尺寸排阻法

仪器和试剂
安捷伦1050系列高效液相色谱仪，包括 HP1046荧光检测器，安捷伦1100系列高效液相 色谱仪，自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵 列检测器、四元梯度泵及化学工作站。HP5890 气相色谱仪。标准蛋白质:核糖核酸酶A、溶菌 酶、碳酸脱氢酶、牛胰岛素、牛血清白蛋白、 细胞色素C 、葡聚蓝等购自Sigma公司;叠氮钠 (Fluka公司)、盐酸胍(Fluka公司进口分装)、 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素等为国产生化 纯试剂;氯化钾、乙二胺四乙酸等为国产分析 纯试剂。
用尺寸排阻色谱测定蛋白 质的构象转化点
廖杰
董方霆
于力方
赵玉兰
概述
溶液中的蛋白质在受热或高浓度变性剂的存在 下, 三级结构发生改变,生物活性降低或消失,测定 变性转化点,对蛋白质去折叠的热力学研究, 找到蛋 白质的最大稳定温度,对研究蛋白质的变性与复性, 有指导意义。尺寸排阻色谱,又称凝胶过滤色谱,由 于它可以监测到由构象变化引起的蛋白质分子半径 的改变,已经成为研究蛋白质折叠的实验手段。近年 来柱填料的发展使其具有更高的分辨率、能够在更 高的温度下操作,为动态研究 变性过程中蛋白质分 子的细微变化提供了条件。
ຫໍສະໝຸດ Baidu 分析方法
蛋白质的构象改变热变性：称取蛋白质样品约1mg， 溶解于选定的流动相中，配制成1.0mg/mL的溶液。将蛋 白质溶液置于HP5890气相色谱柱温箱内，设定不同温度， 在每个温度下平衡20分钟后，吸取20μL注入HPLC系统。 在盐酸胍溶液中的变性：将待测蛋白质溶液在含6mol/L盐 酸胍的流动相（pH6.0）中，配制成1.0mg/mL的溶液，室 温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统（流动相中含 6mol/L 盐酸胍，pH6.0）。在尿素溶液中的变性:称取蛋 白质样品约1mg,溶解 在流动相中,配制成1.0mg/mL的溶 液。流动相中尿素浓度以0.5mol/L步进,每次平衡20分钟 后,进样10μL。
结论
实验表明,随着温度增加,蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的Kd值逐渐 发生变化, 当达到某一特定温度 时,Kd明显变小,再继续加热,则变化 不大。不同温度下的核糖核酸酶 A不仅 Kd值不同, 色谱峰荧光检测 λem320nm 的荧光强度也发生了改变,表现为色谱峰面积随温度升 高而降低。分别以温度对 Kd和λem320nm 的色谱峰面积作图,显示 Kd 和荧光强度均在接近 50℃ 时发生明显变化, 因而确定了核糖核 酸酶 A 在选定溶 剂中的热变性转化温度。 温度引发核糖核酸酶 A
• HPLC系统 基本配置由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理 装置等组成。 • 盐酸胍 也可用于蛋白质变性剂。 （过量二级结构破坏） • 三羟甲基氨基甲烷 与氯化钾缓冲溶液 Tris-KCl • 分配系数越大，越难洗脱，出峰越靠后。
温度引起的尺寸排阻色谱 Kd值变化 荧光检测色谱峰面积的变化
• 讨论
实验中采用了两种方法对核糖核酸酶 A 的热变 性转化点进行了测定。当蛋白质受 热发生伸展去折叠时，不仅分子半径发生了 变化，而且内源性荧光也随之改变。荧光发 射光谱和荧光强度的变化反映了蛋白质分子 中色氨酸、酪氨酸残基微环境的改变，天然 状态下埋藏在分子内的疏水肽链随温度增加 逐渐暴露，采用荧光检测器可以同时监测到 这一变化过程中荧光强度的改变。
不同构象蛋白质的色谱分离热变与胍变蛋白质的分离 色谱柱:ZORBAX GF-250 （4.6 x 250mm）,流动 相:20mmol/LTris-KCl,0.5mmol/LKCl, 1.0mmol/L EDTA pH分别为6.8、6.0、4.0、3.2;流速为0. 5mL/min;检测; 紫外225nm,串联荧光检测器,λex =280nm, λem =320nm。 脲变蛋白质的分离:色谱柱:TSK SW 2000(7.5 x 300mm); 流动相:A：10mmol/L Tris-KCl,pH7.0； B：10mmol/L TrisKCl pH7.0,脲素8.0mol/L。 按设定比例将B与A混合洗脱,流速0.6mL/min;检测波 长280nm 。蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的洗脱分配 系数Kd 为： Kd=(Ve-V0)/(Vt-V0) Ve:蛋白质的洗脱体 积;V0:为完全排阻体积,用葡聚蓝测定;Vt:为完全渗透体 积,用叠氮钠测定。
蛋白质构象变化的色谱检测
分别在 Tris-KCl、盐酸胍、尿素等流动相条件下(25 ℃),测定标准蛋白和叠氮钠、葡聚蓝的洗脱分配系数Kd,实 验表明,叠氮钠和葡聚蓝的Kd不随流动相的变化而改变,即 色谱柱的完全渗透和完全排阻体积恒定,并与文献一致。说 明此色谱柱, 在不同溶剂条件下没有发生溶胀和收缩。实 验条件下标准蛋白的校正曲线。蛋白质发生变性时,Kd值相 应减小。