尺寸排阻色谱法
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
体积排阻色谱
一. 分离原理尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。
排阻色谱的固定相多为凝胶。
凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。
凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。
尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。
尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。
因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。
经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。
当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：Xm ⇌ Xn组分的分配系数为：尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1二. 固定相尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。
无机凝胶：又称硬质凝胶。
是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。
有机凝胶：又称半硬质凝胶。
如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。
但在有机溶剂中有轻度膨胀。
新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。
三. 流动相尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。
(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。
尺寸排阻法
廖杰
董方霆
于力方
赵玉兰
概述
溶液中的蛋白质在受热或高浓度变性剂的存在 下, 三级结构发生改变,生物活性降低或消失,测定 变性转化点,对蛋白质去折叠的热力学研究, 找到蛋 白质的最大稳定温度,对研究蛋白质的变性与复性, 有指导意义。尺寸排阻色谱,又称凝胶过滤色谱,由 于它可以监测到由构象变化引起的蛋白质分子半径 的改变,已经成为研究蛋白质折叠的实验手段。近年 来柱填料的发展使其具有更高的分辨率、能够在更 高的温度下操作,为动态研究 变性过程中蛋白质分 子的细微变化提供了条件。
温度引起的尺寸排阻色谱 Kd值变化 荧光检测色谱峰面积的变化
• 讨论
实验中采用了两种方法对核糖核酸酶 A 的热变 性转化点进行了测定。当蛋白质受 热发生伸展去折叠时，不仅分子半径发生了 变化，而且内源性荧光也随之改变。荧光发 射光谱和荧光强度的变化反映了蛋白质分子 中色氨酸、酪氨酸残基微环境的改变，天然 状态下埋藏在分子内的疏水肽链随温度增加 逐渐暴露，采用荧光检测器可以同时监测到 这一变化过程中荧光强度的改变。
分析方法
蛋白质的构象改变热变性：称取蛋白质样品约1mg， 溶解于选定的流动相中，配制成1.0mg/mL的溶液。将蛋 白质溶液置于HP5890气相色谱柱温箱内，设定不同温度， 在每个温度下平衡20分钟后，吸取20μL注入HPLC系统。 在盐酸胍溶液中的变性：将待测蛋白质溶液在含6mol/L盐 酸胍的流动相（pH6.0）中，配制成1.0mg/mL的溶液，室 温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统（流动相中含 6mol/L 盐酸胍，pH6.0）。在尿素溶液中的变性:称取蛋 白质样品约1mg,溶解 在流动相中,配制成1.0mg/mL的溶 液。流动相中尿素浓度以0.5mol/L步进,每次平衡20分钟 后,进样10μL。
荧光检测尺寸排阻色谱fsec_概述说明以及解释
荧光检测尺寸排阻色谱fsec 概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在生物分析和医药领域中，荧光检测尺寸排阻色谱（fsec）是一种重要的分析技术。
该技术结合了荧光检测技术原理、尺寸排阻色谱原理和fsec技术，具有高灵敏度、高分辨率和广泛的应用范围等优势。
本文将对这一领域的研究进行概述，并探讨其在生物分析和医药领域中的应用、发展前景以及面临的挑战与解决方案。
1.2 文章结构本文共分为五个部分。
首先是引言部分，介绍文章的背景和目的。
其次是荧光检测尺寸排阻色谱fsec的概述部分，包括荧光检测技术原理、尺寸排阻色谱原理和fsec技术简介。
第三部分详细介绍了fsec在生物分析中的应用，包括蛋白质、DNA/RNA和细胞领域中的研究进展。
第四部分探讨了fsec在医药领域的发展前景和挑战，包括其在新药研发和药物筛选中的应用前景以及面临的挑战和解决方案。
最后，在结论部分对全文进行总结。
1.3 目的本文旨在综述荧光检测尺寸排阻色谱fsec的概念、原理、应用、发展前景和挑战，以促进该技术在生物分析和医药领域的应用和推广。
通过全面了解fsec技术，我们将能够更好地利用该技术来进行蛋白质、DNA/RNA和细胞等生物分析，并预测其在新药研发和药物筛选中的潜在作用。
最后，我们希望为fsec技术的进一步改进和应用提供思路，并寻求解决当前所面临挑战的有效途径。
2. 荧光检测尺寸排阻色谱fsec 概述：荧光检测尺寸排阻色谱（Fluorescence Size Exclusion Chromatography，简称fsec）是一种基于荧光检测技术和尺寸排阻色谱原理的分析方法。
该方法结合了荧光分析的高灵敏度和尺寸排阻色谱的高分辨率，广泛应用于生物分析领域。
2.1 荧光检测技术原理：荧光检测技术利用物质在激发后产生的特定波长的荧光信号来进行分析。
当样品中的目标物质受到激发时，会发生能级跃迁并产生荧光。
通过检测样品所发出的荧光强度和波长，可以获得有关目标物质的信息。
排阻色谱法
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
色谱分离技术原理及其的应用
色谱分离技术原理及其的应用色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。
此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。
然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。
色谱法也由此而得名。
现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。
我们仍然叫它色谱分析。
一、色谱分离基本原理：由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。
使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。
与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。
二、色谱分类方法：色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。
从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可GCLC）。
固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。
70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
色谱分析第六章凝胶色谱法
第六章空间排阻色谱法第七章第一节概述一、定义空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。
它是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂、对高分子物质有很高的分离效果，被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
空间排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质——凝胶。
二、基本原理分子筛效应：凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。
在凝胶色谱中，作为固定相的凝胶是一种不带电荷的具有三维空间网状结构的基质，每个颗粒的细微结构如同一个筛子，所有筛孔的直径是一致的。
