乳鼠心肌细胞分离步骤
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
大(小)鼠心肌细胞的急性分离
大（小）鼠心肌细胞的急性分离准备工作:1 器械：恒温水浴锅（泵）Langendorff装置氧气手术器械平皿烧杯50ml注射器玻璃离心管吸管冰袋步骤: 1用去离子水清洗器械和Langendorff装置、打开恒温水浴、提前拿出-20℃的KB液放到水浴中使之融化。
2 配置无钙液：50ml的10X台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖，用NaOH调节PH至7.35～7.45。
将无钙液通氧5min。
3 配置有钙液：200ml无钙液+0.4ml 0.9MCaCl2。
4 配酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中。
5 将70ml有钙液从Langendorff装置下端注入弯管中，注意千万不要有气泡，然后将氧气针头插入Langendorff管中，打开氧气。
6 取心脏，修理主动脉边缘至平整，助手将Langendorff装置打开，速度不能太快，1滴1滴即可。
7 用平镊和弯镊夹住主动脉，迅速挂在Langendorff装置上，用线系紧，注意：针管不能深也不能浅，心脏挂上后能横过来就可以，系线时不要系到组织。
8 打开装置阀门，让液体以固定的流速流入心脏，注意装置上方要保持有液体，否则大量气泡进入会导致分离失败。
9 有钙液泵完时，加入无钙液至心脏停跳，此时加入酶。
10 用烧杯接下45ml左右的液体弃掉，此时开始计时，其余液体循环利用，消化开始。
11 消化的过程是快—慢—快，当流下的液体变得粘稠，心脏松软粉嫩时即可，大约30min。
12 将通过氧的KB液装入准备好的离心管中，剪下左心室组织，剪碎，吹打，将细胞吹下后弃去组织。
剩下的细胞悬液放到4℃冰箱中，静置1—2小时待用。
实验所需药物及液体的配置：1 台式母液(10x、g/500ml)NaCl：39.74 KCl：2.01 HEPES：11.915 MgCl2.6H2O：1.0165 2 KB营养液（—20℃保存、g/500ml）用KOH调节PH7.35-7.45GLutamic acid：5.15 T ourine：0.9375 KCl：1.1185 HEPES：1.1915 MgCl2.6H2O：0.05075 EGTA：0.095 Glucose：0.991KH2PO4：0.683CaCl2母液：0.9mol/L或1.8mol/L4无钙液：50ml台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖5有钙液：200ml无钙液+0.4ml的0.9mol/L CaCl2母液或0.2ml的1.8mol/L CaCl2母液6酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中7F-127：2mg+1ml有钙液（4℃保存）8Flou-3：一管新的+50ulDMSO(-20℃保存)9染色液：894μl有钙液+100μl F-127+6μl Flou-310KCl：0.09g溶于1mlddH2O中（这样保证浴槽中的浓度为30mmol/L）11BSA：40mg溶于1mlddH2O中（用来保护心肌细胞）。
乳鼠心肌细胞分离及培养程序
下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。
实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。
所有器械使用前均应消毒灭菌。
为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。
所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。
本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。
组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。
2）准备胰酶液。
用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。
胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。
取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。
4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。
20只幼鼠大约需要5分钟时间。
用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。
5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。
用乙醇擦洗其胸部及腹部。
把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。
24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。
此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。
可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。
6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。
每次解剖约需1分钟。
7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。
乳鼠心肌细胞的分离和培养
2.方法
2.3 于剩余沉淀中加入混合消化液5ml(0.06%胰酶+0.1%II型 胶原酶)，置37℃水浴消化8-10分钟，其间震荡2-3次，然后静置。 上述消化处理的同时，往一只50ml的一次性无菌离心管中加入 20ml预冷的含10%血清的DMEM/F12培养液，并放置冰台上。 消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，第 一次消化结束；随后用上述方法反复消化7-8次至组织块基本消化 完毕。
2.方法
2.5 一般不用加BrdU，如果培养时间长（发现成纤维细胞也极少）， 可以培养前3d加入0.1mmol/L BrdU抑制成纤维细胞生长。加了 BrdU，心肌细胞搏动的时间会更长。 2.6 接种后24h，用温的培养基或者平衡盐溶液轻轻冲洗培养的心 肌细胞一次，以去除未贴壁的细胞（部分细胞会在24h之后贴，结果 很多细胞重叠生长），再更换培养液即可。可以按照实验在48或 72h后施加处理因素。
4、讨论
乳鼠心肌细胞的分离和培养
整理：杜子欧
1.材料
1.1 动物 出生后1-4天乳鼠（15）只
1.2 试剂 1：1混合的DMEM/F12培养液：10%新生胎牛血清（FCS）、
100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素。（L-谷氨酰胺） 消化液：0.06%胰酶、0.1%胶原酶，用pH7.2-7.8的D-
已消毒的铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、玻璃培养皿（共两 套，一套用于解剖，一套用于剪碎心脏组织）、75cm2培养瓶、50ml 离心管、离心机、磁力搅拌器和搅拌棒、200目尼龙网、微量移液枪、 37度恒温水浴锅、5%CO2恒温培育箱、倒置相差显微镜、净化工作台。
2.方法
