的洗脱峰；而较小分子则能进入更多的孔隙，透过程度较高，保持在较晚的洗脱峰。
这样，通过调节柱的孔隙大小，就可以实现对不同大小分子的分离。
分子排阻色谱法具有许多优点。
首先，它不需要样品的前处理，避免了溶剂选择和配制的繁琐步骤。
其次，SEC适用于各种种类的样品，包括有机溶剂、水溶液和高分子化合物等。
还有，SEC对样品的分散性和溶解度没有要求，因此，即使样品复杂或杂质较多，也能够得到准确的分离结果。
二、吸附对SEC分析的影响在分子排阻色谱法中，吸附效应是一个不可忽视的因素。
它指的是样品分子与固定相之间的相互作用，包括静电吸引、溶剂毒性等。
当分子与固定相之间的吸附作用较强时，样品分子容易被吸附在固定相上，从而导致分子在柱中的透过程度降低，分离效果变差。
针对吸附效应的影响，可以采取一些措施来减小吸附作用。
首先是选择合适的流动相，选择非极性溶剂或增加有机溶剂的含量，可以减少分子与固定相之间的相互作用。
其次是选择合适的固定相材料，如改进柱填料的表面特性，增强柱的亲水性或疏水性，都可以减小吸附的发生。
此外，控制温度、pH值等因素也对减小吸附效应具有重要作用。
三、分子排阻色谱法在实际应用中的意义分子排阻色谱法在许多领域中都有着广泛的应用。
首先，在药物研发中，分子排阻色谱法常用于药物分子的纯度分析、配方优化和质量控制等方面。
其次，在高分子材料领域，SEC可以用于分析高分子材料的分子量及分子量分布。
尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
2.分级分离 当被分离的物质之间分子量比较接近时，根据其分配系数的 分布和凝胶的工作范围，把某一分子量范围内的组分分离出 来，称作分级分离。分级分离的分辨率比组别分离高，但流 出曲线之间容易重叠。例如，将纤维素部分水解，然后用葡 聚糖凝胶G-25可以分离出1~6个葡萄糖单位纤维素糊精的低 聚糖，它们的分子量范围从180~990，恰在葡聚糖G-25的工 作范围（100~5000）内。 分级分离常用于分子量的测定。根据分离要求选择凝胶。这 种分离要使物质完全分离是比较困难的。
谢谢！
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
仪器分析――分子排阻色谱法
仪器分析――分子排阻色谱法分子排阻色谱法是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。
色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶Sephadex和聚丙烯酰胺凝胶Sepherose等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。
1．对仪器的一般要求来源:考试大分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。
在药物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC）。
应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。
使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH值在2～8范围。
流动相中可进入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过高，一般为0.5～1.0ml/min.2．系统适用性试验高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中（1）色谱柱的理论板数（n）、（2）分离度、（3）重复性、（4）拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：除另有规定外，分离度应小于2.0。
3．测定法（1）分子量测定法按各品种项下规定的方法，一般适用蛋白质多肽的分子量测定。
选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（MW）的对数对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程logMW=a+btR，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
sec排阻色谱
sec排阻色谱
SEC（Size Exclusion Chromatography），即排阻色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
它根据待测物质的体积和质量差异导致的在色谱柱中的洗脱速度和时间差异实现待测物质的多种表征，如分子量、分子量分布和纯度等。
SEC被广泛应用于表征蛋白生物药中的体积异构体，这是因为在开发、生产、运输和储存等过程中，蛋白生物药容易形成高分子量（HMW）聚集体和低分子量（LMW）片段等体积异构体。
这些体积异构体可能导致蛋白药物出现免疫原性反应、药代动力学或效价差异等，因此需要对这些关键质量属性（CQA）进行表征。
SEC是分析ADC药物体积异构体的标准技术。
此外，SEC还分为凝胶过滤色谱法（GFC）和凝胶渗透色谱法（GPC）。
GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水；而GPC则主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
请注意，排阻色谱可能不适用直径比最小孔隙直径小的分子或比凝胶颗粒内部通道直径大的分子，这两种情况下，分子可能无法通过凝胶床或者全部进入凝胶颗粒内部，因此不能实现有效的分离。
尺寸排阻色谱法
排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相 似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。
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溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离
效果。
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常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
观
移动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。
6.生物相容性好，有很高的活性回收率。
类型
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凝胶过滤色谱：用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。 凝胶的代表是葡萄糖系列；流动相是水
