心肌细胞分离方法
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
成年大鼠心肌细胞分离方法.
成年大鼠心肌细胞分离方法【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。
方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。
光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。
结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。
结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。
【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedurecryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult ratventricular cardiomyocytes can be isolated well with the above methods.【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。
乳鼠心肌细胞分离步骤
一、细胞室灭菌1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射20-30min。
2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。
培养细胞和培养用液不可照射紫外。
）3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。
4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。
5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。
）二、胶原酶1的配置分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。
2.加入12ml PBS溶液。
3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。
三、取材并分离心肌细胞1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。
2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内。
先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。
7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取出余血。
9.继续冲洗2-3遍，10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入2ml PBS溶液。
11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。
12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心血管疾病和心脏发育机制的重要模型。
在进行心肌细胞的分离鉴定和培养之前，我们需要准备以下实验材料和试剂：酶消化液、细胞培养基、大鼠心脏。
我们需要将大鼠处死，并将心脏取出。
取出的心脏需要立即放入含有乙醇消毒的PBS缓冲液中，以去除血液和外部污染物。
然后，将心脏移入无菌培养皿中，用PBS缓冲液冲洗数次，确保心脏表面干净。
随后，用取决于细胞类型和实验目的的酶消化液，如胰酶和胶原酶混合物溶液，对心脏进行消化。
消化时间可能需要根据实验目的的不同而有所差异，通常为30-60分钟。
在消化过程中，可以用显微镜观察和记录细胞的释放情况。
消化结束后，用完整培养基将消化产物传递到细胞培养皿中。
细胞培养皿需要经过预处理，用缺血的培养基包裹，并在37摄氏度的恒温培养箱中进行预暖。
将消化产物收集到离心管中，并用完整培养基进行离心，以去除酶消化液和细胞碎片。
离心结束后，将上清液抛弃，细胞沉淀用预热的完整培养基进行重悬。
通过显微镜观察细胞的形态和数量，并计算细胞的产量和存活率。
对于心肌细胞的鉴定，我们可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等方法。
通过使用心肌标记物，如心肌肌动蛋白、酒石酸可溶性酸酐酶等，我们可以确保分离得到的细胞是心肌细胞而不是其他细胞类型。
在培养心肌细胞时，我们可以使用培养基中添加特定生长因子和血清的方法来促进心肌细胞的增殖和存活。
在培养过程中，需要定期更换培养基，并进行细胞观察和记录。
注意细胞的形态变化，如细胞肥大和收缩、形成心肌样结构等。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
适于膜片钳实验的心肌细胞分离方法及维拉帕米对钙电流的作用
