心肌细胞分离方法

成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：

4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35)

4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]

100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶

45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ

4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005]

30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA

5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35)

5.1

20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。

20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。

20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。

5.2

100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。

100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。

50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。

5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]

复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL

复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL

复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。

6.心肌细胞分离

其步骤简述如下：

1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重）

2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内

残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。

3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液

4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙

台式液灌流约10min

5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶

液约2min。

6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。

7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。

8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入

新鲜含2%BSA的KB液。

9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙

耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。

另一说：

8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。

9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上

仪器检测。

注意事项：灌流消化过程中维持7.5~ 10.0 kPa 的压力, 所有液体均用0.22 μm 滤器过滤除菌且用体积分数95% 的O2+体积分数5%的CO2 混合气体饱和, 灌流温度保持在35℃, 实验室温度保持在20-30℃。