第七章 生物大分子的色谱分离和纯化
第七章 色谱分离技术
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
第七章 生物大分子的色谱分离和纯化120328
分离度
第二节 装置和操作技术
装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和 检测器4大部分。
1.柱色谱系统的组成
色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相 似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及 部分收集器等几个部分构成。
柱层析系统的组成
• 柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：
疏水作用色层分离法
吸附层析法
金属螯合色层分离法
分配层析法
共价作用色层分离法
凝胶过滤法
⑵ 根据实验技术的分类
低压层析技术
——操作压力小于0.5MPa
中压层析技术
——操作压力在0.5MPa-5MPa之间
高压层析技术 电泳法
——操作压力在5Mpa-40MPa之间 ——靠溶质分子在电场中的移动速度
不同而分离
二﹑有效柱长和最短柱长
不同溶质在其迁移速度大于零，但小于 流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的 迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经 历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶 质在其迁移速度等于流动相的线速度时， 溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。
二﹑有效柱长和最短柱长 有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其 迁移速度等于流动相速度时，溶质在色 谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。 最短柱长(Lmin)：混合溶质中使一对最 难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时 所需的最短距离。
(1)吸附色谱、 (2)分配色谱、 (3)离子交换色谱、 (4) 凝胶色谱
6.色谱法的特点
(1)高选择性
(2)高效能 (3)高灵敏度可以分析质量分数为10-6 ～10-9 数量级、 检出限量低至10-1l g的物质，适于微量和痕量分析。
7.色谱法的应用 (1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分 析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、 贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子的纯化和结构分析
生物大分子的纯化和结构分析在生物学研究中，大分子是一个非常重要的研究对象。
它们是生物体内一些重要的分子，如蛋白质、核酸、糖类等。
这些大分子的复杂性和多样性使得它们的纯化和结构分析非常具有挑战性。
本文将探讨生物大分子的纯化和结构分析的基本原理和方法。
一、生物大分子的纯化生物大分子的纯化是生物学研究中的一个基础性实验步骤，也是研究生物大分子结构和功能的前提。
生物大分子的纯化就是把它们从其他生物体内分子中分离出来，使其达到一定的纯度，以满足后续的结构和功能研究需要。
其中，蛋白质纯化是生物学研究中的一个重要问题之一，因为蛋白质是生物体内最为重要的大分子之一。
1.1 分离方法生物大分子的纯化需要一系列的实验分离步骤。
根据大分子的化学性质和生物来源不同，分离方法也有所不同。
主要的方法包括：（1）分子排斥色谱（size exclusion chromatography）：根据分子的大小分离。
（2）离子交换色谱（ion exchange chromatography）：根据分子的电荷差异分离。
（3）亲和色谱（affinity chromatography）：根据分子的特异配体分离。
（4）逆向相色谱（reverse-phase chromatography）：根据分子的疏水性分离。
1.2 纯度检测生物大分子的纯度检测是生物学研究中的一个关键环节。
生物大分子的结构和功能的研究都需要高纯度的样品。
目前常用的纯度检测方法有：（1）SDS-PAGE：钠二十硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（2）Western blotting：蛋白质的免疫印迹。
（3）UV吸收光谱：在280纳米处进行吸光度检测。
二、生物大分子的结构分析生物大分子的结构分析是生物学研究中一个非常重要的研究领域，因为分子的结构直接关系到其功能。
目前，生物大分子的结构分析主要有两种方法：晶体学和核磁共振。
2.1 晶体学晶体学是生物大分子结构分析的传统方法。
该方法要求分子能够形成晶体，然后通过X射线衍射得到分子的三维结构。
生物工程下游技术第七章_生物大分子的色谱分离和纯化
有关，塔板数越多，柱效能越高。
色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效
塔板数来表示。
1．理论塔板数n：
tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Y
2
tR
式中：tR为某组分的保留时间；
Y1/2为某组分色谱峰的半宽度； Y为色谱峰的峰底宽度。
由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间
有关。保留时间越长，峰越窄，理论塔板数就越
描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评 价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论 。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许
多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描
述组分在柱中的分配行为。该 理论成功
地解释了色谱流出曲线呈正态分布。
（一）塔板理论假定：
1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔 板体积加入。
在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！
h. 色谱峰的高度、宽度及面积：
标准偏差：峰高0.607 倍处峰宽度的一半。
半峰宽Y1/2：峰高一半处的峰宽。Y1/2=2.355
峰底宽Y：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间
的距离。Y= 4
峰面积A：色谱定量的依据。A=1.065hY1/2
,[A=1.065h(Y0.15+Y0.85)/2]。
Vr' ：某组份的保留体积扣 f. 调整保留体积 除死体积后的体积。
V Vr V0 t Fco
' r ' r
g. 相对保留值2,1或i,s ：组份2的调整保留值 与组份1的调整保留值之比。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。
此外，功能地也可以应用于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。
对于蛋白质，离心分离是一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。
因为蛋白质它们有不同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。
这个过程使用一种特定的介质，该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。
这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。
这两种技术的精确度取决于集成柱的大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。
有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。
选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物大分子分离纯化技术之层析(色谱)技术(56页)
生物大分子分离纯化技术
