世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]

序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.

note:这篇文章全是我个人的经验，99。9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。

1.材料选择。一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；

其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；

再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，neurobasal 是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。

注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.

3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hanks的无糖环境很不利。我个人

的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml 新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。

我们采用的是最合理的分步吹打法。每个10次吹打过后，静止2分钟。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。

9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep™ 1.077 推荐稀释成60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。注意：1.077被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么请换算一下稀释度）值得注意的是，

皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转（不是15000请注意）5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。而最上层最浮头，则是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差别。有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。

10.种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。记住的是，神经元原代培养是细节决定成败，任何一个环节没处理好，整个实验都会失败。

种板密度过低是非常有害的。首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。其次，胶质细胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。

密度过高也是很有害的。由于营养争抢，密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡。另外，高密度会导致细胞聚团，结果也是细胞不正常形态或者死亡，导致错误或失败的实验结果。

笔者的经验是6孔板每一个孔要有7×100000 个正好（如果是台酚蓝染色只记录活细胞，那么酌情减少密度）。注意，注意！！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，所以细胞计数一定要非常严肃认真！！！一定要所有格子都看！！如果发现计数板细胞不均匀，宁愿重新计数！！！由于接触抑制现象，适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的实验