适于膜片钳实验的心肌细胞分离方法及维拉帕米对钙电流的作用张彦燕;黄勇攀;石刚刚【摘要】目的:建立适应于膜片钳实验的大鼠单个心室肌细胞的分离方法,探讨L-型钙通道在大鼠心肌电活动中的作用.方法:采用改进Langendorff装置,酶解法分离单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L-型钙电流及维拉帕米的作用.结果:该法分离到的心肌细胞存活率达80％～90％,高倍镜下细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰;成功记录到典型L-型钙电流(Ica-L),给予维拉帕米(0.3、3、30 μmol/L)后呈浓度依赖性抑制钙电流,其抑制率分别为(44.35±5.52)％,(61.06±2.99)％,(71.88±4.45)％.结论:改进心肌细胞的分离方法可获得大量耐钙心室肌细胞,这些细胞具有正常的电生理特性.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2014(039)005【总页数】4页(P638-641)【关键词】心肌;细胞分离;膜片钳术;L-型钙电流;膜电位【作者】张彦燕;黄勇攀;石刚刚【作者单位】贵阳医学院药理学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院药理学教研室,贵州贵阳550004;汕头大学医学院药理学教研室,广东汕头515041;汕头大学医学院药理学教研室,广东汕头515041【正文语种】中文【中图分类】R331.38;R916.2离子通道功能的改变是心血管疾病发生发展的重要原因，调整离子通道的功能状态已成为新近研究的热点。
膜片钳技术可反映细胞膜上单个离子通道的活动，是通道电流记录的重要研究技术。
膜片钳技术要求分离的心肌细胞具有耐钙、细胞膜完整、平滑、细胞表面清晰等特点，以便于形成高阻封接[1]。
目前酶解法分离心肌细胞最大的困扰是分离细胞易发生“钙反常”现象[2-5]，分离下来的细胞一旦在台氏液中恢复生理钙离子浓度，往往会发生死亡。
因此获得形态和生理活性良好及耐钙的心肌细胞是膜片钳实验成功的关键。
一种简单快速的心肌细胞分离培养方法
Ｃｏ ｎ－
ｃｕｓｏ ｌ ｉ ｎ Ｂｙ ｔ ｔ ｄｏ ａｄｉｃ ｔｓｕｅｅ ｐ ａ ｔｔｏ ｈｅ ｍｅｈｏ ｆｃ ｒ ａ ｉｓ ｘ ｌ ｎ ａｉｎ，ｃ ｒ ａ ｉ ｇ ｅｍｙ ｃ ｔ ａ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓｌ ａｄｉｃ ｓｎ ｌ ｏ ｙｅ ｃ ｎ ｂ ｂ ａｎｅ ａ ｉ ｙ．Ｔｈｅ ｍｅｈ ｄ ｏ ｉｓ ｔｏ ｆｔｓｕｅ
一
１ 材 料 与方 法
１ １ 实验动物 ． １ ２ 试剂 ．
豚 鼠由北京维通利华实验动物技 术有限公
司提供 ， ～ １ ３天龄乳 鼠 ， 雌雄均可 。 基础 培养液 ： ＭＥ 培养基 （ Ｉ Ｃ １ ． Ｄ Ｍ Ｇ Ｂ Ｏ） ０ ０ｇ， Ｎ ＨＣ ． 加膜去离 子水 １ ０ 溶解 ，调 ｐ ａ Ｏ ３７ｇ， ０ｍｌ ０ Ｈ至 ７ ２ ．
有心肌细胞 节律 收缩 特性 ， 膜片钳可 以记录到细胞 Ｉ Ｉ电流。结论 及 个心肌细胞 ， 所获得的细胞具有 良好的功能状态 ， 操作 方法 简单 。
［ 关键词 ］ 心血管病学 ； 肌细胞 ； 心 原代培养 ； 片钳 ； 鼠 膜 豚 中图分 类号 Ｒ ２ ． ８ ３９２ 文献标识码 Ａ 文章编号
ｐ ｒｍｅ ｔｏ ａ ｄ ｏｏ ｙ ｅ ｉｇ Ｕｎ ｏ ｄ ｃ ｌ ｌ ｇ ｓ ｉ ｌ ｈ ｎ ｓ ａ ｅ ｆＭｅ ｉａ ｃ ｅ ｃ ｓ ａ ｄ Ｐ ｋ ｎ ｎ ｏ ａｔ ｎ ｆＣ ｒ ｉｌｇ ，Ｐ ｋ ｎ ｉｎ Ｍｅ ｉａ ｌ ｅ Ｈｏ ｐ ｔ ，Ｃ ｉ ｅ ｅ Ａｃ ｄ ｍｙ ｏ ｄ ｃ ｌＳ ｉ ｎ ｅ ｎ ｅ ｉｇ Ｕ ｉｎ Ｃｏ ｅ ａ
探讨心肌组织块体外原代培养豚 鼠心肌细胞 的方法。方法
用心脏 组织块体 外贴块种植 原代培养豚鼠心肌细胞 。结 果 该方 法能成 功地培 养出原代 心肌细 胞 ， 能够传代 ， 并 倒置相差显 微镜 下证 实培养的细胞 为心肌细胞 ， 免疫组化染色鉴定 为心肌细胞 特异性蛋 白 ｃｎ Ｔ Ｔ表 达阳性 ， 同时具
心肌细胞分离方法
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35)4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ4.2 [王振国.四医大硕士论文。
2005]30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35)5.120mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。
20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。
20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。
5.2100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。
100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。
50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。
5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。
