用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片

其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。 可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染 料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
2.2 抽样测量光密度

在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
背景的影响

左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD 值。而且影响到了阳性区域的色调。
较暗的背景值对分析测量的影响
1.6 1.2 0.8 0.4 0
阳性样品 阴性样品 背景 背景+阳性样品 背景+阴性样品
1.2 1.0
1.1
显著性 差异
0.2
0.1
无显著 性差异
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品 1.6 阴性样品 背景 1.2 阳性样品-背景 阳性样品-背景 1.2 1.2 1.1 1 1.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0
随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
2.3 ImagePro plus(IPP)的独特优势。

准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。
使用IPP比前两种方法更好。
பைடு நூலகம்
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。

单个细胞的IOD 单个细胞的mean density
边界不清晰的贴壁细胞

整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
细胞簇的分析

测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N * area）作为统计指标。
3.2.2.2选择测量参数



需要测量选择区域的面积(area)与累积光密度 (IOD).在测量选项中也有平均光密度这一项,但 它不适用于当前的测量,不能选用. 选择面积时一般要设置一个过滤值,忽略掉面 积过小的点,一般可设置为最小20象素. 还要设置一下测量的显示选项(option),一般是 选择显示选择区域填充红色.还有一些其他的 设置.



IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域面积作平均。√ IOD对显色的组织区域作平均。
对整张图片区域进行平均的情况比较少
右上角的空白应该扣除。
也许应是这个特定的组织区域
这个区域是染色的区域。往往在计算 IOD时同时计算出来，但以此为平均 面积往往并不正确。
对单个细胞的分析比较
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫组化图片
1.免疫组化图片分析原理


根据染色染料颜色的深浅(光密度)及分布面积 大小来确定目标蛋白的量。 染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量的定量 关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。
1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
固定显微镜的工作条件


不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台 位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来 回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物 镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上 拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该 一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微 镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光 源亮度的稳定。
用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起



OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电 泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函 数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进 行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线 亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。 在实际应用时,可以直接测量OD值,用以表达染色 物质的相对的量.
Optical Density: 吸收光线的物质的光学密度.


被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。 OD值与物质的量直接相关，灰度值与OD值成对数关系，符合 朗伯-比尔定律。 理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0 - 2.0或者0 - 3.0。
应当把照片存为无损压缩格式TIFF

特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。要注 意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成 TIFF了.
注意那些 马赛克
总结拍摄注意事项：




调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但可以使用 手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一 次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。
3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片


与photoshop不同，image-pro plus是一个图 片分析测量软件。 IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果 不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄 过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰 与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应 当准确地反映图片本身的真实测量数据。
3.2.2.设置并保存测量条件

设置光密度校正 设置测量项目. 设置分色选择参数
3.2.2.1光密度校正方法
校正光密度步骤小结.




1.调出intensity carliberation窗口,点New按纽 建立一个新的校正. 2.选择std option density,此时可见到反向的校 正曲线. 3.选择背景空白值对应的灰度.相当于分光光度 计中的调整100%透射. 4.选择此校正为system carliberation,使之能应 用于所有照片.
0.8
注意误差线，依然 没有显著性差异
0.2 0.1
0.4
0
阳性样品 阴性样品 背景 阳性样品-背景 阳性样品-背景
避免使用相机的自动白平衡

自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进 行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显 微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不 能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色 调向蓝色调整,导致色彩的失真.
3.用IPP分析免疫组化图片过程



选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算选择区域内的光密度平均值IOD/area （density mean） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著性差异。
2.从图片上分析光密度方法 的技术发展



简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。 计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区 域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍 摄

与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的 显微镜照片有其特殊的拍摄要求。
显微镜光源




正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色 滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指 示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清 晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清 晰. 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。 6%的灰度滤光片会导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从 而使得测量结果不准确。
1.3比较两张照片的染色物质量的差别

两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
比较两张照片的染色物质量的差别

两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
这回该怎么看？

A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A 照片B
比较体积！
IOD density( x, y )ds
最好使用专业CCD拍摄


民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片， 其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片 的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却 会改变照片的原始面貌，严重影响照片的分析 测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很 复杂的设置。 不使用自动白平衡校正，但可以使用手动的白 平衡校正背景色彩。对所有照片进行统一的背 景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。
应该使用手动控制曝光的相机


对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由 相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅 的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。
控制相机曝光时间



要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。 把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上 调节100%透射。