生姜中蛋白酶的提取、分子量和含量的测定
植物蛋白酶(生姜蛋白酶)的提取纯化工艺
生姜蛋白酶的提取纯化工艺一、实验目的1、掌握生姜蛋白酶提取纯化工艺的基本原理和操作步骤2、掌握生物工程下游加工技术的一些方法和技能二、实验原理生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。
其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
然而，生姜蛋白酶属大分子物质，超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题，盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业化生产。
相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。
原因是双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留，分离过程经济等特点。
双水相萃取技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶。
本实验对成相物质组成、浓度和萃取条件进行了初步探索，建立了操作条件温和、能耗低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行的分离提取生姜蛋白酶的方法。
三、试剂与仪器试剂：生姜 TCA纯度99.0％，酪蛋白含氮14.5％-15.5％，考马斯亮蓝G-250，各种聚乙二醇（PEG800、PEG1000、PEG2000、PE G4000、PE G6000、PE G8000，）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，EDTA纯度99.5％，L-半胱氨酸含量98％～102,生姜蛋白酶, 主要仪器：紫外分光光度计，离心机，美菱榨汁·搅拌机，精密增力电动搅拌器，酸度计，四、操作步骤1、生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
生姜蛋白酶的生物大分子修饰-文档资料
➢ 在本实验优化得出的修饰反应条件下，右旋糖苷对生姜蛋白 酶的修饰效果优于聚乙二醇，适合应用于提高酶活性和稳定 性的化学修饰与新型酶制剂的开发利用等领域。
易水寒江雪敬奉 Thanks
Thanks
第二部分：结果与分析
活化右旋糖苷用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响 ➢ pH 值对右旋糖苷修饰生姜蛋白酶效果的影响
在1.0mL 酶液质量浓度为2.0mg/mL 的硼酸缓冲液中加入84mg 活化 的右旋糖苷，不同pH 值条件对生姜蛋白酶的修饰率和相对酶活力的影响见 表4。
第二部分：结果与分析
➢ pH 值对右旋糖苷修饰生姜蛋白酶效果的影响
生姜及生姜蛋白酶的简介
文章背景知识：
1.天然生姜中蛋白酶的缺点：稳定性差、失活快，限制 了生姜蛋白酶在生产中的推广应用。 2.修饰方法：大分子结合修饰是目前应用最广的酶蛋白 修饰方法之一，对提高酶活力、增强稳定性具有显著效 果。 3.常用的修饰剂：
聚乙二醇：聚乙二醇(PEG)是一种线性、无毒且不带 电的水溶性大分子。
在实验确定的较佳修饰条件下，活化的mPEG 和右旋糖苷对生姜蛋白酶 修饰效果的比较见表5
结论：两种修饰剂对生姜蛋白酶的修饰率接近，均52% 左右； mPEG 修饰酶的残留相对酶活力为54.0%，右旋糖苷修饰酶的活 性是天然酶的3.3 倍，所以右旋糖苷对生姜蛋白酶修饰效果较好 。
第二部分：结果与分析
酶修饰率的测定 酶修饰率的测定：
➢ 过程： 335nm 波长处测定吸光度。同样浓度酶液在修饰反应后 与反应前吸光度之比即为残留氨基量。
➢ 数据处理:
式中：A1 为酶液修饰反应前吸光度； A2 为酶液修饰反应后的吸光度。
毕业论文 生姜中有效成分的提取及测定研究进展 精品
【标题】生姜中有效成分的提取及测定研究进展【作者】朱磊【关键词】生姜姜精油姜辣素姜油树脂提取分析测定【指导老师】贺薇【专业】化学【正文】1、引言姜又名地辛、百辣云，系姜科多年生宿根草本植物的根茎，它既是香料也是医药、食品、化妆、工业的天然原料。
中国是生姜的主要生产国之一，年出口量占世界总出口量的40%，我国中部、东南部至西南部都广为栽培，在河南、山东、湖北、四川等省种植较多，我国生姜产量高，但由于生姜鲜美不耐贮藏等原因，常造成大量损失。
实践证明，如果将生姜加工成姜油，则经济效益可提高3～5倍。
随着食品加工技术的进步，应用现代工艺技术提取生姜制成的姜精油、姜辣素、姜油树脂等深加工产品越来越受到推崇，广泛运用于餐饮、美容、医药等行业，为了满足市场需求，对生姜成分的研究和提取具有重大意义。
姜的现代加工方法主要有水汽蒸馏法、溶剂浸提法、压榨法、超声波法、微波辐射萃取法、液体浸CO2提法和超临界CO2萃取法等。
根据加工方法及所含组分的不同，得到姜精油和姜油树脂两种深加工产品。
姜的化学成分组分分析可分为挥发油组分分析和姜辣素组分分析两部分，目前分析过程中主要采用的方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、气质联用(GC—MS)、顶空固相微萃取等手段，为取得较好的成分分析效果，大都是几种方法配合使用。