2.1 颈脱位处死乳鼠，消毒取样：放入装有75%酒精的烧杯6s即 可。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直 剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿 胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要 左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部 直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hanks溶液中。 注：速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。
方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。
结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。
结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。
【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。
体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。
本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。
本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。
1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。
二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。
小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
乳鼠心肌细胞培养详细步骤
乳鼠心肌细胞培养物品准备眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管试液配制（1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。
（2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。
（3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。
将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。
操作步骤（1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上;（2）应用75%酒精常规消毒;（3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中;（4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中;（5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中;（6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。
（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床 100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。
（8）重复 5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。
用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。
（9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。
（10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。
（11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。
（12）用培养基B重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于六孔板中，放入细胞培养箱培养。
乳鼠心肌细胞分离
Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol作成者：富海英 趙卉日 期：2006/08/11法消毒器具：镊子 大和小 各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中放入搅拌棒的50cc 的烧杯一个次日开始培养的话，提前：17～21時）１）Hanks medium 15ml 加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate（其中2枚在取心脏时备用）Hanks medium 是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可２）从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算）铺上草纸、准备酒精消毒液和尸体袋取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离，心脏将突出体外）用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中然后拿到无菌操作台（cleanbench ）里面行进一步操作３）将P10 dish 中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdish に移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。
４）将Trypsin/EDTA 放入50cc 三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml 。
4℃ 过夜。
Trypsin 不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。
Trypsin 不要加热，以免影响效果。
4℃过夜，静置即可。
12-16h后：早上9点开始）试剂：D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子）Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2）最终浓度0.5~1.0mg/mlBSA (Sigma)最终浓度5mg/ml0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温）５）配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml６）在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml，37℃恒温槽5min７）弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤）（弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。
乳鼠心脏取材方法
乳⿏⼼脏取材⽅法1、乳⿏⼼肌细胞⽐成年⼼肌细胞容易培养，⽽且对缺⾎缺氧的耐受性好2、抓住⼩⿏后颈肩胛⾻处，使胸腔向前3、⽤⽆名指和⼩指固定⼩⿏后肢。
4、将⼩⿏放⼊75%酒精中消毒。
下⾯放⼀个纱布，吸取掉落酒精5、从⼩⿏左肋缘锁⾻中线处⼊剪⼑，剪⾄锁⾻中线，注意剪⼑上翘，如果⼼脏未暴露，可以⾃剪线的中点剪向胸⾻。
6、剪取⼼尖部⼼肌，放在DMEM中7、⽤⼩镊⼦轻轻挤压⼼尖部，注意不要⽤⼒过度，避免镊⼦碰撞。