凝胶的这种结构使得小分子可在筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，如此起到筛分大小分子的作用。
当含有大小分子的混合物样品加入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。
相对分子质量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱；相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。
样品中分子大小不同的物质如此逐渐分离。
其分离过程如下： 1、混合物上柱； 2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于凝胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4、大小分子完全分开；5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。
三、特点：1、设备简单、操作方便、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对凝胶进行再生处理，减少了工作量；3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果好，重复性高；4、洗脱条件温和，一般采用低离子强度（0.01mol/L）的洗脱剂，有些情况下甚至可以用水，所以不易使有效成分失活变性。
凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢 2、分离时必须严格控制流速 3、样品黏度不宜过高 4、存在非特异性吸附现象应用： 1、分子的组别分离、分级分离及制备； 2、测定生物大分子的相对分子质量；3、高效率样品脱盐，一次脱盐达95％以上；4、去除热源物质；5、吸水，分批法浓缩样品；6、更换样品缓冲液。
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3、无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机 械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品 需注意。
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
主主要要是用水于。有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量
分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝
凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶渗透色谱法-GPC
二、基本原理
(一) 分子筛效应
凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构 上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表 现分子筛效应。
采用水溶液或缓冲液作为流动 相
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等
多肽、蛋白质、核酸、多糖等
常用凝胶
交联聚苯乙烯凝胶
葡萄糖系列
优点
操作简便，进样量小，重现性 好，自动化程度高
条件温和，产品回收率近100%， 易实施循环操作，提高产品纯 度，分析速度快，精度高，分 离机理简单，操作参数少。
（二）排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝 胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的 分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型பைடு நூலகம்较
流动相
凝胶渗透色谱（GPC） 凝胶过滤色谱（GFC）
排阻色谱法
一、简 介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝
胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂
（二）分类：
缺点
质脆易碎，柱子装填不紧，柱 选择性低，料液处理量小，洗
效低。
脱后产品被稀释
三、固定相与流动相
流动相的选择
☺ 必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝 胶。
☺ 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
☺ 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 等。
固定相——凝胶：一种经过交联而具有立体网状结构的 多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
（2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质
的相对分子质量范围。
（3）溶胀率：
某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要 用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分 率称为溶胀率，即
溶胀率
（溶胀处理平衡后重量
可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用；
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长；
（3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
五、影响分离特性的因素
1、填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比 是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱， 其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长 60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多 用于快速分离。
分类：
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
（一）葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.51.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
葡聚糖凝胶的立体网状结构
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不 活泼性，故具有较高的稳定性。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 物质的分离。
（二）聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰 胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
（三）琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网 状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多 条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝 胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭 菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
（四）亲脂性凝胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合 而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子 材料的分离和分析。
干燥重量
干燥重量） 100%
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
（6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定 （中小分子）有机物的定量分析 生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）