因此本文针对生姜中有效成分的提取和测定进行文献综述，希望对研究生姜有效成分新的提取和含量测定方法提供一定的理论依据。
2、生姜有效成分简介生姜营养丰富，含精油、姜辣素和微量矿物元素等，生姜的化学成分复杂，已发现的有100多种，可分为挥发油、姜辣素和二苯基庚烷3大类，另外还含有多种氨基酸、维生素及多种功能性成分。
2.1姜精油姜的挥发油是一种与水不相溶的油状液体，可经水蒸汽蒸馏法获取，其化学成分主要为萜类物质，其中倍半萜类碳水化合物占50%～60%，氧化倍半萜烯类占17%，其他主要是单萜烯类碳水化合物和氧化单萜烯类[1]。
生姜蛋白分离实验报告(3篇)
（1）分离速度快，操作简便；
（2）可去除小分子杂质，提高蛋白质纯度；
（3）保持酶活性，有利于后续应用；
（4）能耗低，符合绿色生产要求。
五、结论
本实验通过超滤膜分离技术成功提取了生姜蛋白酶，结果表明，该技术在生姜蛋白酶提取中具有高效、环保、操作简便等优点。在后续研究中，可进一步优化膜孔径、操作压力等参数，以提高生姜蛋白酶的提取效率和纯度。
二、实验材料与仪器
1. 材料：
- 生姜
- 超滤膜（截留分子量：10,000）
- 生理盐水
- 氨水
- 氢氧化钠
- 氯化钠
- 氯化钾
- 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）
- 蛋白质浓度测定试剂盒
- 生姜蛋白酶活性测定试剂盒
2. 仪器：
- 超滤装置
- 超声波清洗器
- 离心机
- 恒温水浴锅
- 电子天平
- 分光光度计
第1篇
一、实验目的
1. 掌握超滤膜分离技术在生姜蛋白提取中的应用。
2. 了解生姜蛋白酶的性质及其在食品、药品、生物制品等领域的应用。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理
生姜蛋白酶是一种从生姜中提取的蛋白水解活性酶，具有较好的热稳定性和广谱抗菌能力。超滤膜分离技术是一种基于分子大小差异进行物质分离的膜过程，能够在常温下通过半透膜实现溶质与溶剂的分离。在生姜蛋白分离实验中，利用超滤膜分离技术将生姜蛋白酶从生姜汁液中提取分离出来。
- 收集透过液，即为生姜蛋白酶浓缩液。
3. 蛋白质浓度测定：
- 按照蛋白质浓度测定试剂盒说明书，测定生姜蛋白酶浓缩液中的蛋白质浓度。
生姜蛋白酶酶活测定方法的研究
生姜蛋白酶酶活测定方法的研究宋 琦， 许赣荣(江南大学生物工程学院，无锡 214122)摘要： 对生姜蛋白酶的酶活测定方法进行了研究。
鲜姜块与冷缓冲液以 1∶4(w/v )的比例制备匀浆， 过滤后滤液用乙醇沉淀法处理得到粗酶粉；在酪蛋白溶液浓度为 1%，反应温度为 50 ℃，柠檬 酸―磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)浓度为 0.05 mol/L 的条件下反应 4 min ，加 2 mL 三氯乙酸(0.4 m o l/ L )终止反应；用紫外分光光度法测定产物酪氨酸的含量。
在上述条件下，酶活力达到 135 U/m g 蛋白。
该方法 R S D=1.397%，重复性较好，可以作为生姜蛋白酶酶活的检测方法。
关键词： 生姜蛋白酶；紫外分光光度法；酶活测定 中图分类号： O 657.32文献标志码： A文章编号： 1005-9989(2010)01-0277-05A study on the method for evaluating of ginger protease activitySON G Qi, XU Gan-rong(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122)A b s t rac t: The measurement of enzyme activity of protease from Ginger rhizome were investigated in thispaper. Fresh diced ginger was homogenized with 4 part(w/v) cold buffer. The mixture was filtrated and the crude enzyme was prepared by ethanol precipitation of the filtrate. Enzyme activity was assayed using casein (1% in 0.05 mol/L citric acid ―disodiu m hydrogen phosphate buffer, (pH6.0) at 50 ℃ for 4 min. The enzyme ca - talytic reaction was stopped by addition of 2 mL trichloroacetic acid (TCA)(0.4 mol/L), The product tyrosine was assayed using the UV. the protease activity can reach to 135 U/mg protein. The RSD is 1.397%, so the method has a better repeatability, it can be used in the measurement of ginger protease activity.Key words: ginger protease; UV spectrop hotom etry method; enzyme activity assay 生姜蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋 白酶等 之后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构和性 质上与上述蛋白酶有很大的同源性，被认为是木 瓜蛋白酶家族的又一新成员[1]。
