尺寸排阻色谱法
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
体积排阻色谱
一. 分离原理尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。
排阻色谱的固定相多为凝胶。
凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。
凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。
尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。
尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。
因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。
经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。
当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：Xm ⇌ Xn组分的分配系数为：尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1二. 固定相尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。
无机凝胶：又称硬质凝胶。
是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。
有机凝胶：又称半硬质凝胶。
如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。
但在有机溶剂中有轻度膨胀。
新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。
三. 流动相尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。
(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。
尺寸排阻法
廖杰
董方霆
于力方
赵玉兰
概述
溶液中的蛋白质在受热或高浓度变性剂的存在 下, 三级结构发生改变,生物活性降低或消失,测定 变性转化点,对蛋白质去折叠的热力学研究, 找到蛋 白质的最大稳定温度,对研究蛋白质的变性与复性, 有指导意义。尺寸排阻色谱,又称凝胶过滤色谱,由 于它可以监测到由构象变化引起的蛋白质分子半径 的改变,已经成为研究蛋白质折叠的实验手段。近年 来柱填料的发展使其具有更高的分辨率、能够在更 高的温度下操作,为动态研究 变性过程中蛋白质分 子的细微变化提供了条件。
温度引起的尺寸排阻色谱 Kd值变化 荧光检测色谱峰面积的变化
• 讨论
实验中采用了两种方法对核糖核酸酶 A 的热变 性转化点进行了测定。当蛋白质受 热发生伸展去折叠时，不仅分子半径发生了 变化，而且内源性荧光也随之改变。荧光发 射光谱和荧光强度的变化反映了蛋白质分子 中色氨酸、酪氨酸残基微环境的改变，天然 状态下埋藏在分子内的疏水肽链随温度增加 逐渐暴露，采用荧光检测器可以同时监测到 这一变化过程中荧光强度的改变。
分析方法
蛋白质的构象改变热变性：称取蛋白质样品约1mg， 溶解于选定的流动相中，配制成1.0mg/mL的溶液。将蛋 白质溶液置于HP5890气相色谱柱温箱内，设定不同温度， 在每个温度下平衡20分钟后，吸取20μL注入HPLC系统。 在盐酸胍溶液中的变性：将待测蛋白质溶液在含6mol/L盐 酸胍的流动相（pH6.0）中，配制成1.0mg/mL的溶液，室 温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统（流动相中含 6mol/L 盐酸胍，pH6.0）。在尿素溶液中的变性:称取蛋 白质样品约1mg,溶解 在流动相中,配制成1.0mg/mL的溶 液。流动相中尿素浓度以0.5mol/L步进,每次平衡20分钟 后,进样10μL。
荧光检测尺寸排阻色谱fsec_概述说明以及解释
荧光检测尺寸排阻色谱fsec 概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在生物分析和医药领域中，荧光检测尺寸排阻色谱（fsec）是一种重要的分析技术。
该技术结合了荧光检测技术原理、尺寸排阻色谱原理和fsec技术，具有高灵敏度、高分辨率和广泛的应用范围等优势。
本文将对这一领域的研究进行概述，并探讨其在生物分析和医药领域中的应用、发展前景以及面临的挑战与解决方案。
1.2 文章结构本文共分为五个部分。
首先是引言部分，介绍文章的背景和目的。
其次是荧光检测尺寸排阻色谱fsec的概述部分，包括荧光检测技术原理、尺寸排阻色谱原理和fsec技术简介。
第三部分详细介绍了fsec在生物分析中的应用，包括蛋白质、DNA/RNA和细胞领域中的研究进展。
第四部分探讨了fsec在医药领域的发展前景和挑战，包括其在新药研发和药物筛选中的应用前景以及面临的挑战和解决方案。
最后，在结论部分对全文进行总结。
1.3 目的本文旨在综述荧光检测尺寸排阻色谱fsec的概念、原理、应用、发展前景和挑战，以促进该技术在生物分析和医药领域的应用和推广。
通过全面了解fsec技术，我们将能够更好地利用该技术来进行蛋白质、DNA/RNA和细胞等生物分析，并预测其在新药研发和药物筛选中的潜在作用。
最后，我们希望为fsec技术的进一步改进和应用提供思路，并寻求解决当前所面临挑战的有效途径。
2. 荧光检测尺寸排阻色谱fsec 概述：荧光检测尺寸排阻色谱（Fluorescence Size Exclusion Chromatography，简称fsec）是一种基于荧光检测技术和尺寸排阻色谱原理的分析方法。
该方法结合了荧光分析的高灵敏度和尺寸排阻色谱的高分辨率，广泛应用于生物分析领域。
2.1 荧光检测技术原理：荧光检测技术利用物质在激发后产生的特定波长的荧光信号来进行分析。
当样品中的目标物质受到激发时，会发生能级跃迁并产生荧光。
通过检测样品所发出的荧光强度和波长，可以获得有关目标物质的信息。
排阻色谱法
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
色谱分离技术原理及其的应用
色谱分离技术原理及其的应用色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。
此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。
然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。
色谱法也由此而得名。
现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。
我们仍然叫它色谱分析。
一、色谱分离基本原理：由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。
使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。
与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。
二、色谱分类方法：色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。
从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可GCLC）。
固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。
70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
色谱分析第六章凝胶色谱法
第六章空间排阻色谱法第七章第一节概述一、定义空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。
它是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂、对高分子物质有很高的分离效果，被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
空间排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质——凝胶。
二、基本原理分子筛效应：凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。
在凝胶色谱中，作为固定相的凝胶是一种不带电荷的具有三维空间网状结构的基质，每个颗粒的细微结构如同一个筛子，所有筛孔的直径是一致的。
凝胶的这种结构使得小分子可在筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，如此起到筛分大小分子的作用。
当含有大小分子的混合物样品加入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。