6.心肌细胞分离其步骤简述如下：1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重）2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。
3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙台式液灌流约10min5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶液约2min。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏组织的主要细胞类型，对于研究心脏生理和病理具有重要意义。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养。
1.1 心肌细胞分离缓冲液的制备材料：胰酶（Sigma）胆汁酸（Sigma）肝素（Sigma）Krebs氏缓冲液（pH 7.4）制备：将1g胰酶、0.5g胆汁酸和10mg肝素混合后加入50ml Krebs氏缓冲液中，搅拌均匀，过滤，滤液称为酶液。
材料：大鼠心脏酶液Krebs氏缓冲液10% FBS器材：离心机冷藏离心管15ml离心管显微镜步骤：1）将新鲜大鼠心脏取出，迅速放入Krebs氏缓冲液中洗涤，去除残留的血液。
2）用冷Krebs氏缓冲液冲洗心脏3次，每次放入小的离心管中。
3）将心脏移入含有酶液的小离心管中，密封，放在离心机上，以适当的速度进行离心，细胞可保持在液体表面，离心时间约15分钟。
4）取出细胞上清，加入等体积的10% FBS，反复吹打分散心肌细胞。
5）收集细胞悬液，显微镜下观察细胞形态，统计细胞形态和数量。
6）以1×105个细胞/ml的浓度培养心肌细胞。
2. 心肌细胞的鉴定材料：FITC-α-肌球蛋白抗体Dil-α-肌球蛋白抗体显微镜步骤：1）将心肌细胞培养在玻片上，用50%乙醇固定，洗涤3次。
2）将细胞孔洞用Dil-α-肌球蛋白抗体标记，加入1/1000浓度的FITC-α-肌球蛋白抗体，封片，显微镜下观察合适的细胞，记录下为肌细胞转化的细胞数量，计算纯度。
材料：DMEM/F12培养基（Hyclone）10% FBS（Gibco）5% CO2孵育箱步骤：1）将心肌细胞密度调节至1×105个细胞/ml，加入10% FBS的DMEM/F12培养基，离心5分钟，移除上清液，加入完整培养基缓慢培养。
2）培养中周期观察心肌细胞的形态和数量，添加必要的药物，并及时更新培养基。
3）心肌细胞培养时间一般在3-5天，在适当的阶段进行下一步实验。
适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究
［ 要 ］目的 ： 摘 摸索 并 建 立简 便 可 行 的适 于 做 膜 片钳 实 验 的心 肌 细 胞 急性 分 离 方 法 。 法 ： 用 自行 改进 的 Ｌ ｎ ｅ ｄ ｒ 方 采 ａ ｇ ｎ ｏｆ ｆ 心 脏 灌 流 装 置 ， 无 钙 台 氏 液 和 酶 解 液逆 行 主 动脉 灌 流 之 后 ， 取 心 肌 组 织 置 于 Ｋ 用 剪 Ｂ液 中 保存 以供 全细 胞 膜 片钳 方
（ ｅａ ｍｅｔｆ ｈｒ ｃｌ ｙＴａｊ ｄｃｌ ｎｖｒｉ ， ａｊ ００ ０Ｃ ｉａ Ｄ ｐｒ ｎ ａ ｔ ｏ Ｐ ｍａｏ ｇ， ｉ ｉ Ｍｅｉ ｉ ｓｙ ｉｎｉ ３０ ７ ，ｈｎ ） ｏ ｎｎ ａ Ｕ ｅ ｔＴ ｎ
ＡＢ Ｔ ＡＣ Ｏｂ ｅｔ ｅ ｏ ｅｐｏｅ ａ ｄ ｅｔ ｌ ｈ ａ ｓ ｐｅ ａ ｄ ｒｌ ｂｅ ｉ ｌｔ ｎ ｍ ｔｏ ｆｓ ｇ ＳＲ Ｔ ｊｃｉ ：Ｔ ｘ ｌｒ ｎ ｓ ｂｉ ｉ ｌ ｎ ｅｉ ｌ ｓ ａｉ ｅｈｄ ｏ ｉ ｌ ｖ ａ ｓ ｍ ａ ｏ ｏ ｎｅ
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式 记 录 电流 结 果 ： 离所 得 ８ ％～ ０ 分 ０ ９ ％的 细胞 呈 杆 状 ， 边缘 清楚 ， 面 光 滑 ， 理 清 晰 ， 表 纹 可记 录到 典 型 的快 钠 电 流 。结
论 ： 制 好 分 离 心 肌细 胞 的实 验 条 件 以 及熟 练 掌 握 实 验操 作 的方 法 ， 分离 出适 合 于膜 片钳 实验 的心 肌 细 胞 的重 要 控 是
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心脏功能的重要细胞模型。
对大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是进行心血管疾病研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的方法和步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 器材准备分离大鼠心肌细胞需要使用一些基本实验器材，包括离心机、显微镜、细胞培养箱、灭菌培养仪、移液器等。
还需要一些特殊器材，如细胞分离酶、细胞培养耗材等。
2. 细胞分离液的制备将适量的细胞分离液（比如包含胰酶和胰蛋白酶的消化液）配制好，根据具体的实验目的和所用试剂的浓度来调配。
3. 大鼠心脏的取样将需要的大鼠的心脏取出，迅速置于含有氧合液的离心管中，将其置于4°C的冰箱中等待使用。
4. 心肌细胞的分离将心脏组织放入离心管中，使用消化液进行酶解，经过一定时间的消化后，使用吸管或移液器将含有心肌细胞的上清液取出，用培养基冲洗数次，离心收集细胞。
