IPP 分析免疫组化图片
用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片共39页
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
IPP使用教程
Image pro-Plus6.0 使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。
在你开始学习使用IPP 之前，我假定你是会初步使用office 及photoshop 等常用程序的。
如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。
因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。
这些用不着我来讲。
这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。
处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。
对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。
所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。
这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。
AOI 是IPP 中最有用最重要的概念。
如何能够准确地选取AOI 就是使用IPP 的关键操作。
一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。
在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。
可以说，使用IPP 的要点就是灵活地使用各种AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。
手把手教你使用IPP
入门Imageproplus（IPP）的主要用途是分析测量图象。
本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法。
如果你是刚接触IPP，最好先从本帖看起，并同时打开你电脑上的IPP程序照着操作。
学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会。
两小时也太短。
但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用IPP干一点事情了。
打开IPP后的界面是这样的，该从何处下手呢？既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。
处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的“量”。
对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。
所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI（area of interest）。
AOI是IPP中最有用最重要的概念。
如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。
一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。
对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，就这张图片来说，AOI是黄色区域，因此用颜色分类的AOI工具是最有效的。
点击measure---count/size,弹出分类测量窗口。
在窗口中选中manual，再点击select color，弹出颜色选择窗口segmentation，这个工具是IPP 最有特色的颜色选取工具之一。
用好这个工具是使用IPP的要点于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。
点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。
在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。
IPP-分析免疫组化图片 ppt课件
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
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哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
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比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
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这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
(完整版)IPP使用教程
Image pro-Plus6.0 使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。
在你开始学习使用IPP 之前，我假定你是会初步使用office 及photoshop 等常用程序的。
如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。
因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。
这些用不着我来讲。
这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。
处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。
对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。
所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。
这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。
AOI 是IPP 中最有用最重要的概念。
如何能够准确地选取AOI 就是使用IPP 的关键操作。
一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。
在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。
可以说，使用IPP 的要点就是灵活地使用各种AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。
IPP 分析免疫组化图片(共61张PPT)
各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证 它们的曝光一致。
控制相机曝光时间
要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过 高。
在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
使用IPP比前两种方法更好。
IODdensi(txy, y)ds 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。
右上角的空白区面积应该扣除。 整张图片所有对象的IOD累加值（IOD SUM）
所以最后的分析测量结果依然属于半定量分析。
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
背景
无显著性 差异
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
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阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
用Image-Pro Plus分析免疫组化(IHC)染色强度的方法
节的禁忌制作用Image-Pro Plus分析免疫组化（IHC）染色强度的方法以这两张图为例：眼睛没毛病的都一眼可以看出左边是阴性，右边是阳性，但是就是有些傻X审稿人非要你去把组化的结果做个量化分析好吧，量化就量化吧，但是怎么量化呢？首先，把这两张图合成一张，用PPT啊，PS啊都可以，如下：鬼鬼节的禁忌制作然后，用Image-Pro Plus打开这张图，点这个图标：count and measure objects出来这个框：选Manual，然后点Select Colors，出来这样一个框：点这个图标：节的禁忌制作然后在图上点选棕色的区域，图就变成大概这个鬼样子了：然后点这个键：然后close：然后图片就变成这样了：鬼鬼节的禁忌制作然后用PS或者其他什么软件把这一张图片平均分成两张：然后用Image-Pro Plus 打开这两张图中的其中一张，打开后点这个节的禁忌制作图标：count and measure objects出来这个框：选然后点然后图片变成这个鬼样子：鬼鬼节的禁忌制作然后点这个就会出来这个：看这个数值然后看这个图片的分辨率：473×360=170280（自己百度怎么看）那么这个IHC的染色强度就是49320/170280=28.96%另一幅图片也用同样的处理方法，得出的数据就可以用来做统计分析节的禁忌制作然后作图了。
为什么要先把两张图合并然后又分开呢？这个问题自己去想吧。
That‘s all. Thank you!鬼。
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较暗的背景值对分析结果的影响
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
1.2 1.1
1.0
0.1
阴性样品
背景
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无显著 性差异
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度 计上调节100%透射。
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背景的影响
左图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。 而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析 结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正 一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结 果的。
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
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2.从图片上分析光密度方法
的技术进步
简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区
域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析 仪
S
densi(tmy ea)nIOD/ area
光 密 度
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尺寸
1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
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直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
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哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0-3.0。
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用OD值是正确的
分光光度计与酶标仪的测定值是OD值 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度
(Fluorescence intensity) 用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫
组化图片
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1.免疫组化图片分析原理
根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确 定目标蛋白的量。
染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合
朗伯-比尔定律，是对数关系。
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1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
片。以保证它们的曝光一致。
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控制野中空白的地方 呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过 高。
光密度：吸收光的物质的光学密度。 （optical density,就是常说的OD值）光密度 值是直接与染色物质的量相关的。
灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。
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Gray: between white and blEaxacmpkle:
1.The bright value on display screen is gray value.