相对分子质量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱；相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。
样品中分子大小不同的物质如此逐渐分离。
其分离过程如下： 1、混合物上柱； 2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于凝胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4、大小分子完全分开；5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。
三、特点：1、设备简单、操作方便、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对凝胶进行再生处理，减少了工作量；3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果好，重复性高；4、洗脱条件温和，一般采用低离子强度（0.01mol/L）的洗脱剂，有些情况下甚至可以用水，所以不易使有效成分失活变性。
凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢 2、分离时必须严格控制流速 3、样品黏度不宜过高 4、存在非特异性吸附现象应用： 1、分子的组别分离、分级分离及制备； 2、测定生物大分子的相对分子质量；3、高效率样品脱盐，一次脱盐达95％以上；4、去除热源物质；5、吸水，分批法浓缩样品；6、更换样品缓冲液。
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2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得 多（约5～30cm），所以柱外展宽（又 称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在 死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起往前展宽的主要因素， 因此高效液相色谱法中对进样技术要求 较严。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料 （＜20µm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱 内，经冲洗后，即可备用。
4．检测系统
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:
2固定相
由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此， 对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固 定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固 定液β，β′一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非 极性的角鲨烷等。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生 了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过 化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固 定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速 发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱 法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固 定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 键合固定相上进行的。详细介绍见后。
3．流动相
在液液色谱中为了避免固定液的流失。对 流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固 定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极 性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配 色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极 性，称为正相分配色谱 正相分配色谱，它适用于极性化合物 正相分配色谱 的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性 流出顺序是极性小的先流出， 流出顺序是极性小的先流出 大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定 大的后流出 相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极 性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好 相反。
尺寸排阻色谱法原理
尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。
在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。
定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
尺寸排阻色谱法
排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相 似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。
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溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离
效果。
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常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
观
移动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。
6.生物相容性好，有很高的活性回收率。
类型
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凝胶过滤色谱：用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。 凝胶的代表是葡萄糖系列；流动相是水
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凝胶渗透色谱法：用于分析高聚物的摩尔质量，如：聚乙 烯、聚氯乙烯等。
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常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶；流动相是有机溶剂（四 氢呋喃）
凝胶
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定义：指含有大量液体 (一般是水) 的柔软而富于弹性的物质，它是一 种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
分子排阻色潽法对所用的凝胶的基本要求：
a. 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复使用而不改变其 色谱性质。
b. 尽可能不带电荷以防止发生离子交换作用。
c. 颗粒大小均匀，机械强度尽可能高。
固定刚性凝胶三类。
软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微 孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水 溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高 效液相色谱中 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯 （Styragel）比软性凝胶稍耐压 ，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液 相色 谱时，流速不宜大。
刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂 又可用有 机溶剂作流动相 ，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强 小于7MPa，流速＜1cm3· s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离 。