5. 细胞的筛选用胶原酶进行细胞的预遴选，再用显微镜进行筛选。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定通过显微镜观察心肌细胞的形态结构，确定细胞形态是否符合心肌细胞的特征。
2. 免疫细胞化学染色使用心肌细胞特异性的标记物（如肌球蛋白、肌凝蛋白等）进行染色，观察细胞的染色情况，确定细胞的心肌细胞特异性。
3. 免疫细胞化学鉴定通过Western blot和免疫荧光染色等技术，对心肌细胞的标志性蛋白进行检测和鉴定，确保细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 细胞培养基的配制根据实验需要，配制适当的细胞培养基，为心肌细胞提供适宜的培养环境。
2. 细胞的培养将鉴定合格的大鼠心肌细胞转移到含培养基的培养皿中，放入细胞培养箱中进行培养，定期更换培养基，观察细胞的生长状态。
3. 细胞的传代当心肌细胞的密度适宜时，可以进行细胞的传代，将细胞分离并转移至新的培养皿中进行继续培养。
4. 细胞的应用经过培养的大鼠心肌细胞可以用于细胞生物学实验、药物筛选、毒性测试等领域的研究，为心血管疾病的研究提供重要的细胞模型。
原代心肌细胞分离 实验(体验版)
原代心肌细胞分离1 材料与方法1.1实验动物选择出生0.5-1天的清洁级SD新生大鼠，雌雄不限1.2主要的实验仪器CO2恒温培养箱；倒置显微镜；Nikon-E440荧光显微镜胰酶；Ⅱ型胶原酶；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）；肌球蛋白重链蛋白（MF-20）单克隆抗体（武汉博士德公司）;Hoechest；无钙镁磷酸盐缓溶液；胎牛血清（FBS）；氯霉素+新链霉素溶液I 15ml（DMEM-F12 13.5ml，FBS1.5ml，氯霉素+新链霉素150ul）溶液II 30ml（DMEM-F12 25.5ml，FBS4.5ml，氯霉素+新链霉素300ul,BrdU 100ul 10mg/ml）新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶（0.01g粉末+ 10ml PBS 0.2um过滤器过滤）1.3大鼠心肌细胞分离和培养于超净工作台中，取新生1-2天SD大鼠10只，75%酒精溶液浸泡3-5s杀菌消毒。
更换器械于无菌条件下立即打开胸腔,准确取出心脏,放于预冷的无钙镁磷酸盐缓溶液中漂洗5次，并依次去除心脏周围及心脏房室腔内的血液或血凝块，剪去心房部分，获取心尖心室部分，迅速转移至200ul预冷的0.1%胰酶的无钙镁磷酸盐缓液中，将心肌组织反复剪成约0.5-1 mm3的组织块，将剪碎的组织块混合液转移到50ml的离心管中静置于冰箱4℃消化过夜（每隔段时间摇晃一下）。
第二日，配置新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶10ml（0.2um过滤器过滤），置换等量心脏消化液，于磁力搅拌器上温和搅拌消化30min，温度34℃，转速100-120g。
待消化液中组织块全部消化完时，加入10ml溶液I终止消化，1500rpm离心10min,小心弃去上清，加入5ml溶液I，1500rpm离心5min，小心弃去上清，加入溶液II 10ml(含0.1 mmol/L BrdU，以抑制成纤维细胞的增殖)，轻轻吸打混匀后400目细胞筛过筛入10cm大皿中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，差速贴壁培养2h。
心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察
3基金项目国家自然科学基金(N 13665),广东省自然科学基金重点项目(N 16)和广东省医学科研基金(35)收稿日期226心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察3高分飞 黄展勤 周燕琼 石刚刚(广东省汕头大学医学院药理学教研室 汕头 515041)摘要 目的:探索建立简单可靠的心肌细胞的酶解分离方法,提高细胞存活率和膜片钳实验成功率。
方法:采用Langendorff 装置,无钙液和胶原酶P 二步灌流法分离心肌细胞。
显微镜下观察细胞形态结构,并应用膜片钳全细胞技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流。
结果:心肌细胞存活率高,形态结构良好,可成功记录出瞬时外向钾电流。
结论:通过改进的分离方法获得的心肌细胞存活率高,具有正常的电生理特性。
