世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。

需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。

培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。

其中，neurobasal 是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。

不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。

很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。

由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。

注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。

所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。

大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。

这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。

另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。

一定要注意多准备冰袋子。

确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。

这样可以大大提高存活率。

在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。

根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。

所以，hanks的无糖环境很不利。

我个人的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。

在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml 新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。

吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。

吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。

轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。

我们采用的是最合理的分步吹打法。

每个10次吹打过后，静止2分钟。

这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。

上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。

下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。

3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。

造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。

这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。

重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。

这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。

消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。

实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。

9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。

一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。

但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。

为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。

现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep™ 1.077 推荐稀释成60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。

注意：1.077被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么请换算一下稀释度）值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。

一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。

把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转（不是15000请注意）5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。

而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。

而最上层最浮头，则是细胞碎片。

这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。

如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。

注意：母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。

另外皮层和海马浓度也稍微有差别。

有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。

10.种板。

这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。

记住的是，神经元原代培养是细节决定成败，任何一个环节没处理好，整个实验都会失败。

种板密度过低是非常有害的。

首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。

其次，胶质细胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。

密度过高也是很有害的。

由于营养争抢，密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡。

另外，高密度会导致细胞聚团，结果也是细胞不正常形态或者死亡，导致错误或失败的实验结果。

笔者的经验是6孔板每一个孔要有7×100000 个正好（如果是台酚蓝染色只记录活细胞，那么酌情减少密度）。

注意，注意！！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，所以细胞计数一定要非常严肃认真！！！一定要所有格子都看！！如果发现计数板细胞不均匀，宁愿重新计数！！！由于接触抑制现象，适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的实验由于neurbasal培养液相当昂贵，所以种板时候是不用它的，而第一次换液才用。

一般种板时候我们用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%马血清。

注意一定要进口的。

国产杂质很多会导致莫名其妙的细胞死亡。

马血清会抑制神经元凋亡并且抑制胶质细胞生长（FBS也可以，但是太贵）种板注意事项一：种板时候的溶液推荐使用含有谷氨酸的培养液。

神经元的NMDA等谷氨酸毒受体一般3天后才会出现。

所以种板时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应。

而这时候的谷氨酸反而是有利条件，可以促使神经元贴壁，从而提高存活率。

注意事项二（严格注意）种板后都是要摇晃板摇匀细胞，切记！千万不能圈圈摇晃！！圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀，会直接导致实验失败。

正确的摇法是左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度，千万不要让里面液体画圈！注意事项三（严格注意）种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的无血清培养液。

很多paper是1小时就换液，理由是胶质细胞贴壁差，会除去。

但是笔者的经验来看，这是极端错误的！1小时换液，神经元还没有完全贴壁，这时候换液会吹下很多神经元，流到孔另外一侧再贴壁，直接照成一个孔内细胞分布不均匀，从而成熟的不均匀。

严格来说这种事情直接实验失败。

笔者的经验是种板4-6小时换液，但是千万不能超过12小时。

原因是：超过12小时，混在细胞悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁，而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外12小时后，胶质细胞会开始分裂，这时候就很难抑制了。

笔者推荐是4小时，但是别超过8小时。

注意事项四：4小时后换液时，请轻轻摇晃板几下再换。

原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。

然后，注意：细胞请再用没有加血清的，种板时候用的培养液清洗一次，也是要轻微摇晃，来进一步去除细胞碎片，从而得到良好的细胞生长环境。

有条件也可以洗两次，但是笔者觉得一次足够。

洗了之后吸干液体，换成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神经元专用无血清培养基。

对于原代培养，是细节决定成败，一个地方不够好会满盘皆输，所以请严肃对待。

（德国队的fans于凌晨）×××××××××ugly分界线××××××××××××下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒，请大家注意，我把回帖编辑到这里了。

enjoy.刚回答了一系列形形色色的问题，我把这个问题挑明了说。

如果您不相信neurobasal最好的而还是坚持用DMEM之类的培养液，麻烦检查一下你们的DMEM或者MEM或者DMEM-F12的invitrogen产品序列号，到网站上检查下相应的组成公式。

很多这种培养液都是含有谷氨酸，而且是mmol级的。