当流动相中所含的混合物经过固定相就会与固定 相发生作用。由于混合物中各组分在结构和性质上存 在差异，它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差 异。因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留 时间不同，从而按先后不同次序从固定相中流出。这 种借在两相间分配的原理而使混合物中各组分离的技 术，称为色谱分离技术或色谱法，又称色层法、层析 法。
生物大分子分离纯化技术
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实 的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也 不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论 认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建 立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有 径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的， 因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、 峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地 解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰 型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温及 常压下进行起来，又补充了气相色谱法的内 容。根据液相色谱的特点，可称做高效、高压、高速和现 代液相色谱法。液相色谱法不论在仪器还是柱填料方面均 发展很快。
生物大分子分离纯化技术
层析（色谱）法分类
样品中的离子与离子交换树脂上的离子的交换反应过程可用下式表示：
阳离子交换
树脂-SO3-H++M+ 阴离子交换
树脂-SO3-M++H+
树脂-NR3+Cl-+X- 树脂-NR3+X-+C1-
生物大分子分离纯化技术
(四)空间排阻色谱法 (五)亲和色谱法
生物大分子分离纯化技术
塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论， 塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待 分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每 一个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动，组 分分子不断从一个塔板移动到下一个塔 板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱 的塔板数越多，则其分离效果就越好。
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吸附色谱分离
是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 有氧化铝 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 新的吸附色谱技术有： 新的吸附色谱技术有：
色谱分离的分类
1. 按分离机理不同分类
吸附色谱分离（ Chromatography，AC） 吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC） 分配色谱（ Chromatography，DC） 分配色谱（Distribution Chromatography，DC） 离子交换色谱（ Chromatography，IEC） 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC） 凝胶色谱（ Chromatography，GC） 凝胶色谱（Gel Chromatography，GC） 亲合色谱（ Chromatography，AFC） 亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）
纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在 基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和 纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统 的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、 DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化 产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体 等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。
凝胶色谱
以凝胶为固定相， 以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术， 大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子 筛色谱（ Chromatography， 筛色谱（Molecular Sieve Chromatography， MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（ ）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 Chromatography，SEC）
第三节 色谱条件及色谱纯化工艺的最优化
这是一项涉及学科面广，与色谱和现代分离科学乃至基 础理论密切相关的一门复杂的学问。 单纯从每一步和色谱分离最优化条件来讲，它涉及固定 相（包括种类、颗粒和孔径大小）、流动相、柱尺寸、流 速、洗脱方式、质量回收率和活性回收率等每一种参数的 最优化选择 接着便是将这些参数综合在一起的色谱条件最优化研究。 最后，便是将各步分离纯化串在一起组成一个完整的蛋 白纯化工艺。有时甚至连同发酵工艺一起来进行生产工艺 的优化选择。
色谱分类(按照进样量) 色谱分类(按照进样量)
1、分析色谱（10mg） 分析色谱（10mg） 中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 2、中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 制备色谱（0.1-1g） 3、制备色谱（0.1-1g） 工业生产规模色谱（大于20g/d 20g/d） 4、工业生产规模色谱（大于20g/d）
该法的复性机理为：
在变性蛋白进入柱顶端时，因有高浓度变性 剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水和半径，不能进入柱的空隙， 蛋白质在SEC柱上不保留。当受到复性的缓冲溶 液洗脱时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质浓度 降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高 能状态，这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳 定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从而使变 性蛋白质开始复性。
定义溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速 定义溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速 度时， 度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称之为有效迁移 距离，也称为有效柱长 有效柱长。 距离，也称为有效柱长。