关键词 心肌;细胞分离;膜片钳;瞬时外向钾电流中图分类号:R319 文献标志码:A 文章编号:10052930X (2008)0320338203IM PRO VEMENT OF MYOCAR D IAL C ELL IS OL ATIO N AN D OBSERVATIO N OF PO TASSI 2UM CURRENTG ao Fenfei ,Huang Zha nqin ,Zhou Y a nqiong ,et al.(Depart ment of Phar macology ,Medical College of Sha n 2to u Univer si ty ,G uangdong ,Shant ou 515041China)Abstract Object ive :To explore a nd est ablish a si mple and relia bl e met hod of i solati ng si ngl e cardiac myo 2cyt es in order t o improve t he qua nti ty a nd qualit y of cell s for patc h cla mp research.Met hods :The vent ric u 2lar myocyt es we re isol ated e nzymaticall y by t wo 2step perfusion wi t h calci um 2f ree solution and collagenase P on t he Langendorff apparat us.The morphous and const ruction were observed under t he mi croscope ,and t he t ransi ent out ward pot assi um cur re nt was recor ded by t he use of pat ch clamp whole 2cell recordi ng t ec h 2ni que.Resul t :The survival rat e of m yocar dial cel ls was high and t he morphous and co nst r uct io n of myocar 2dial cel ls was fi ne.The t ra nsient outward pot a ssium cur rent was recorded succe ssfull y.Conclusion :The i mproved met hod of i sol ation can produce la rge numbe rs of single myocardial cell s wit h high survi val rate and normal elect rophysiological propert ies.K ey w or ds myocardium ;cell i solation ;patch cla mp ;t he t ra nsient outward pot assium current 在电生理学研究中利用膜片钳技术进行心肌细胞的离子通道和受体的研究,或是利用激光共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度来测定细胞内游离钙离子浓度等,都需要制备理想的单个心肌细胞。
分离心肌细胞
急性分离大鼠心肌细胞：1，准备工作：a，器械：恒温水浴锅，langendorff装置，氧气，剪刀，止血钳，平镊，弯镊，眼科剪，平皿2个，500ml烧杯2个，100ml量筒1个，100ml注射器1个，1ml注射器2个，试管5-7个，吸管2个b，液体：母液，NaOH(3mol/L),CaCl2(0.9mol/L),葡萄糖（细胞营养），II型胶原酶，BSA（胎牛血清蛋白，心肌细胞保护作用使其不至被酶损害），KB液（细胞保存液）。
2，步骤：a，打开水浴锅，调节温度到37-37.5℃，提前拿出-20℃的KB液放在水浴锅中融化。
b，洗涤所有玻璃器皿，并用去离子水冲洗。
c，用去离子水从上倒入冲洗langendorff装置，用注射器从装置下端打入弯管中冲洗3遍。
最后用少量去离子水液封装置，避免灰尘进入。
d，配制无钙液：60ml台氏母液＋540ml去离子水＋葡萄糖1.2g（100ml/0.2g），充氧30-50min （一般可充40min），用NaOH调节PH至7.35-7.40。
e，配制有钙液：每100ml台氏液加0.2ml CaCl2，混合均匀。
一般取300ml无钙液。
f，酶液配制：10mg II型胶原酶＋10mgBSA＋50ml无钙液溶解（酶液在取挂心脏结束后，再配制，避免酶液降解；先称取的酶应放于抽屉中避光保存。
）g，将有钙液用注射器从langendorff装置下端打入弯管中至上端脖颈处，注意不要有气泡，并将无钙液从装置上端倒入，打开氧气，将氧气针头插入langendorff管内。
（PS：如果出现气泡反复挤压灌流装置下端胶管，将气泡挤到弯管上端）h，将针头安装在langendorff装置最下端，注意不要有气泡。
（PS：可将三通装置的灌流方向堵住，轻推注射器使有钙液流出，用液体流的冲击力冲破针头安装处的表面张力，消除气泡。
）i，取成年大鼠一只，雌雄不限，给一定剂量的麻药（依据体重）将大鼠麻倒。
(或断髓) j，打开恒温水浴锅外循环，维持灌流液温度。
心肌细胞解离的原理是
心肌细胞解离的原理是心肌细胞解离是指从心脏组织中分离出心肌细胞的过程。
心肌细胞解离的原理涉及到心肌组织的结构、细胞间连接物质以及溶解试剂的使用等方面。
心肌细胞是构成心肌组织的基本单位，具有特殊的形态和功能。
解离心肌细胞的目的在于研究细胞的特性、功能以及相关的生理病理过程。
下面将从三个方面详细探讨心肌细胞解离的原理。
第一，心肌组织的结构。
心肌是由肌原纤维组成的，这些肌原纤维由一系列排列有序的心肌细胞构成。
心肌细胞之间通过特殊的连接结构相连，形成一个连续的网状结构，称为“间质”。
间质是由细胞间空隙和胶原纤维组成，起着维持细胞的形态和连接的作用。
解离心肌细胞的过程中，需要通过破坏细胞间胶原纤维和间隙结构来分离心肌细胞。
第二，细胞间连接物质。