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凝胶渗透色谱法：用于分析高聚物的摩尔质量，如：聚乙 烯、聚氯乙烯等。
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常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶；流动相是有机溶剂（四 氢呋喃）
凝胶
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定义：指含有大量液体 (一般是水) 的柔软而富于弹性的物质，它是一 种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
分子排阻色潽法对所用的凝胶的基本要求：
a. 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复使用而不改变其 色谱性质。
b. 尽可能不带电荷以防止发生离子交换作用。
c. 颗粒大小均匀，机械强度尽可能高。
固定刚性凝胶三类。
软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微 孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水 溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高 效液相色谱中 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯 （Styragel）比软性凝胶稍耐压 ，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液 相色 谱时，流速不宜大。
刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂 又可用有 机溶剂作流动相 ，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强 小于7MPa，流速＜1cm3· s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离 。
排阻色谱法
排阻色谱法
排阻色谱法，又称为凝胶渗透色谱法或凝胶色谱法，是一种常用的分离技术。
其理论基础是溶质分子通过多孔固定相时，按其大小受到不同程度的阻滞，从而实现分离。
在排阻色谱法中，常用的固定相有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。
这些固定相具有不同尺寸的孔，能够按照一定的规律分布，并在制造过程中加以控制。
试样中的溶质分子，即溶质的体积，大小不同。
对于齐聚物，分子大小的分布也有一定规律。
当溶质分子通过固定相的孔时，如果分子的直径大于孔的直径，则该分子不能进入孔中，随着流动相迅速流出。
如果分子的直径小于孔的直径，则该分子可以进入孔中，其流出速度较慢。
值得注意的是，即使分子可以进入孔中，由于小分子在孔中扩散的体积较大，而大一点的分子扩散的体积较小，因此小分子将占据较多的孔体积，流出速度最慢；大一点的分子占据较少的体积，先流出。
排阻色谱法的流动相可以分为两部分，一部分在颗粒内部，相当于液液分配色谱中的固定液体积；另一部分在颗粒间，类似于液液分配色谱中的死体积。
排阻色谱法广泛应用于高分子聚合物的分离和纯化，例如蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。
此外，该方法还可用于多肽的脱盐、DNA片段的分离、DNA碱基组成的测定等。
总的来说，排阻色谱法是一种非常有用的分离技术，可用于许多领域的研究和生产。
尺寸排阻色谱法
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
分子排阻色谱的上样量可比其他色谱形式大些，如果是组别 分离，上样量可以是柱床体积的25%~30%；如果分离K值相 近的物质，上样量为柱床体积的2%~5%。 柱床体积：每克干凝胶溶胀以后在柱中自由沉积所成床的 体积
（三）洗脱 洗脱剂的作用原则上没有其他液相色谱要求严格，因为样 品的分离并不依赖与溶剂和样品间的相互作用力。一般要求 洗脱剂与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂相同。因为如果换溶剂， 凝胶体积会发生变化，从而影响分离效果。除非含有较强吸 附的溶质，一般洗脱剂用量也仅需一个柱体积。完全不带电 荷的物质可用纯溶剂如蒸馏水洗脱，若分离物质有带电基团， 就需要用有一定离子强度的洗脱剂如缓冲溶液等，浓度至少 0.02M。 对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液，如 水 -甲醇、水 – 乙醇等，以降低吸附，将组分洗下。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定体积分段收集，然后再 用适当的方法分析组分流出和分离情况。
空间排阻色谱法
空间排阻色谱法
空间排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC），又称凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC），是一种分子大小分析的色谱技术。
这种色谱法常被用于生物大分子（如蛋白质、多肽、核酸）或合成高分子（如聚合物）的分析。
工作原理：
•SEC基于分子在凝胶柱（通常是多孔聚合物凝胶）中的排阻效应进行分离。
•大分子无法穿过凝胶的小孔，因此在柱中排阻，留在柱外的小孔中，分子的运动速度较慢。
•小分子可以进入凝胶的小孔中，运动速度较快。
•当分子尺寸增加时，其在柱中的停留时间增加，因此通过检测可以得到分子的大小分布。
步骤：
1.样品注入：样品溶液通过自动进样器被注入到色谱柱。
2.分离：样品在柱中通过排阻凝胶，分子根据大小被分离。
3.检测：分离后的组分经过检测器，通常是光散射检测器、折射
率检测器等。
4.数据分析：通过分析检测信号，可以得到样品分子大小的信息。
应用：
•生物大分子研究：用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分析。
•聚合物研究：用于聚合物分子量分布和聚合度的测定。
•药物开发：用于药物的质量控制和药物传递系统的研究。
SEC是一种非常有用的技术，能够提供有关分子大小、分子量分布等信息，因此在生物化学、化学、药物开发等领域得到广泛应用。
排阻色谱法的分离原理
排阻色谱法的分离原理
排阻色谱法（RPC）是一种生物分离和纯化技术，它通过利用流体力学的原理，来实现疏水性分子实现分离纯化。
它利用两种不同的溶剂，一种低渗透性溶剂（solvent）和一种高渗透性溶剂（eluant），来能够分离出一种物质。
排阻色谱法的分离原理依赖于溶剂的流速，这种流速与物质的相对分子质量（MW）和溶剂的活度（acitivity）有关。
在排阻色谱法过程中，溶剂就像一条流动的河流一样，从而实现物质的分离。