色谱法的分类及其原理
色谱法的分类及其原理（一）按两相状态气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法（二）按固定相的几何形式1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。
3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。
（三）按分离原理按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。
适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。
2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。
3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。
离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。
它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。
4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。
这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。
被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
尺寸排阻色谱法
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
分子排阻色谱的上样量可比其他色谱形式大些，如果是组别 分离，上样量可以是柱床体积的25%~30%；如果分离K值相 近的物质，上样量为柱床体积的2%~5%。 柱床体积：每克干凝胶溶胀以后在柱中自由沉积所成床的 体积
（三）洗脱 洗脱剂的作用原则上没有其他液相色谱要求严格，因为样 品的分离并不依赖与溶剂和样品间的相互作用力。一般要求 洗脱剂与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂相同。因为如果换溶剂， 凝胶体积会发生变化，从而影响分离效果。除非含有较强吸 附的溶质，一般洗脱剂用量也仅需一个柱体积。完全不带电 荷的物质可用纯溶剂如蒸馏水洗脱，若分离物质有带电基团， 就需要用有一定离子强度的洗脱剂如缓冲溶液等，浓度至少 0.02M。 对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液，如 水 -甲醇、水 – 乙醇等，以降低吸附，将组分洗下。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定体积分段收集，然后再 用适当的方法分析组分流出和分离情况。
排阻色谱法
一、分离原理排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。
色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。
凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。
仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。
对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。
小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。
因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。
将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。
如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。
很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。
随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。
将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。
如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。
凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。
同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。
可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。
GPC基础知识
12
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GPC系统配置
进样器
泵
色谱柱
检测器
柱温箱
THF, 氯仿, DMF
示差检测器
需要GPC软件才可计算MW
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Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited
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间接方法
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为什么要用GPC方法
相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质 有重要影响。 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们 关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物 的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应 用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合 物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测 定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和 有效的技术。
排阻极限 (聚苯乙烯)
1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802), 2x104(GPC8025), 7x104(GPC-803), 4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M), 2x108(GPC-807)
THF、氯仿、DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并 且最好是处在校正曲线线性范围内
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尺寸排阻法SEC色谱柱的选择
快速分析（节约溶剂） 高性能型（节约溶剂） 超高速型（节约溶剂） 标准曲线直线性好
超高速型（节约溶剂） 标准曲线直线性好
快速分析（节约溶剂） 超高速型（节约溶剂） 标准曲线直线性好
页码
38 38 38 42 42 42 42 26 46
50 56 56 58 62 52 54 58 62 42 42 64 64 64 66 66 58 62
GF-HQ系列
48
SEC色谱柱适用范围一览
高
溶剂的极性
水 (H2O)
甲醇 (Methanol)
二甲亚砜 (DMSO)
乙腈 (Acetonitrile)
பைடு நூலகம்
N－N－ 二甲基甲酰胺
四氢呋喃
(DMF)
(THF)
氯仿 (Chloroform)
KW-800系列, LW-803, KW400系列 SB-800 HQ系列, LB-800系列 GS-HQ系列 GF-HQ系列 KD系列
水、盐溶液
标准聚合物样品分析
THF 氯仿
极性聚合物样品分析 （聚酰亚胺，聚乙烯吡咯烷酮等）
DMF
高温分析 （聚乙烯、聚丙烯等）
ODCB等
工程塑料的常温分析 （聚酰胺(尼龙）、 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等）
HFIP
色谱柱
KW-800系列 LW-803 KW400系列 SB-800 HQ系列 LB-800系列 SB-800 HQ系列 LB-800系列 KS-800系列 GS-HQ系列
