尺寸排阻法
《现代仪器分析》复习题
《现代仪器分析》复习题绍兴⽂理学院《现代仪器分析》复习题⼀、填空题1、按照固定相的物态不同，可将⽓相⾊谱法分为_⽓固⾊谱_和⽓液⾊谱，前者的固定相是固体吸附剂，后者的固定相是涂在固体担体上或⽑细管壁上的液体。
2、按固定相外形，可将⽓相⾊谱法分为柱⾊谱（填充柱、空⼼柱）、平板⾊谱（薄层⾊谱和纸⾊谱)3、分离⾮极性物质，⽤⾮极性固定液，试样中各组分按沸点次序流出，沸点低，tr⼩，沸点⾼，tr⼤。
4、分离极性物质，⽤极性固定液，试样中各组分按极性次序分离，极性⼩，tr⼩；极性⼤， tr⼤。
5、最为有效地增加柱效的⽅法是减⼩填充物的粒径。
6、电⼦从基态吸收光后跃迁到激发态，称这种吸收谱线为共振线，如果跃迁到第⼀激发态，就称之为第⼀共振线7、⾊谱分离的基本理论是塔板理论、速率理论。
分别从组分在两相间的分配、组分在⾊谱柱中的运动描述了⾊谱⾏为。
8、为使组成复杂的混合物能够更好的分离，⽓相⾊谱法常常采⽤程序升温分析模式，⽽⾼效液相⾊谱法常采⽤梯度淋洗分析模式。
9、⽓相⾊谱仪中⽓化室的作⽤是保证样品迅速完全⽓化。
⽓化室温度⼀般要⽐柱温⾼30-70℃，但不能太⾼，否则会引起样品分解。
10、在⽓液⾊谱中，被分离组分分⼦与固定液分⼦的性质越相近，则它们之间的作⽤⼒越⼤，该组分在柱中停留的时间越长，流出⾊谱柱越慢。
11、按组份在固定相上的分离机理，⽓相⾊谱法可以分为吸附⾊谱、分配⾊谱、离⼦交换⾊谱以及凝胶⾊谱（尺⼨排阻⾊谱）等⼏种。
12、⽓相⾊谱⽓化室的作⽤是将液体或固体试样瞬间⽓化⽽不分解。
13、两组分保留值差别的⼤⼩，反映了⾊谱柱分离能⼒的⾼低。
14、分⼦对红外辐射产⽣吸收要满⾜的条件是(1) _分⼦的振动⽅式必须是红外或⼼活性的_，(2) _某⼀振动⽅式频率与红外线对的某⼀频率相同（即能产⽣瞬时偶极矩变化）_。
15、原⼦的吸收线具有⼀定的宽度，引起原⼦吸收线变宽的主要原因是⾃然宽度，多普勒变宽和压⼒变宽（劳伦兹变宽）。
体积排阻色谱
一. 分离原理尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。
排阻色谱的固定相多为凝胶。
凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。
凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。
尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。
尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。
因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。
经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。
当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：Xm ⇌ Xn组分的分配系数为：尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1二. 固定相尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。
无机凝胶：又称硬质凝胶。
是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。
有机凝胶：又称半硬质凝胶。
如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。
但在有机溶剂中有轻度膨胀。
新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。
三. 流动相尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。
(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。
尺寸排阻法
尺寸排阻法
尺寸排阻法是一种在机械加工中常用的方法。
它利用被加工工件的尺寸与加工工具的尺寸之间的差异来控制加工过程，从而保证工件的精度和质量。
在尺寸排阻法中，通常需要进行多次加工，每次都将工具的尺寸减小一定量。
这样，每次加工后，工件的尺寸就会逐渐接近所需的尺寸，最终实现精确加工。
尺寸排阻法的主要优点包括加工精度高、适用范围广、操作简单等。
但同时也存在一些缺点，如加工时间长、加工成本高等。
总的来说，尺寸排阻法是加工精度要求较高的工件常用的一种方法。
在实际应用中，需要根据具体情况来选择合适的加工方法。
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排阻色谱法
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
色谱分析第六章凝胶色谱法
第六章空间排阻色谱法第七章第一节概述一、定义空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。
它是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂、对高分子物质有很高的分离效果，被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
空间排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质——凝胶。
二、基本原理分子筛效应：凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。
在凝胶色谱中，作为固定相的凝胶是一种不带电荷的具有三维空间网状结构的基质，每个颗粒的细微结构如同一个筛子，所有筛孔的直径是一致的。
凝胶的这种结构使得小分子可在筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，如此起到筛分大小分子的作用。
当含有大小分子的混合物样品加入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。
相对分子质量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱；相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。
样品中分子大小不同的物质如此逐渐分离。