溶剂从最低MW的区域开始流动，然后由低到高的区域流动。
由于具有低MW的物质可以更容易地通过溶剂，因此它们被“冲走，”而那些具有高MW的物质，则被“拉后”，也就是说，它们跟着溶剂往后流动。
随着溶剂继续流动，具有不同MW的物质被分离开来。
排阻色谱法的正确使用可以有效地分离出目标物质，并且更加精确。
然而，如果不采用合适的参数或溶剂，将会得到不到预期的结果，因此有必要考虑以下几点：
1）排阻色谱法应该选择适宜的渗透性溶剂，以便最大程度地分离出目标物质。
2）流动速率应该选择适当的速度，以便降低多余的冲走，并有效地拉后目标物质。
3）活度也应该选择适当的活度，以便更好地分离出目标物质。
4）如果存在多种目标物质，应该采取适当的步骤，以便有效地分离出它们。
总之，排阻色谱法是一种有效的生物分离纯化技术，它可以有效地帮助研究人员分离出感兴趣的物质，同时也为研究人员提供了大量有用的信息。
排阻色谱法
一、分离原理排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。
色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。
凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。
仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。
对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。
小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。
因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。
将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。
如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。
很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。
随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。
将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。
如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。
凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。
同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。
可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。
分子排阻色谱法
分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是一种非常有效的离子分离分析技术，它可以检测离子的浓度、活性和离子在系统中的分布。
分子排阻色谱法是一种根据离子的排阻来分离离子的技术，它可以有效地检测离子的浓度，是一种非常有效的离子分离技术。
分子排阻色谱法是一种以离子排阻为基础的技术，它可以有效地检测各种离子的浓度。
离子排阻是一种由离子亲和力所驱动的力，它可以把不同类型和浓度的离子分离开来。
这种技术在检测不同类型和浓度的离子时非常有效。
此外，分子排阻色谱法还能够检测离子的活性，以及离子在系统中的分布。
在实际应用中，分子排阻色谱法可以用于鉴定某些特定的离子，也可以用于检测某些特定的溶液的离子浓度和分布。
例如，可以用分子排阻色谱法来检测水溶液中的钠离子，也可以用来检测某些金属离子在溶液中的浓度，如铜离子、铁离子和锰离子。
此外，它还可以用于检测各种离子的活性，以及检测溶液中各种离子的分布情况。
分子排阻色谱法是一种有效的离子分析技术，它可以检测各种离子的浓度、活性和离子在系统中的分布。
它可以有效地检测不同类型和浓度的离子，并且可以检测离子的活性和离子在系统中的分布。
此外，分子排阻色谱法还可以用于鉴定某些特定的离子，也可以检测某些特定的溶液的离子浓度和分布。
由此可见，分子排阻色谱法在分离离子分析中具有重要的应用价值。
简述分子排阻色谱法的原理及应用
简述分子排阻色谱法的原理及应用
分子排阻色谱法是一种液相色谱分析方法，其原理基于溶质分子与固定相的相互作用，通过改变溶质与固定相的相互作用程度来实现分离和定量分析。
分子排阻色谱法使用一种多孔吸附剂作为固定相，其孔径大小与目标溶质分子的大小相当，以限制大分子进入孔道并增加溶质在固定相中的停留时间。
基于分子尺寸排斥效应的分离原理，大分子由于无法进入吸附剂的孔道中而流过，而小分子则能进入孔道中进行分离。
因此，分子排阻色谱能够对混合物中的分子进行大小分离。
分子排阻色谱法的应用非常广泛。
例如，在生物分析领域，可以使用分子排阻色谱法对蛋白质和多肽进行分析和定量。
在药物研究中，可以利用分子排阻色谱法对药物的分子量和纯度进行分析。
此外，分子排阻色谱还可以用于分析聚合物、有机物和无机离子等物质。
总结来说，分子排阻色谱法的原理是通过控制固定相的孔径大小来实现分子的大小分离，应用广泛涉及生物分析、药物研究和化学分析等领域。
分子排阻色谱法流程
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1. 样品制备。
将待分析样品溶解在适当的溶剂中。
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六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
凝胶渗透色谱法-GPC
二、基本原理
(一) 分子筛效应
凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构 上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表 现分子筛效应。
（二）排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝 胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的 分子不能达到分离效果。
凝胶色谱仪
品牌：
GPCmax TDA 305
OmniSEC
UV-PDA
凝胶色谱系统
输液系统 1. 贮液器（Reservoir） 2. 流量泵（Pump) 3. 脱气机（Degassor） 1. 人工进样器（Manual Sampler） 2. 自动进样器(Auto Sampler） GPC Max
进样系统
1. 色谱柱（Column）
分离系统 2. 柱后过滤器（Post-Column Filter） 1. 浓度检测器（Concern. Detec.） 2. 分子量检测器（MW Detec.） 3. 分子分布检测器（MW Distri. Detec.)