8、换液，清洗⼆次9、在培养⽫中将组织剪碎。
10、将⼼脏剪成1mm3⼤⼩的碎⽚，再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中，加配好的胰酶和胶原酶，37℃消化5 min⾄8分钟，⾃然沉淀，弃上清，再加⼊胰酶和胶原酶，重复操作，吸取上清，反复操作6⾄8次，⼆次完成时加⼊⾎清，终⽌胰酶对细胞的损害11、操作完成后⽤滤器除去其中的纤维和胶原等12、离⼼换液，除去胶原酶，（胶原酶是外来物质，对细胞有损伤）将培养瓶放在37°C孵箱中1~2个⼩时，使成纤维细胞贴壁，⽽⼼肌细胞贴壁多需要6~8⼩时，分离作⽤13、原理：⼼肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去⼼肌细胞中混杂的成纤维细胞和内⽪细胞就是利⽤成纤维细胞和内⽪细胞贴壁快⽽⼼肌细胞贴壁慢的原理进⾏换⽫法来纯化⼼肌细胞的。
换⽫后最好48⼩时内对你所培养的⼼肌细胞不进⾏任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。
如果还是不能够贴壁的话，你可以考虑⼀下⽤塑料瓶，或者对培养⽤的玻璃瓶进⾏如下处理：在培养前进⾏⿏尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋⽩包被，在这⽅⾯有许多⽂献报道的，你只需要注意看都会有解决办法的。
14、吸取培养液中的⼼肌细胞，将成纤维细胞保存待⽤，⼼肌细胞中加⼊5—溴尿嘧啶（终⽌RNA的合成），终⽌其中的成纤维细胞的分裂，并做计数。
15、将⼼肌细胞培养⼗⼆⼩时，⼀定不要动，放在孵箱的最⾥⾯16、将⼼肌细胞冻存、传代。
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
新生大鼠原代心肌细胞分离
新生大鼠原代心肌细胞分离实验用材料a) Fibronectin: Sigma; Catalog # 2891492b) Phosphate-Buffered Saline (PBS) Ca/Mg free: HyClone; Catalog #c). Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, D-Hanks’),d) Trypsin: Gibco; Catalog # 27250-018（28mg）e) Collagenase Type I I: Gibco; Catalog # 17101-015（20mg）f) DMEM: Hyclone; Catalog # SH30022.08g) Fetal Bovine Serum (FBS): Gibco; Catalog # 16000-044原代新生乳鼠心肌细胞分离一、FN包被Cardio Plate（时间：约3小时）1．使用PBS缓冲液将1mg/ml的FN储存液按1：100的比例稀释成1ug/ml工作液2．在E-Plate Cardio 96每孔加入20—30 µl 配制好的1ug/ml的FN工作液。
3．将包被好的E-Plate Cardio 96 置于细胞培养箱内约3h左右。
二、原代大鼠心肌细胞分离（时间：约3小时）1. 获取大鼠心室组织(使用出生24h内的SD大鼠)。
1) 用70%的酒精消毒乳鼠。
2)无菌的解剖板上，左手用镊子固定乳鼠，右手持眼科剪，在无菌条件下迅速剪开胸骨剑突下稍左侧的皮肤。
换眼科剪，在胸骨剑突下稍左侧打开胸腔，左手轻轻用力，心脏跃出，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中，在预冷的DMEM 中漂洗3次，去除血液。
3) 将漂洗后的心尖组织在预冷的DMEM去除心房和血管等组织。
4) 在5ml玻璃瓶中加入2ml预冷的HBSS，将心尖转移到HBSS中，用眼科剪剪成约1mm3的小块。
乳鼠心肌细胞培养
大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。
按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。
2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。
3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。
最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。
８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。
心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。
（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。
决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。
２）尽量减少非心肌细胞的存在。
分离小鼠心肌细胞protocol
分离小鼠心肌细胞Protocol实验动物：小鼠, 体重20~30g1急性分离心肌细胞A 实验准备：1）无钙台氏液：配500mL无钙台氏液(50mL台氏母液+450mL去离子水+1g 葡萄糖), 用NAOH 调PH，一般在7.35~7.4之间即可，注：充氧后调PH值，否则充氧后PH下调。
调PH值前严格校正PH计，小鼠心肌细胞对PH值特别敏感。
表1：台式母液配方mM MW g/L g/500ml (10x)NaCl 126 58.44 7.363 36.82KCl 5.4 74.55 0.403 2.02Hepes 10 238.3 2.383 11.92MgCl2.6H2O 1.0 203.3 0.203 1.02NaH2PO4.2H20 0.33 156.01 0.052 0.2574CaCl2 1.8 147.03Glucose 10 198.2注：CaCl2, Glucose配制时后加，（浓度0.9M CaCl2母液 6.616g(有水)或者4.995g(无水)+50ml去离子水），0.2ml CaCl2母液/100ml无钙台氏液2）称取5mg胶原酶Ⅱ+8mg白蛋白3）配有钙液200ml：即200ml无钙液+0.4ml CaCl2 (0.9M)。
注：小鼠心肌细胞对钙浓度特别敏感，我们为了缩短心脏复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙离子浓度降到正常的浓度的1/44) 准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直镊子两把，止血钳两把，弯镊子两把，纱布一块，注射器60mL一个，10mL一个；手术线一团(小鼠主动脉比较细，手术线比大鼠的要细)；表面皿三个，小烧杯50mL 三个，量筒50mL两个，500mL 一个；大烧杯500mL一个250mL一个；滤纸若干！滴管4个, 7号注射针头一个（尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系线）。
5）KB 液配方mM MW g/LGlutamic acid70 147.13 10.3(谷氨酸)15 125.14 1.875Taurine(牛黄酸)KCl 30 74.55 2.237Hepes 10 238.3 2.383MgCl2.6H2O 0.5 203.3 0.1015Glucuse 10 198.2 1.982EGTA 0.5 380.4 0.19KH2PO410 136.09 1.36注：5M KOH 调PH 值（7.3-7.4），5M KOH 配制：28g KOH 溶于100ML去离子水，KB 液保存在-20℃冰箱中保存。
(完整word版)乳鼠心肌细胞分离步骤
一、细胞室灭菌1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射20-30min。