心肌细胞之间主要通过细胞间连接物质——间隙连接连接在一起。
间隙连接是一种特殊的细胞间连接结构，由连接蛋白、连接蛋白亚基和管道蛋白组成。
这些蛋白质形成了通道，使细胞内的离子和分子能够相互传递，起到细胞间信号传导的作用。
解离心肌细胞时，需要使用溶解试剂如胰蛋白酶、胆甾醇酯酶和组织胺等来破坏细胞间连接物质，从而使心肌细胞分离开来。
第三，溶解试剂的使用。
解离心肌细胞时，需要使用含有特定酶的溶解试剂来破坏细胞间连接物质和溶解心肌细胞。
溶解试剂的选择和使用方法对心肌细胞解离的效果有重要影响，因此需谨慎选择。
常用的溶解试剂有三种，分别是胰蛋白酶、胆甾醇酯酶以及组织胺。
胰蛋白酶是一种消化酶，能够降解蛋白质。
在解离心肌细胞时，胰蛋白酶可以破坏细胞间连接物质，使心肌细胞分离。
胆甾醇酯酶是一种胆汁酶，能够破坏胆囊中的胆汁组分。
在解离心肌细胞时，胆甾醇酯酶可以破坏心肌细胞和细胞间连接，使心肌细胞自由分离。
组织胺是一种生物活性物质，能够引起心肌细胞的收缩和痉挛。
在解离心肌细胞时，组织胺可以使心肌细胞快速收缩，从而使心肌细胞分离。
总结起来，心肌细胞解离的原理涉及到心肌组织的结构、细胞间连接物质以及溶解试剂的使用。
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成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35)
4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶
45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ
4.2 [王振国.四医大硕士论文。
2005]
30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA
5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35)
5.1
20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。
20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。
20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。
5.2
100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。
100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。
50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。
5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL
复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL
复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。
6.心肌细胞分离
其步骤简述如下：
1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重）
2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内
残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。
3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液
4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙
台式液灌流约10min
5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶
液约2min。
6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。
7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。
8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入
新鲜含2%BSA的KB液。
9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙
耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。
另一说：
8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。
9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。
15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
仪器检测。
注意事项：灌流消化过程中维持7.5~ 10.0 kPa 的压力, 所有液体均用0.22 μm 滤器过滤除菌且用体积分数95% 的O2+体积分数5%的CO2 混合气体饱和, 灌流温度保持在35℃, 实验室温度保持在20-30℃。