植物细胞融合实验

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先把待融合的细胞或原生质体混合，
取样置于100V/cm的高频交流电场中，在
非均匀交流电场中形成项链状排列；
完整烟草原生质体（40×） 原生质体成串（40×）
再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成 若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细 胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的 形成。
主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、 二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。 （三）电处理融合法
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聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在众多的化学试剂中，PEG应用最为
广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、 活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合 的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosome s is reduced.
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Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
实际操作：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用 下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现 细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的 膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在 培养过程中多核细胞又进行核的融合而成 为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核 的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
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三、细胞融合技术原理和方法
由于体外培养的细胞很少会发生自发 融合（融合频率大约在10-4~10-6之间）， 因此要采用生物、化学或物理的方法人为 地促使细胞融合。
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促细胞融合的方法有： （一）病毒促进细胞融合
其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融 合的融合剂。 （二）化学融合剂促进细胞融合
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电融合法优点（与Pቤተ መጻሕፍቲ ባይዱG法比较）：
1、融合率高； 2、重复性强；
Electrofusion
3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质
体伤害小；
4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；
5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录
像融合过程；
6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制
电融合（electrofusion technique)法：
电处理融合法是20世纪80年代发展起 来的细胞融合技术，使融合率大为提高。
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Model ECM830 from BTX
Electroporator 2510 from Brinkmann
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电融合过程的分子机制： 是以电降解及双向电泳的联合作用为
基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且 膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白 的类脂区。
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电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱， 出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范 德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接 处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态， 在热力学上是不稳定的，所以最终导致两 细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。
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使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引起融合。
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一、细胞融合的目的和意义
细胞融合能实现远缘杂交。其意义在 于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造 新种的界限，有可能形成有性杂交方法无 法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基 因型，扩大了遗传物质的重组范围。
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二、细胞融合（cell fusion)概念
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A Alignment:
Cells are brought into close contact by means of dielectrophor esis.
B Fusion pulse:
A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is applied in order to permeate the membrane. The membranes then fuse.
在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两 个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完 整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代 的一些优良性状。
细胞在融合过程中发生的主要变化： 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
C Heterokaryon phase:
The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together. Only the nuclei remain separate.
D Entire fusion product:
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PEG诱导原生质体融合的机理： 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合，使溶液中自由水消失，由于高度 脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不 同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭 曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可 能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂 质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰 动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合， 形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大， 两个原生质体最终融合。