生姜蛋白酶的研究进展
从鲜姜中提取的粗酶很快褐变。这一过程可能包 括：在内源多酚氧化酶的作用下，多酚氧化形成醌类化 合物。醌进而可以和氨基、巯基以及生姜蛋白酶中的其 他亲核残基反应，因此导致了酶活性的降低。Ｄ Ｄ Ｔ 和 ＶＣ都是褐变的抑制剂，然而，前者并不能稳定生姜蛋 白酶。显然，对褐变的抑制不能说明ＶＣ稳定生姜蛋白 酶的机理。
又如：２００５年，Ａｄｕｌｙａｔｈａｍ等在研究生姜蛋白酶 的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法［５］： 鲜姜，切片，与４倍（ｗ／ｖ）的冷Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲溶液 （０．０５Ｍ，ｐＨ８）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤 液在５℃，１２０００ｇ的离心机中离心２０ｍｉｎ。上清液，即 生姜蛋白酶，在５℃保存。
用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是 由两个组分（ＧＰ－１、ＧＰ－２）构成的，除电泳迁移率外， 两个组分在其他方面基本相同；用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００测得 两个组分的分子量均为２２５００，ｐＩ为７．０和８．０，纯酶结晶 为六面体。１９７８年Ｏｈｔｓｕｋｉ、ｋｏｚｏ等人用Ｐ－１００生物胶过滤 对该酶进行纯化，得出该酶分子量为２９０００。１９９５年，赵 帜平等［７］以安徽舒城的生姜为原料，采用ＤＥＡＥ－纤维 素ＤＥ－５２和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化得两个组分，等电点分别 为７．０和８．０，用苯酚－硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖 肽键型均为非Ｏ－型。同年，Ｏｈｔｓｕｋｉ再次发表论文［８］， 报道了用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化该酶，用 等电聚焦电泳将该酶分为三个组分，ｐＩ值分别为４．５、４． ６和４．８，并用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＴＳＫＧ２０００ＳＷ 凝胶过滤再次证明该酶分子量为２９０００。２００２年，代景 泉［９］以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶 进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质， 并用ＤＥＡＥ－纤维素ＤＥ－５２对该酶进行纯化，将该酶分为 两个组分，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳得出其分子量分 别为４７０００左右和１４０００左右。 ２．２ 分子结构
生姜蛋白酶提取设备主要步骤
生姜蛋白酶提取设备主要步骤
生姜蛋白酶是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等属于丝氨酸家族蛋白酶，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键。
目前生姜蛋白酶提取的方法主要有两种：一种是反胶束萃取法，另一种是以生姜丙酮干粉为原料的制备方法。
两种方法各有特点，现分别介绍如下。
反胶束萃取纯化生姜蛋白酶工艺，以阴离子反胶束从粗酶提取液中进行分离纯化生姜蛋白酶，其主要优点是选择性较高，可在室温下进行处理，反胶束经处理后可再次回用。
生姜蛋白酶分离提取设备主要步骤
①粉碎、提取称取Ikg采摘3天以内的新鲜生姜块茎，切成约
1cm*1cm小块，加入4L温度为4℃、pH值为6.0的0.2mol/L磷酸缓冲液，置于高速组织匀浆机中粉碎，8层纱布过滤。
收集滤液，滤渣再次用6L上述缓冲液分两次进行匀浆粉碎处理，同法过滤，弃滤渣，合井滤液。
②盐析将收集的滤液用离心机以4000r/min的转速离心10min，收集上清液，加入饱和硫酸按溶液进行盐析，使上清液中的硫酸钱终饱和度达到60%时止。
③脱盐将盐析液用离心机以4000r/min转速离心15min，收集不溶物用少量pH7.50的柠檬酸缓冲液溶解，在4℃下对同种缓冲液透析脱盐8h，获得粗生姜蛋白酶提取液。