2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线.培养细胞和培养用液不可照射紫外。
）3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20—30min.4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min,吹走O3。
5.(注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒.）二、胶原酶1的配置分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：(以下过程均在超净台内操作）1.称取10mg胶原酶于小烧杯中.2.加入12ml PBS溶液。
3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液,呈淡土黄色.三、取材并分离心肌细胞1.用止血钳取5—6个平皿,分别加入适量PBS溶液。
2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内.先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右,取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min。
4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔,右手拿一直的小剪刀,在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6.待8只乳鼠心脏全部取定后,换手套，喷酒精。
7.左手拿镊子，右手拿剪刀,在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍"形,在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室,取出余血。
9.继续冲洗2-3遍，10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入2ml PBS溶液。
11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片.12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
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一、细胞室灭菌
1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置
于超净台内，紫外照射20-30min。
2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。
培养细胞和培养用液不可照射
紫外。
）
3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。
4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。
5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。
）
二、胶原酶1的配置
分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）
1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。
2.加入12ml PBS溶液。
3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉
素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。
三、取材并分离心肌细胞
1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。
2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超
净台内。
先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.
4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠
左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。
7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，
在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取
出余血。
9.继续冲洗2-3遍，
10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净
处），加入2ml PBS溶液。
11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。
12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
13.取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。
14.在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。
15.从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C
热水），37°C消化5min。
16.取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血
清和BRDU的DMEM的玻璃离心管中，此时加入到离心管中的上清中的胶
原酶被稀释而减弱消化反应。
17.在剩下的细胞碎片中再加入2ml胶原酶溶液，重复消化2次，每次消化
结束后，均需将上清吸到上述离心管中。
18.第4次消化改为37°C消化7min，将上清转移到离心管中反复重复消化
（共4次37°C，7min）至不能消化为止。
19.取含细胞消化液的玻璃离心管，用枪吹打混匀，使酶与DMEM充分混匀，
并进一步分离组织块。
20.配平后，从超净台中取出，1000转离心5min。
21.离心结束后，取出离心管，拿回超净台内。
22.取滴管1支，火焰灼烧整个滴管，置于滴管架上放凉备用。
23.用滴管吸掉离心管中上清培养液以除去胶原酶，若吸不干净，管底允许
留少许培养液。
24.用枪加4ml新鲜的含血清和BRDU的DMEM于离心管中。
25.取一只新的滴管，灼烧冷却后，吹打离心管中细胞，至细胞均匀悬浮。
为控制吹打后量，吹打次数可固定，如100下。
吹打时，滴管头部置于
溶液底部，防治吹打出气泡。
26.将200目筛网置于灭过菌的烧杯上，用滴管吸取细胞悬液，加到筛网上
过滤，以除去未消化的组织块，只让单个细胞过滤到烧杯中。
此时，得到的细胞即为分离好的乳鼠原代心肌细胞及成纤维细胞。
四、分离的心肌细胞的培养
1.将烧杯中的细胞溶液吸到培养瓶中/6孔板/96孔板中，做好标记。
2.若用培养瓶培养，则先将瓶塞拧松半圈，置于孵箱中静置1-2h。
3.因为成纤维细胞先贴壁，1-2h后，取出孵箱中的培养瓶于超净台中，竖起培
养瓶，用滴管吸取细胞溶液于细口瓶。
4.吹打均匀后，用细胞计数板计数。
5.计数技术后，向6孔板中种细胞。
用枪从细口瓶中吸取细胞溶液，加入到6
孔板中，摇匀后，补充新鲜的含血清和BRDU的DMEM至2ml左右，标记后置孵箱中培养。
注：四1、2步骤后可显微镜观察培养瓶中的细胞。
五、清理实验用品和台面，并用酒精棉球擦洗超净台台面。
备注：接种细胞密度依实验目的而定
一般而言，进行细胞实验时，应结扎5×105密度/孔
提取蛋白实验时，应接种5×106密度/孔。