0.1 0.1 0.1 1.0
注意误差线增大了， 依然没有显著性差异
0.8
0.4
0
阳性样品
阴性样品
0.2 0.1
背景
阳性样品-背景 阳性样品-背景
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不能使用相机的自动白平衡
自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对 每张照片进行白平衡校正。这会严重影响分析测量的 准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩 就应该是不平衡的，不能校正。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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右上角的空白区面积应该扣除。
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也许应是这个特定的组织区域
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这个区域是特定染色的区域。在计算 IOD时能同时计算出来，但以此为平均 面积往往并不正确。
2.The dark value on a white paper is also the gray value.
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Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质 OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
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3.2.1开始使用IPP
IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含 了最常用的一些windows程序的一些通用工具。
进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的 图片。
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将分析图片信息保存到数据库中
在程序中保存分析图片过程信息是保存实验原 始数据的基本原则，必须遵守。
准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域 的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度 值。
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用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起
OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。
对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲 线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指 数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个 标准点进行定量分析是不准确的。多个标准 点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是 半定量分析。
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对单个细胞的分析比较
单个细胞的IOD 单个细胞的mean density 照片上各细胞IOD或mean density的平均值
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边界不清晰的贴壁细胞
整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
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细胞簇的分析
测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N ）作为统计指标。或IOD/area
是否有显著性差异。
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3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍 摄
与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的 显微镜照片有其特殊的拍摄要求。
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显微镜光源
正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时 是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右。一般的显 微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明 亮得有点刺眼。
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应当把照片存为无损压缩格式TIFF
特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。
注意那些 马赛克
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总结拍摄注意事项：
调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白， 足够亮。
调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。
确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手 动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。
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最好使用专业CCD拍摄
民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动 曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。 但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面 貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍摄条件。 严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能， 往往要进行很复杂的设置。
不能使用自动白平衡校正，但在拍摄前使用手动的白 平衡校正背景色彩却是必须的。在拍摄照片时要对相 机进行背景色彩校正，使得拍摄出的照片中空白的背 景呈白色。这种较正将应用于所有拍摄的照片上，与 自动白平衡较正不同。自动白平衡较正是对每一张照 片都进行各自不同的色彩较正。
使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件 （曝光及白平衡设置）一次拍摄完所有照片。
保存照片为TIFF格式。相素不必太大。
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3.2用Image-pro plus分析免疫组化图 片
与photoshop不同，image-pro plus是一个图 片分析和定量测量软件。
IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果 不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄 过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰 与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应 当准确地反映图片本身的真实测量数据。
方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面的OD 又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映着荧光 物质的多少。
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处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值来 表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个OD 值，光密度。不应该是灰度。
不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会 影响到光学系统分辨率及图象的清晰度。
不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的ND滤光片 还行。6%的ND滤光片常导致色彩失真。
如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片 色彩，从而使得测量结果不准确。