④萃取除杂取1L粗生姜蛋白酶提取液，加入等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液，用电动搅拌器以2OOr/min搅拌萃取5min，以除去提取液中的部分杂蛋白。
4000r/min离心10min，收集萃余液，再次用等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液同法萃取及分离。
测定生姜蛋白酶活性的新方法
０ １． ８ ４１ 文 献 标 识 码 Ａ 中 图分 类 号
Ａ ｗ ｅｈ ｄ ｆ ｒ Ｄｅ ｅ ｔ ｇ Ｇｉ ｇ ｒ Ｐｒ ｔ ａ ｅ Ａｃ ｉ ｉ Ｎｅ Ｍ ｔ ｏ ｏ ｔ ｃ ｉ ｎ ｅ ｏ ｅ ｓ ｔｖ ｔ ｎ ｙ
ＹＵ Ｊｅ ｉ，ＸＩ Ａ０ ｈ ｏ ｉ ＡＮＧ ｈｘａ ｇ ＨＥＮＧ ａ ｈ ｉ Ｃ ａ ｎ，Ｗ Ｓ ｉｉｎ ，Ｚ Ｘｉｏ ｕ
种 新 型 水解 蛋 白质 的催 化 剂 ．能 特异 地 水 解 Ｐ ２位
脯 氨 酸 的肽键 ．其 活性 中心含 有 丝氨 酸 ．与 木瓜蛋
余 含量 来表 达 生姜 蛋 白酶 的活性 ．此过 程需 加盐 酸
Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｇｉ ｇ ｒ ｒ ｔａ ｅ Ｉ ａ ｔ ａｅ ｈ ｅ ｚ ｍｅ ｙ ｅ ｔ ｇ Ｒｅ ｅｅ ｃ ； Ｄｅｅ ｍｉ ａ ｉｎ ｆ ｎ ｙ ａ ｔｖｔ； ｙ ｒｓ ｎ ｅ ｐ ｏｅ ｓ ； ｎ ｃｉ ｔ ｔ ｅ ｎ ｙ ｂ ｈ ａｉ ； ｖ ｎ ｆｒ ｎ ｅ ｔｒ ｎ ｔ ｏ ｅ ｚ ｍｅ ｃｉｉ ｏ ｙ Ｃ ｏ ｓ ｉ ｒｌ ａ ｔ ｂ ｕ ｏ ｏ ｉ ｔ ｅ ｍｅｈ ｄ ｏ ｍａ ｓｅ ｂ ｌ ｎ ｌ ｅ ｃ ｌ ｒ ｉ ｉ ｍｅｒ ｔ ｏ ． ｉ
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术申报奖种：山东省科学技术进步奖项目简介：本项目是在多个“生姜蛋白酶”课题资助的基础上,由山东省科技攻关项目、山东省自然科学基金资助的研究成果,利用我省特色生姜资源进行生姜蛋白酶的提纯、固定化、应用研究,拥有自主知识产权,达到国内领先水平;包括以下主要内容：1生姜蛋白酶的提取纯化技术：确定了生姜蛋白酶的最佳提取、纯化配套方案为无水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻层析SEC纯化和Cellulose DE-52与Sepharose DE-52两种离子交换层析IEC联合纯化法;以姜汁酶活力为基准,SEC纯化倍数达到倍,是粗酶的倍;并确定了生姜蛋白酶由两个等电点不同的组分组成,且都是酸性蛋白质;2双水相萃取法：确定了生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和浓度、硫酸铵和NaCl电解质的最佳浓度以及双水相的配比和最佳pH,确定了第二、三步硫酸铵盐溶液的添加量和浓度;第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为,酶活力回收率为%,上相酶纯化倍数为,酶的得率为%；第二步分别为, %, , %；第三步为,%,,%;3确定了乳化-交联法制备活性壳聚糖微球的最佳制备条件,及以其为载体采用吸附-交联法固定生姜蛋白酶的最佳固定化条件,所得固定化酶的酶活力为g,酶活回收率达到了%;同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质差异;4研究了生姜蛋白酶对肉类嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为%,pH为,预处理温度为50℃,预处理时间是2h,嫩化效果显著;并通过测定牛肉肌纤维的小片化指数和牛肉肌纤维直径、全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等牛肉超微结构的变化,推断其嫩化机理可能是：生姜蛋白酶将牛肉肌纤维软化、分解,使牛肉肌纤维直径减小,促进牛肉肌纤维的小片化,同时促进了牛肉蛋白质降解成更小的物质,使牛肉成分整体上分解为更细、更小的成分,使其食用时变得细嫩、松软,从而达到嫩化的效果;5收集到全国38种不同品种的生姜,比较了不同品种生姜中蛋白酶含量差异,发现不同品种生姜中蛋白酶含量从黄山老姜到丹东姜,差异很大,从而分析出了国内外专家学者关于生姜蛋白酶的许多分歧点的可能原因是不同品种间的差异,这是造成生姜中蛋白酶含量差异较大的主要原因,远远高于不同提取方法造成的生姜蛋白酶含量差异;授权专利情况：专利“生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法”已经授权;应用推广情况：生姜蛋白酶可广泛应用于食品、药品、纺织等领域,投资少,前景广阔,尤其发达国家,如欧美市场有大量需求;该项目已经在山东莱芜东兴源食品有限公司、山东日照赛普食品有限公司等4家单位进行了生产,三年新增利润万元,这主要是因为市场上该类产品很少,满足不了市场需求,价格昂贵,利润丰厚;我单位与日照赛普食品科技有限公司于2010年正式合作,通过国家农业成果转化项目2011GB2C600022进行该成果的推广和大规模、专业化生产；2011年与山东莱芜