排阻色谱法

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(6)孔隙体积(void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积,即V0值。孔隙体积 可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求:
(1)亲水性高,表面惰性,即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用;
(2)稳定性强,在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定,使用寿命长; (3)具有一定的孔径分布范围; (4)机械强度高,允许较高的操作压力。
(四)亲脂性凝胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶:应用范围广,由苯乙烯和二乙烯苯聚合 而成。机械性能好,孔隙分布比较宽,多应用于合成高分子 材料的分离和分析。 2、葡聚糖凝胶LH-20:是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基 以代替羟基的氢,成醚键结合状态,因而具备了一定的亲脂 性,适用于分离黄酮、色素等有机物。 3、无机凝胶:无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃,机 械性能好,选择性高。但其吸附性较大,处理极性大的样品 需注意。
样品分析
在相同条件下,得到样品 色谱图,根据保留体积即 可得到其对应的相对分子 质量。而且峰面积(峰高) 与分子数目成正比。
(二)样品溶液的处理
①如有沉淀应过滤或离心除去;
②如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去
③样品的粘度不可大,含蛋白为超过4%,粘度高影响分
离效果。
④上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
(溶胀处理平衡后重量 干燥重量) 溶胀率 100% 干燥重量
(4)凝胶粒径:
一般为球形,其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小, 分离效率越高。软凝胶粒径较大,一般为50~150m,硬凝胶粒 径较小,一般为5~50m。
(5)床体积(bed volume) 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
交联度大的孔隙小,吸液膨胀也少,可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大,吸液膨胀也大,适用于大分子 物质的分离。
(二)聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰 胺为单位,由甲叉双丙烯酰胺交联成的,干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
(三)琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网 状结构。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多 条件下使用(如水,pH4-9范围内的盐溶液)。琼脂糖凝 胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭 菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
排阻色谱法
一、简

(一)定义:排阻色谱法(size exclusion chromatography, SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等,是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子,凝 胶的代表是葡萄糖系列,洗脱溶剂 主要是水。 (二)分类: 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离,常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶,洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱仪

品牌:wenku.baidu.com
GPCmax TDA 305
OmniSEC
UV-PDA
凝胶色谱系统
输液系统 1. 贮液器(Reservoir) 2. 流量泵(Pump) 3. 脱气机(Degassor) 1. 人工进样器(Manual Sampler) 2. 自动进样器(Auto Sampler) GPC Max
2、按化学性质分为有机凝胶(均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶);无机凝胶(非均匀凝胶)。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
(一)葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶,由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
葡聚糖凝胶的立体网状结构
由于分子内含有大量羟基而具有极性,在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒,因醚键的不 活泼性,故具有较高的稳定性。
多肽、蛋白质、核酸、多糖等
常用凝胶
葡萄糖系列 条件温和,产品回收率近100%, 易实施循环操作,提高产品纯 度,分析速度快,精度高,分 离机理简单,操作参数少。
优点
操作简便,进样量小,重现性 好,自动化程度高
缺点
质脆易碎,柱子装填不紧,柱 效低。
选择性低,料液处理量小,洗 脱后产品被稀释
三、固定相与流动相
六、应 用
(大分子)分子量的测定 (大分子)分子量分布的测定
(中小分子)有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱(原油及其重质组分的评价) 样品净化(预处理)
(一)分子量的测定方法
凝胶柱的标定:
用一系列已知相对分子质 量M的标准品(最好与样品 化学组成相同),测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve(或保留时间),绘 制lgM-Ve曲线。
3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低,分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时,蛋白质的分离度好;在 0.51.0ml/min时,对于7.5mm直径的柱子,分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%,样品体积是柱体积的1-3%。
[7] 陶澍, 武会先, 张宗敏. 水生腐殖酸分子量分布研究——Ⅰ.串联凝胶色谱法测定水生腐殖酸分子 量分布[J]. 环境科学学报, 1990,(01)
[8] Kuo, K. C., R. A. McCune, C. W. Gehrke, R. Midgett, and M.Ehrlich. 1980. Quantitative exclusion chromatographic determination of major and modified deoxyribonucleosides in DNA. Nucleic Acids Res. 8:4763- 4776. [9] . Mischke, C. F., and E. Wickstrom. 1980. Deoxynucleoside composition of DNAs and modified nucleoside composition of tRNAs determined at nanomole sensitivity by exclusion chromatography. Anal. Biochem. 105181-187.
凝胶渗透色谱法-GPC
二、基本原理
(一) 分子筛效应
凝胶本身具有三维网状结构,大分子在通过这种网状结构 上的孔隙时被排阻,小分子通过时被滞留。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队”,凝胶表 现分子筛效应。
(二)排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝 胶颗粒以外,叫做全排除,两种或两种以上的这样的 分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部,这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱(GPC)
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱(GFC)
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量,如: 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
流动相的选择
☺ 必须能溶解样品,与凝胶本身非常相似,这样才能润湿凝
胶。
☺ 溶剂的粘度要小,因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
☺ 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水
等。
固定相——凝胶:一种经过交联而具有立体网状结构的 多聚体,含有大量液体(一般是水),柔软而富于弹性。 分类:
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
凝胶特性参数
(1)排阻极限(exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
(2)分级范围(fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质 的相对分子质量范围。
(3)溶胀率:
某些市售的干燥凝胶颗粒(如Sephadex G系列),使用前要 用水溶液进行溶胀处理,溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分 率称为溶胀率,即
参考文献
[1]白颖,李建伟.凝胶色谱法测定高聚物的平均分子量及分子量分布[J].塑料科技,2007,(04)
[2]衣学飞,张涛,张艳丽,李义君.凝胶色谱法测定BOPP分子量及其分布[J].炼油与化工,2007(02) [3]刘咏梅.凝胶渗透色谱在农药残留分析中的应用[D].北京化工学.2004 [4]陈贤苓,雷中方.凝胶色谱法测定木素的分子量分布[J].实验室研究与探索,1993 [5]陈建华,王均甫,宋兰英,陈同军.凝胶色谱法测定顺丁橡胶平均分子量及其分布的研究[J].色 谱,1998,(02) [6]成越祖.用TI-59型计算机计算高聚物凝胶色谱的积分分子量分布[J].石油炼制与化工,1992,(05)
进样系统
1. 色谱柱(Column)
分离系统 2. 柱后过滤器(Post-Column Filter) 1. 浓度检测器(Concern. Detec.) 2. 分子量检测器(MW Detec.) 3. 分子分布检测器(MW Distri. Detec.)
检测系统
TDA 305
记录系统
1. 分析软件(OmniSEC)
五、影响分离特性的因素
1、填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比 是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱, 其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比,一般柱长 60-120cm对于蛋白质的分离比较理想,而30cm的柱子多 用于快速分离。
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