生姜中蛋白酶的提取、分子量和含量的测定

蛋白酶活力的计算：
蛋白酶活力单位【U】= OD595nm * K * N
K--100除以络氨酸标准曲线上100mg/ml对应的OD595nm值
N--酶液稀释倍数
实验过程
（1）制作标准曲线

取7支试管，依次分别加入0.0、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50mL的牛 血清蛋白溶液，用水补足到0.5mL，每管再加5mL染色液，立即摇匀，置于室温 下5min，然后测定在波长595nm下的吸光度，并绘制标准曲线。 吸取0.5ml样品提取液于试管中，加入5ml考马斯亮蓝G250染色液，充分混匀， 静置5min，测量吸光度（OD595nm），记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度 X（μg/ml)
低分子量标准蛋白质液的组成
蛋白质
兔磷酸化酶B 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛磷酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶
分子量
97400 66200 43000 31000 20100 14400
2、分离胶的制备 （1）安装电泳槽 （2）凝胶的制备（先配置分离胶，再配置浓缩胶） （3）灌胶 （4）样品处理 待测蛋白质样品处理：获得的蛋白质样品 50μl,再加入2x 样品缓冲液50μl混匀，在100℃水浴中煮沸5min。
（5）加样 待样品冷却后，用微量进样器吸取30-40μl样品白酶活力的定义：在一定温度（ 40℃）下，每分钟分解
酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。

实验方法：1.0ml蛋白酶液与1.0ml0.5%酪蛋白混合，40℃水浴 保温10min，加入2.0ml0.4mol/l三氯乙酸终止反应，静置10min 后过滤。取0.5ml滤液与5.0ml考马斯亮蓝充分混匀，静置5min， 在595nm处，以对照调消光度0，测量样品吸光度。

课题一、生姜蛋白酶的提取与分离纯化 课题二、生姜蛋白酶活力的测定


课题三、生姜蛋白酶含量的测定
课题四、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定蛋白酶分子量

材料：生姜

试剂：0.01%考马斯亮蓝G-250溶液、标准蛋白质溶液、0.5%酪蛋白 溶液、 0.2mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液、 0.05mol/L pH6.0 的磷酸盐 缓冲液、1N HCl、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶丙胶贮液、 浓缩胶丙胶贮液、过硫酸铵溶液、核黄素溶液、电极缓冲液、 40% 蔗糖、pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%溴酚蓝
样品沉降在凝胶面上。
（6）电泳 （7）剥胶 （8）染色以及脱色 取下电泳后的凝胶板，放入染色液中染色1h，倒回染色液，加入脱色
液，脱液4-8h，其间更换脱色液3-4次。将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中
或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。
3、蛋白质分子量计算 电泳迁移率的计算

相对迁移率（MR) = (蛋白质样品移动距离/脱色后胶长） X（染色 前胶长/指示剂移动距离）

实验过程
（1）生姜蛋白酶提取液的制备 取外形完好无损伤，富含纤维的生姜50g，切成小块， 按料液比 1:2 加入磷酸缓冲液，研磨匀浆 30min ，所得 浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液洗涤后， 收集滤液4℃静置2h，离心去沉淀，上清液用磷酸缓冲 液定容至100mL，4℃冰箱贮存待用。
（2）生姜蛋白酶的纯化 丙酮沉淀→盐析→透析 丙酮沉淀：取生姜蛋白酶溶液 20mL ，加入 1.5 倍的 4℃ 预冷丙酮进行沉 淀，沉淀完全后，4℃静置2h，冷冻离心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。 盐析：沉淀用磷酸缓冲液溶解，用四层纱布过滤，滤液再离心 30min, 取上清液缓慢加入 1.2 倍的冷丙酮酸轻轻搅拌 5min ，离心，取沉淀溶于 Ph6.0 的缓冲液中，缓慢加入硫酸铵至 40% 饱和度，低温静置 24h ，离心， 上清液中继续加入硫酸铵至60%饱和度，低温静置24h，离心取沉淀。 透析：沉淀溶于0.01mol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液中，采用截留分子量 14000U 的透析袋进行 4℃ 透析，直至 1% 氯化钡检查无白色沉淀为止。浓缩 干燥得粗酶粉。
从溶液中分离纯化可溶性蛋白质的主流方法包括：
等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电
荷相等 )，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减 弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀
仪器：研钵、透析袋、垂直板电泳装置、分光光度计、离心机、恒 温水浴锅、匀浆机、分析天平、稳流稳压电泳仪

生姜属姜科姜属植物，是一种重要的药 食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同 源的保健品。目前，在食品中开发利用 的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待开发利用 的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁 凝乳、蛋白质水解等方面。开发生姜蛋 白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶 资源长期依赖木瓜、菠萝等少数热带水 果资源的现状。
物，从而有利于悬浮液的过滤。
盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 透析：是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的
一种分离纯化技术。
生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取方法如丙酮、盐析沉淀法、硫酸铵沉 淀法。本研究中采用磷酸盐缓冲液（Ph6.0）提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析，可获得高酶活的 生姜蛋白酶，而且操作简单，成本低，易于产业化。
（2）生姜蛋白酶含量的测定

（3）生姜蛋白酶含量计算
生姜蛋白酶含量（μg/ml）= ［ X*提取液的总体积］ /
样品鲜重（g)
实验过程
1、试剂的配置

①30%分离胶贮液；②10%浓缩胶贮液；③分离胶缓冲液 ④浓缩胶缓冲液；⑤电泳缓冲液；⑥20%过硫酸铵溶液 ⑦1%TEMED；⑧0.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液 ⑨1mol/L HCl；⑩10%SDS；⑪样品溶解液 ⑫染色液；⑬脱色液