东兴源食品有限公司合作,成功启动了国家科技支撑计划子课题“生姜功能成分高效分离关键技术研究与功能食品开发”;全部完成人排序及对项目的贡献和工作量全部完成人排序：唐晓珍、张平平、王玉民、位思清、姜媛、乔旭光、马明、赵冬艳、申江涛全部完成人对项目的贡献和工作量：唐晓珍负责项目的申报书撰写,实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,对项目各项创新都做出了不同的贡献,对本项目各项创新的具体贡献分别是1有4篇通讯作者的文章；2有1项第一位发明专利和2篇通讯作者的文章；4有2篇第一位、2篇通讯作者的文章；3、5是相关研究生论文的导师;投入的工作量占本人工作总量的80%左右;张平平参与完成了创新1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的酶学性质的整个研究的实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;王玉民：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;位思清：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验;负责整个项目的设备选型、维修,数据处理以及38种生姜中姜酶含量差异试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;姜媛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的资料收集、查新、数据处理以及部分生姜蛋白酶的固定化技术试验的实施,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;乔旭光：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的实验设计与技术路线,负责整个项目的组织实施和生姜蛋白酶的固定化技术路线和试验方案的设计和工作报告的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;马明：参与完成了创新点1、2、3、4、5的各种实验指标测试,重点参与了创新点538种生姜的收集、调研以及提取试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;赵冬艳：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责生姜蛋白酶固定化的实验内容、技术路线、实验方案的设计及其各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的40%;申江涛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责整个项目技术在其单位推广方案设计,组织生产的实施；推广技术在其单位应用效果的统计和经济效果的核算以及相关资料的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%;全部完成单位及排序：山东农业大学、日照赛普食品科技有限公司五、推广应用情况、经济效益和社会效益。
不同的处理方法制取姜汁对生姜蛋白酶的影响
２１ 不 同提取方法对姜汁 中蛋 白酶的影响 ． 闪式提取法 、 重力压 榨提取法和超声波辅助 重力
压榨提取法对姜汁 中蛋 白酶的影 响见表 １ 。
表 １ 不 同 提取 方 法对 姜 汁 中 蛋 白酶 的影 响
Ｔａ ｅ １ Ｔｈ ｎｆｕ ｎｃ ｆｇ ｎｇ ｒ ｐｒ ｔａｓ ｔ ｆｅ ｅ ｔ ｂｌ ｅ ｉ ｌ ｅ ｅ ｏ ｉ ｅ ｏ ｅ ｅ ｗｉｈ ｄｉ ｒ ｎ ｅ ｔ ａ ｔｏ ｅ ｏ ｘ ｒ ｃ ｉ ｎ ｍ ￣ ｄｓ
１ ． 考马思亮蓝 Ｇ ２ ０法测定生姜蛋白酶提取率［ ．１ ２ －５ ４ １ 以牛血清 白蛋 白为标准品，用 ０１ ｏＬ ａ １ ． ｍ ｂ Ｃ 溶解 ５ Ｎ
７ ６
第卷 第期
３ １ ９
０’
食品 瓦 研究与开发 明 耵＾司丌
基研 础究
并配置不同浓度的牛血清白蛋白标准品溶液 ，分别加入
限公 司 ； 蒸馏 水 ： 自制 。 Ｓ ｅｔ ｍ ａ ５ ｓ ｐｃ ｕ ｌｂ ５ 紫外可见分光光度计 ： ｒ ７ 上海棱光 技术 有限公 司 ； Ａ ＮＪ — Ｆ — ／ Ｎ电子 天平 ：上海民桥精密 Ａ 科学 仪器有限公司 ； 数显恒温水浴锅 ： 城西晓 阳电子仪 器厂 ； Ｅ ５ Ａ闪式提取器 ： Ｊ ＨＢ 一 ０ 北京 金鼎科技发展 有限
ｌ＝ Ａｘ Ｂ） ｘ１０％ ，（ Ｎｘ ／ ０ Ｃ （） １
１ 试验方法 ． ３
取相 同质量 的新鲜 老姜 ３份 ， 洗净 、 片 ， 入适 切 加 量 纯水 ， 别采用 闪式提取 法 、 分 重力压 榨提 取法 和超 声波辅助重力压榨提取法提取姜汁。改变超声波助提 取时 的料液 比（ 质量 比） 声时间和超声功率 ， 行单 、 超 进 因素试验 ，将不 同方法得到的姜汁按 １ 所述 分析方 ． ２
生姜蛋白酶超滤法提取工艺及其在食品工业中的应用
1 材料和方法
111 主要材料 生姜: 优质莱芜大黄姜; 里脊肉: 市场购
升高, 猪肉的最大平均剪切力逐渐增大, 说明