其分离过程如下： 1、混合物上柱； 2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于凝胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4、大小分子完全分开；5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。
三、特点：1、设备简单、操作方便、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对凝胶进行再生处理，减少了工作量；3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果好，重复性高；4、洗脱条件温和，一般采用低离子强度（0.01mol/L）的洗脱剂，有些情况下甚至可以用水，所以不易使有效成分失活变性。
凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢 2、分离时必须严格控制流速 3、样品黏度不宜过高 4、存在非特异性吸附现象应用： 1、分子的组别分离、分级分离及制备； 2、测定生物大分子的相对分子质量；3、高效率样品脱盐，一次脱盐达95％以上；4、去除热源物质；5、吸水，分批法浓缩样品；6、更换样品缓冲液。
尺寸排阻色谱法原理
尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。
在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。
定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
尺寸排阻色谱法
排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相 似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。
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溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离
效果。
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常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
观
移动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。
6.生物相容性好，有很高的活性回收率。
类型
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凝胶过滤色谱：用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。 凝胶的代表是葡萄糖系列；流动相是水
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凝胶渗透色谱法：用于分析高聚物的摩尔质量，如：聚乙 烯、聚氯乙烯等。
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常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶；流动相是有机溶剂（四 氢呋喃）
凝胶
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定义：指含有大量液体 (一般是水) 的柔软而富于弹性的物质，它是一 种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
分子排阻色潽法对所用的凝胶的基本要求：
a. 化学性质惰性，不与溶质发生任何作用，可以反复使用而不改变其 色谱性质。
b. 尽可能不带电荷以防止发生离子交换作用。
c. 颗粒大小均匀，机械强度尽可能高。
固定刚性凝胶三类。
软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微 孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水 溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高 效液相色谱中 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯 （Styragel）比软性凝胶稍耐压 ，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液 相色 谱时，流速不宜大。
刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂 又可用有 机溶剂作流动相 ，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强 小于7MPa，流速＜1cm3· s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离 。
尺寸排阻色谱法
3.亲脂性有机化合物的分离 可选用亲脂性凝胶，如黄酮、蒽醌、色素等分离可选用葡 聚糖凝胶LH-20。 在选用凝胶型号时，如果几种型号都可使用，根据具体情 况考虑： 从大分子蛋白质中除去氨基酸，各种型号葡聚糖凝胶均可使 用，但最好选用交联度大的G-25或G-50，因为这样易于装柱 且流速快，可缩短分离时间，如果想把氨基酸收集于一较小 体积内，并与大分子蛋白质完全分离，最好选用交联度小的 凝胶，如G-10、G-15，这样可以避免由于吸附作用而是氨基 酸扩散。由此可见，从大分子物质中除去小分子物质时，在 适宜的型号中选择交联度大的为好。反之，欲使小分子物质 浓缩并与大分子物质分离，则在适宜范围内选用交联度小的 型号为好。
分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自 由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙， 淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙， 才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快， 先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而 中等分子居两者之间。这种现象叫分子筛效应。 各种凝胶的空隙大小分布有一个范围。分子直径比最大空隙直 径大的这种分子就全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两 种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。直径比最小孔隙 直径的分子能进入凝胶颗粒的全部孔隙，如果这样的两种或两种 以上的分子也不能达到分离效果。