其它色谱条件相同的条件下，有效迁移距离L 其它色谱条件相同的条件下，有效迁移距离Leff 是 随溶质的不同而变化的，对同一种溶质而言， 值 随溶质的不同而变化的，对同一种溶质而言，k1’值 愈小，其对应的L 就愈小， 愈小，其对应的Leff就愈小，洗脱所需时间也就愈 反之，洗脱所需时间就愈长。 短，反之，洗脱所需时间就愈长。 为使溶质迁移速度U 时的瞬时容量因子值） （k1’为使溶质迁移速度Ux=0时的瞬时容量因子值） 为使溶质迁移速度 =0时的瞬时容量因子值 最短柱长的定义为混合溶质中， 最短柱长的定义为混合溶质中，使一对最难分离 的定义为混合溶质中 的溶质的分离度R =1时所需的最短柱长 时所需的最短柱长。 的溶质的分离度RS=1时所需的最短柱长。
第七章 生物大分子的色谱分离 和纯化
分离方法
从现在分离科学理论计算得出，色谱和电泳是 目前所知最好的两种分离方法，其理论塔板数可 达百万数量级。 但是，因受各种因素的限制，电泳目前尚不能 用于生产规模的生物大分子的分离纯化，这就是 人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、 核酸和多糖等，以下简称蛋白）的研究重点放在 色谱上的原因。
在色谱单元纯化条件的最优化中，首先 首先 解决的问题是要对所用色谱柱的种类进行选 解决的问题 择，这取决于试样和目标产物的性质。一般 来说，期望目标产品尽可能多的保留，而杂 蛋白不保留，因此需选择目标产品与固定相 作用力强、廉价的色谱柱。
1、选择填料 2、填料颗粒、孔径及柱尺寸的大小。 3、流动相 4、流动相组成、流速和梯度洗脱方式 5、选定几种不同色谱的最优化条件，将这 些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺。
凝胶
是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结 构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。 构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。 当混合物随流动相流经凝胶柱时， 当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进 入所有的凝胶网孔而受到排阻， 入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起 首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔， 首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的 速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔， 速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后 从凝胶柱中流出。 从凝胶柱中流出。 凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。 凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。
二、有效柱长和最短柱长
液相色谱（LC）分离小分子溶质时， 液相色谱（LC）分离小分子溶质时，从理论上 讲，色谱柱愈长，分离效果愈好，但因其长度受 色谱柱愈长，分离效果愈好， 到色谱仪提供的压力的限制， 到色谱仪提供的压力的限制，色谱柱不可能无限 度长。在实际应用中， 度长。在实际应用中，一般认为色谱柱的长径比 10，是色谱柱较为合适的几何比例。 为10，是色谱柱较为合适的几何比例。 生物大分子而言，它的保留主要是流动相中， 生物大分子而言，它的保留主要是流动相中， 置换剂的浓度决定的， 置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离 几乎没有影响， 几乎没有影响，有时甚至会出现短柱比长柱分离 效果还好的情况。 效果还好的情况。
第一节 基本理论
一、计量置换保留理论
(1)溶质计量置换吸附理论。
它的核心是，当一个溶质被吸附剂吸附时， 在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一 定数目的溶剂分子。
（2）计量置换保留理论
计量置换保留理论
Lgk’ =lgI-Zlg[D]-------------简化数学表达式 Lgk =lgI-Zlg[D]-------简化数学表达式 （基于在色谱体系中溶质、流动相和固定 基于在色谱体系中溶质、 相分子间的相互作用） 相分子间的相互作用）
色谱分离的基本原理
在色谱操作中， 在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操 作称为展开（Development）， 作称为展开（Development）， 洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱（Eluate）， 洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱（Eluate）， 而展开后各组分的分布情况称为色谱 （Chromatography）。 Chromatography）。
色谱分离（Chromatographic Resolution，CR） 色谱分离（ Resolution，CR）
利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸 利用多组分混合物中各组分物理化学性质（ 附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、 附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分 配系数等）的差别， 配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定 相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时， 相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由 于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动， 于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动， 使之分离。 使之分离。
不同溶质在其迁移速度大于零， 不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的 线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献， 线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献， 此时溶质迁移所经历的柱长对分离有贡献。 此时溶质迁移所经历的柱长对分离有贡献。
而当其迁移速度等于流动相速度时（ 而当其迁移速度等于流动相速度时（即固定相不 吸附溶质或溶质完全从固定相洗脱时） 吸附溶质或溶质完全从固定相洗脱时），溶质迁移 所经历的柱长对分离无贡献。 所经历的柱长对分离无贡献。
1、进样后可很快除去变性剂 2、色谱对于蛋白质分子的吸附，提高了复性的质量 色谱对于蛋白质分子的吸附， 和回收率 3、复性同时达到纯化目的 4、便于回收变性剂，以降低废水处理成本 便于回收变性剂，
SEC-----空间排阻色谱或尺寸排 1 、 SEC--- 空间排阻色谱或尺寸排 阻 色 谱 （ Size Exclusion Chromatography） Chromatography）
优点
①分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数； 分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数； ②应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、 应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、 小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质， 小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及 热稳定到热不稳定的化合物， 热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样 品的分离，是其他方法无法代替的； 品的分离，是其他方法无法代替的； ③选择性强； 选择性强； 高灵敏度的在线检测， ④高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器 进行连续的在线检测； 进行连续的在线检测； 快速分离； ⑤快速分离； 过程自动化操作。 ⑥过程自动化操作。