肉的嫩度逐渐降低。这是因为高温处理时,
酶活力降低, 对肉的嫩化作用也随之降低; 而
且, 高温也会使肉类老化。
表 5 预处理温度的影响
预处理温度/ e 最大剪切力平均值/ N#cm- 2
20 11. 24
30 10. 31
40 13. 00
50 13. 13
蛋白质含量/ Lg#mL- 1 澄清度 T 660 A 430 色度( EBC)
0 377. 330
821 6 01 351 101 613
01 05 388. 643
891 5 01337 101 142
01 5 399. 201
821 7 01 350 101 579
5 392. 413
881 1 01 341 101 512
黄姜 y 洗净 y 压榨 y 汁液 离心( 3 000r/ min, 20 min) y 滤液 y 离心 y 超滤 y 滤后酶浆 y 真空冷 冻干 燥( - 20e 冻藏) y 生姜蛋白酶粉[ 8] 。
0. 05 M Pa 常温下提取得率为 2. 3% 。 11412 生 姜 蛋 白 酶 嫩 化 猪 肉 的 试 验 方 法[ 11]
27
生
食品与发酵工业 Food and F er mentation I ndustries Vol1 28 No1 12
多种生姜有效成分联合提取工艺
多种生姜有效成分联合提取工艺高晓东;王秋英;乔旭光;李锋;唐晓珍【摘要】为了研究生姜中有效成分姜辣素、姜黄素以及生姜蛋白酶同步提取的方法,文中使用乙醇溶剂法结合旋蒸确定了生姜中3种有效成分同步提取的工艺条件,即生姜与无水乙醇料液比1∶3(g∶ mL),生姜蛋白酶提取中缓冲液pH值为6.5,冰浴时间7h;姜辣素、姜黄素旋转蒸发最佳温度为60℃,转速为16 r/min.在此优化条件下,生姜中姜辣素、姜黄素的提取率分别为0.3143％、0.3889％;生姜蛋白酶的得率为1.376％,比活力达到4 465 U/mg.此工艺能够同步提取姜辣素、姜黄素以及生姜蛋白酶3种有效成分,减少了原材料的消耗,降低生产成本,更适合产业化生产.%In order to study the effective extraction of ginger oleoresin, ginger protease and curcumin simultaneous extraction, ethanol solvent combined with rotary evaporation was studied. The ratio of ginger and ethanol liquid ratio was 1: 3 g: mL) , extraction buffer pH 6. 5 , ice bath time 7h; for the ginger oleoresin and curcumin rotary evaporation, the optimum temperature was 60℃ , the rotating speed was 16 r/min. Under the above optimized conditions, gingerol in ginger, curcumin extraction rate was 0. 314 3% and 0. 388 9% ; ginger protease ratio was 1. 376% , specific enzymatic activity reached to 4 465 U/mg. This process can simultaneously extract gingerol, curcumin and ginger protease three effective components, reduce the consumption of raw materials, the production cost, and therefore more suitable for industrial production.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)001【总页数】5页(P203-207)【关键词】生姜;有效成分;生姜蛋白酶;姜黄素;姜辣素;联合提取【作者】高晓东;王秋英;乔旭光;李锋;唐晓珍【作者单位】山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安,271018【正文语种】中文生姜是我国的传统优势和特色资源之一，在国际市场上占有非常重要的地位。
生姜蛋白酶 的实验方案
生料酿酒工艺一、实验目的1、初步了解和掌握生料酿酒工艺的基本流程；2、掌握生料酿酒的基本方和注意事项；3、熟练发酵工程中涉及的一些基本技术、基本方法。
二、实验原理酿酒是一个典型的发酵过程。
生料酿酒严格说来其工艺只有三道: 原料粉碎、发酵、蒸馏，即生料酿酒工艺流程：生料+曲→发酵→蒸馏→成品酒。
采用生料酿酒最大的特点是酿酒原料不用浸泡和淘洗,不用燃料蒸煮就直接进入发酵工艺。
主要以大米为原料，加入糖化酶、活性干酵母、生香酵母进行发酵，发酵过程中通过检测酒精度、糖度、总酸度来监控发酵过程，发酵完毕进行感官检查（看一看、闻一闻、尝一尝）、蒸馏、成品检验（酒精度、总酯含量、甲醇含量等）。