分子排阻色谱的上样量可比其他色谱形式大些，如果是组别 分离，上样量可以是柱床体积的25%~30%；如果分离K值相 近的物质，上样量为柱床体积的2%~5%。 柱床体积：每克干凝胶溶胀以后在柱中自由沉积所成床的 体积
（三）洗脱 洗脱剂的作用原则上没有其他液相色谱要求严格，因为样 品的分离并不依赖与溶剂和样品间的相互作用力。一般要求 洗脱剂与浸泡溶胀凝胶所用的溶剂相同。因为如果换溶剂， 凝胶体积会发生变化，从而影响分离效果。除非含有较强吸 附的溶质，一般洗脱剂用量也仅需一个柱体积。完全不带电 荷的物质可用纯溶剂如蒸馏水洗脱，若分离物质有带电基团， 就需要用有一定离子强度的洗脱剂如缓冲溶液等，浓度至少 0.02M。 对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液，如 水 -甲醇、水 – 乙醇等，以降低吸附，将组分洗下。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定体积分段收集，然后再 用适当的方法分析组分流出和分离情况。
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廖杰
董方霆
于力方
赵玉兰
概述
溶液中的蛋白质在受热或高浓度变性剂的存在 下, 三级结构发生改变,生物活性降低或消失,测定 变性转化点,对蛋白质去折叠的热力学研究, 找到蛋 白质的最大稳定温度,对研究蛋白质的变性与复性, 有指导意义。尺寸排阻色谱,又称凝胶过滤色谱,由 于它可以监测到由构象变化引起的蛋白质分子半径 的改变,已经成为研究蛋白质折叠的实验手段。近年 来柱填料的发展使其具有更高的分辨率、能够在更 高的温度下操作,为动态研究 变性过程中蛋白质分 子的细微变化提供了条件。
温度引起的尺寸排阻色谱 Kd值变化 荧光检测色谱峰面积的变化
• 讨论
实验中采用了两种方法对核糖核酸酶 A 的热变 性转化点进行了测定。当蛋白质受 热发生伸展去折叠时，不仅分子半径发生了 变化，而且内源性荧光也随之改变。荧光发 射光谱和荧光强度的变化反映了蛋白质分子 中色氨酸、酪氨酸残基微环境的改变，天然 状态下埋藏在分子内的疏水肽链随温度增加 逐渐暴露，采用荧光检测器可以同时监测到 这一变化过程中荧光强度的改变。
分析方法
蛋白质的构象改变热变性：称取蛋白质样品约1mg， 溶解于选定的流动相中，配制成1.0mg/mL的溶液。将蛋 白质溶液置于HP5890气相色谱柱温箱内，设定不同温度， 在每个温度下平衡20分钟后，吸取20μL注入HPLC系统。 在盐酸胍溶液中的变性：将待测蛋白质溶液在含6mol/L盐 酸胍的流动相（pH6.0）中，配制成1.0mg/mL的溶液，室 温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统（流动相中含 6mol/L 盐酸胍，pH6.0）。在尿素溶液中的变性:称取蛋 白质样品约1mg,溶解 在流动相中,配制成1.0mg/mL的溶 液。流动相中尿素浓度以0.5mol/L步进,每次平衡20分钟 后,进样10μL。
仪器和试剂
安捷伦1050系列高效液相色谱仪，包括 HP1046荧光检测器，安捷伦1100系列高效液相 色谱仪，自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵 列检测器、四元梯度泵及化学工作站。HP5890 气相色谱仪。标准蛋白质:核糖核酸酶A、溶菌 酶、碳酸脱氢酶、牛胰岛素、牛血清白蛋白、 细胞色素C 、葡聚蓝等购自Sigma公司;叠氮钠 (Fluka公司)、盐酸胍(Fluka公司进口分装)、 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素等为国产生化 纯试剂;氯化钾、乙二胺四乙酸等为国产分析 纯试剂。
• HPL处理 装置等组成。 • 盐酸胍 也可用于蛋白质变性剂。 （过量二级结构破坏） • 三羟甲基氨基甲烷 与氯化钾缓冲溶液 Tris-KCl • 分配系数越大，越难洗脱，出峰越靠后。
不同构象蛋白质的色谱分离热变与胍变蛋白质的分离 色谱柱:ZORBAX GF-250 （4.6 x 250mm）,流动 相:20mmol/LTris-KCl,0.5mmol/LKCl, 1.0mmol/L EDTA pH分别为6.8、6.0、4.0、3.2;流速为0. 5mL/min;检测; 紫外225nm,串联荧光检测器,λex =280nm, λem =320nm。 脲变蛋白质的分离:色谱柱:TSK SW 2000(7.5 x 300mm); 流动相:A：10mmol/L Tris-KCl,pH7.0； B：10mmol/L TrisKCl pH7.0,脲素8.0mol/L。 按设定比例将B与A混合洗脱,流速0.6mL/min;检测波 长280nm 。蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的洗脱分配 系数Kd 为： Kd=(Ve-V0)/(Vt-V0) Ve:蛋白质的洗脱体 积;V0:为完全排阻体积,用葡聚蓝测定;Vt:为完全渗透体 积,用叠氮钠测定。
蛋白质构象变化的色谱检测
分别在 Tris-KCl、盐酸胍、尿素等流动相条件下(25 ℃),测定标准蛋白和叠氮钠、葡聚蓝的洗脱分配系数Kd,实 验表明,叠氮钠和葡聚蓝的Kd不随流动相的变化而改变,即 色谱柱的完全渗透和完全排阻体积恒定,并与文献一致。说 明此色谱柱, 在不同溶剂条件下没有发生溶胀和收缩。实 验条件下标准蛋白的校正曲线。蛋白质发生变性时,Kd值相 应减小。
结论
实验表明,随着温度增加,蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的Kd值逐渐 发生变化, 当达到某一特定温度 时,Kd明显变小,再继续加热,则变化 不大。不同温度下的核糖核酸酶 A不仅 Kd值不同, 色谱峰荧光检测 λem320nm 的荧光强度也发生了改变,表现为色谱峰面积随温度升 高而降低。分别以温度对 Kd和λem320nm 的色谱峰面积作图,显示 Kd 和荧光强度均在接近 50℃ 时发生明显变化, 因而确定了核糖核 酸酶 A 在选定溶 剂中的热变性转化温度。 温度引发核糖核酸酶 A