检测系统
TDA 305
记录系统
1. 分析软件（OmniSEC）
（6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积 可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用；
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
样品分析
在相同条件下，得到样品 色谱图，根据保留体积即 可得到其对应的相对分子 质量。而且峰面积（峰高） 与分子数目成正比。
（二）样品溶液的处理
①如有沉淀应过滤或离心除去;
②如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去
③样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分
离效果。
④上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
（2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质 的相对分子质量范围。
（3）溶胀率：
某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要 用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分 率称为溶胀率，即
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
（一）葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
葡聚糖凝胶的立体网状结构
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不 活泼性，故具有较高的稳定性。
多肽、蛋白质、核酸、多糖等
常用凝胶
葡萄糖系列 条件温和，产品回收率近100%， 易实施循环操作，提高产品纯 度，分析速度快，精度高，分 离机理简单，操作参数少。
优点
操作简便，进样量小，重现性 好，自动化程度高
缺点
质脆易碎，柱子装填不紧，柱 效低。
选择性低，料液处理量小，洗 脱后产品被稀释
三、固定相与流动相
流动相的选择
☺ 必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝
胶。
☺ 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
☺ 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水
等。
固定相——凝胶：一种经过交联而具有立体网状结构的 多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。 分类：
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
参考文献
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3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.51.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 物质的分离。
（二）聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰 胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
（三）琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网 状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多 条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝 胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭 菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
五、影响分离特性的因素
1、填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比 是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱， 其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长 60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多 用于快速分离。
[7] 陶澍, 武会先, 张宗敏. 水生腐殖酸分子量分布研究——Ⅰ.串联凝胶色谱法测定水生腐殖酸分子 量分布[J]. 环境科学学报, 1990,(01)
[8] Kuo, K. C., R. A. McCune, C. W. Gehrke, R. Midgett, and M.Ehrlich. 1980. Quantitative exclusion chromatographic determination of major and modified deoxyribonucleosides in DNA. Nucleic Acids Res. 8:4763- 4776. [9] . Mischke, C. F., and E. Wickstrom. 1980. Deoxynucleoside composition of DNAs and modified nucleoside composition of tRNAs determined at nanomole sensitivity by exclusion chromatography. Anal. Biochem. 105181-187.
（四）亲脂性胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合 而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子 材料的分离和分析。 2、葡聚糖凝胶LH-20：是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基 以代替羟基的氢，成醚键结合状态，因而具备了一定的亲脂 性，适用于分离黄酮、色素等有机物。 3、无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机 械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品 需注意。