三、实验器材1、材料：大米、糖化酶、酒曲（由耐高温活性干酵母、麸皮酵母、生香活性干酵母、根霉曲配置）2、器材设备：发酵容器一个、夹套水浴蒸汽蒸酒锅、精密酸度计、酒精表等3、试剂：实验室常规试剂四、实验方法1、投料1.1、容器消毒：发酵器具包括发酵中所有仪器等在酿酒前应用高锰酸钾溶液石灰溶液进行消毒并清洗干净以防杂菌侵染1.2、调浆：称取大米1000g，加入发酵罐容器冷水3000ml，水应符合饮用水标准不带碱性井水或自来水均可。
加酒曲量：按100 公斤粮食加生料曲0.7公斤，即称取酒曲7g放入发酵罐内使用的酒曲应在保质期内不得用霉变回潮过期的酒曲。
其中发酵剂最佳配方为：糖化酶73%，淀粉酶10% ，蛋白酶4%，纤维素酶5%，耐高温活性干酵母8% 。
调浆时要注意将粮食酒曲与水搅拌均匀（搅拌一定要抄底不留死角），再加盖密封或用塑料薄膜将缸口封严。
往发酵容器内加曲时应先测量容器内的水温水温在度之30-36℃间为佳不能凭手感觉估测以防水温过高将酒曲种烫死引起不发酵或发酵不佳甚至产生酸败。
2、发酵2.1 温度控制：控制室温25~ 35℃, 品温28~ 35℃为宜。
装料系数80%左右,发酵做到前缓、中挺、后缓落。
夏季加强通风降温; 冬季做好保温工作, 发酵室内可用蒸汽、电热、燃煤等方法保温, 也可以在发酵容器四周用保温材料如谷壳等保温,因发酵本身是一个放热过程。
项目名称生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术申报奖种：山东省科学技术进步奖项目简介：本项目是在多个“生姜蛋白酶”课题资助的基础上，由山东省科技攻关项目、山东省自然科学基金资助的研究成果，利用我省特色生姜资源进行生姜蛋白酶的提纯、固定化、应用研究，拥有自主知识产权，达到国内领先水平。
包括以下主要内容：（1）生姜蛋白酶的提取纯化技术：确定了生姜蛋白酶的最佳提取、纯化配套方案为无水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻层析（SEC）纯化和Cellulose DE-52与Sepharose DE-52两种离子交换层析（IEC）联合纯化法。
以姜汁酶活力为基准，SEC纯化倍数达到4.19倍，是粗酶的2.11倍。
并确定了生姜蛋白酶由两个等电点不同的组分组成，且都是酸性蛋白质。
（2）双水相萃取法：确定了生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和浓度、硫酸铵和NaCl电解质的最佳浓度以及双水相的配比和最佳pH，确定了第二、三步硫酸铵盐溶液的添加量和浓度。
第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为 6.17，酶活力回收率为393.77%，上相酶纯化倍数为1.85，酶的得率为1.20%；第二步分别为8.03，131.26%，2.81，1.07%；第三步为2.04，80.63%，2.91，0.72%。
（3）确定了乳化-交联法制备活性壳聚糖微球的最佳制备条件，及以其为载体采用吸附-交联法固定生姜蛋白酶的最佳固定化条件，所得固定化酶的酶活力为672.6U/g，酶活回收率达到了69.3%。
同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质差异。
（4）研究了生姜蛋白酶对肉类嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为0.06%，pH为7.0，预处理温度为50℃，预处理时间是2h，嫩化效果显着。
并通过测定牛肉肌纤维的小片化指数和牛肉肌纤维直径、全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等牛肉超微结构的变化，推断其嫩化机理可能是：生姜蛋白酶将牛肉肌纤维软化、分解，使牛肉肌纤维直径减小，促进牛肉肌纤维的小片化，同时促进了牛肉蛋白质降解成更小的物质，使牛肉成分整体上分解为更细、更小的成分，使其食用时变得细嫩、松软，从而达到嫩化的效果。
生姜提取蛋白酶
实验二生姜中蛋白酶的提取与分离一、实验目的1、初步了解和掌握蛋白质含量测定的原理和方法2、掌握蛋白酶活力的测定的方法与步骤3、熟练蛋白酶的提取与分离的基本方法和基本技术4、学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作二、实验原理生姜(ZingiberofcineiRoscoe)属姜科姜属植物，是一种重要的药食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同源的保健品。
目前，在食品中开发利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等。
生姜蛋白酶是有待开发利用的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁凝乳、蛋白质水解等方面，开展生姜蛋白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状。
生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取法如丙酮，盐析沉淀法，如硫酸铵沉淀。