36 *有机溶剂色谱柱的溶剂置换请参考第68页
KF, K, HK, LF系列
低
甲苯 (Toluene)
尺寸排阻法（SEC）色谱柱的选择
水溶性 SEC（GFC） 色谱柱
GPC
– 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯 共聚物
高聚物的性能特别是机械性能、加工性
能及高分子在溶液中的特性等都与高聚物分 子量有关。如冲击强度、模量、拉伸强度、 耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分 子量分布有关(分子量低易碎，分子量高难加工)。例 如，一般的聚苯乙烯制品平均分子量为十几 万，如果分子量低到几千极易粉碎，几乎没 有应用价值。当分子量达到20万以上时，其 机械性能较好，但分子量达到百万以上时， 又难以加工，也失去实用价值。
一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在 0.05~0.5%（质量分数）范围内配置。分子质量越 大，溶液浓度越低。
标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室 温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超 声或者剧烈振荡来加速溶解。
溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入 色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。
2 17.0
3
4 5
6 7
8
18.0
19.0
20.0
21.0 min
mV(x10) Detector B
1.0
样品分析结果
17.723
0.0
-1.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
Mn
Mw
Mz
Mz1
Mw/Mn Mz/Mw
43679 73178 101377 125121 1.67534 1.38536
结果评价示例
PS1和PS2为同一操作人员测定同一样品的两次测定结果 PS3为另一实验室对同一样品测得的结果
例
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3、无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机 械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品 需注意。
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
主主要要是用水于。有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量
分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝
凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶渗透色谱法-GPC
二、基本原理
(一) 分子筛效应
凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构 上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表 现分子筛效应。
采用水溶液或缓冲液作为流动 相
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等
多肽、蛋白质、核酸、多糖等
常用凝胶
交联聚苯乙烯凝胶
葡萄糖系列
优点
操作简便，进样量小，重现性 好，自动化程度高
条件温和，产品回收率近100%， 易实施循环操作，提高产品纯 度，分析速度快，精度高，分 离机理简单，操作参数少。
（二）排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝 胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的 分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型பைடு நூலகம்较
流动相
凝胶渗透色谱（GPC） 凝胶过滤色谱（GFC）
排阻色谱法
一、简 介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝
胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂
（二）分类：
缺点
质脆易碎，柱子装填不紧，柱 选择性低，料液处理量小，洗
效低。
脱后产品被稀释
三、固定相与流动相
流动相的选择
☺ 必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝 胶。
☺ 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
☺ 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 等。
固定相——凝胶：一种经过交联而具有立体网状结构的 多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
（2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质
的相对分子质量范围。
（3）溶胀率：
某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要 用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分 率称为溶胀率，即
溶胀率
（溶胀处理平衡后重量
可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用；
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长；
（3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
五、影响分离特性的因素
1、填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比 是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱， 其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长 60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多 用于快速分离。
分类：
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
（一）葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.51.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
葡聚糖凝胶的立体网状结构
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不 活泼性，故具有较高的稳定性。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 物质的分离。
（二）聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰 胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
（三）琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网 状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多 条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝 胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭 菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
（四）亲脂性凝胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合 而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子 材料的分离和分析。
干燥重量
干燥重量） 100%
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
（6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定 （中小分子）有机物的定量分析 生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）