这些方法具有提取纯度高的优点，但大都以丙酮粉为酶源，而丙酮粉的制备操作繁琐，消耗大量丙酮，成本高，效率低。
因此，近几年逐步研究了一些新的提取方法。
这些新的方法主要有乙醇沉淀法等。
超滤法具有操作简单，成本低，效率高，无污染，无有害物质残留等特点，非常适合工业化生产。
本研究采用磷酸盐缓冲液(pH6.0)提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析，可获得高酶活的生姜蛋白酶，该工艺具有操作简便、成本低、易于产业化等优点，为该酶的工业化生产开辟了一条可能的新途径。
基本工艺流程设计：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤（常温，工作压力）→取浓汁→加入乙醇→离心→取沉淀→用缓冲液溶解→离心取上清液加入硫酸铵至40%饱和度→低温静置24小时→离心→取上清→加入硫酸铵至70%饱和度→低温静置24小时→离心→取沉淀→缓冲液溶解→透析→浓缩干燥→部分纯化的生姜蛋白酶粉。
三、材料和试剂1、材料生姜，酪蛋白，考马斯亮蓝G-250，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，无水碳酸钠、碳酸氢钠，柠檬酸，硫酸铵、丙酮，酪氨酸，氯化钠，硫酸铵，乙醇，三氯乙酸等2.仪器紫外分光光度计，离心机、恒温水浴锅，匀浆机（榨汁机），分析电子天平，真空干燥机四、溶液的配制（补充步骤）1、0．01％(w／v)考马斯亮蓝G-250溶液将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％乙醇中，加入85％正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。
生姜蛋白酶的分离纯化及其糖肽键型的初步研究
生姜蛋白酶的分离纯化及其糖肽键型的初步研究
赵帜平;周恩志
【期刊名称】《安徽大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】1995(019)002
【摘要】本文报导以生姜为材料，冷丙酮脱脂脱色后，用０．１ｍｏｌ／ＬＰＨ
６的磷酸缓冲液提取、硫酸铵盐析，经ＤＥＡＥ－纤维素ＤＥ－５２和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５纯化，得生姜蛋白酶两个组份ＺＥ１和ＺＥ２。
它们经凝胶等电聚焦电泳，均为单一的蛋白带，ＰＩ值分别为７．０和８．０。
苯酚－硫酸法鉴定，其均为糖蛋白，β－消去反应表明：ＺＥ１和ＺＥ２中的糖肽键型均为非０－型糖肽键。
【总页数】5页(P93-97)
【作者】赵帜平;周恩志
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S632.501
【相关文献】
1.生姜蛋白酶的分离纯化 [J], 代景泉;黄雪松
2.生姜蛋白酶的分离纯化及其酶学性质初步研究 [J], 游庆红;尹秀莲
3.LS1型科研型超滤机制备生姜蛋白酶的研究 [J], 唐晓珍;位思清;李大鹏;代景全;
孙淑静
4.生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究 [J], 蔡海燕;周小华
5.生姜蛋白酶的分离纯化 [J],
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蛋白酶活力的计算：
蛋白酶活力单位【U】= OD595nm * K * N
K--100除以络氨酸标准曲线上100mg/ml对应的OD595nm值
N--酶液稀释倍数
实验过程
（1）制作标准曲线
取7支试管，依次分别加入0.0、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50mL的牛 血清蛋白溶液，用水补足到0.5mL，每管再加5mL染色液，立即摇匀，置于室温 下5min，然后测定在波长595nm下的吸光度，并绘制标准曲线。 吸取0.5ml样品提取液于试管中，加入5ml考马斯亮蓝G250染色液，充分混匀， 静置5min，测量吸光度（OD595nm），记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度 X（μg/ml)
低分子量标准蛋白质液的组成
蛋白质
兔磷酸化酶B 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛磷酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶
分子量
97400 66200 43000 31000 20100 14400
2、分离胶的制备 （1）安装电泳槽 （2）凝胶的制备（先配置分离胶，再配置浓缩胶） （3）灌胶 （4）样品处理 待测蛋白质样品处理：获得的蛋白质样品 50μl,再加入2x 样品缓冲液50μl混匀，在100℃水浴中煮沸5min。
（5）加样 待样品冷却后，用微量进样器吸取30-40μl样品白酶活力的定义：在一定温度（ 40℃）下，每分钟分解
酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。
实验方法：1.0ml蛋白酶液与1.0ml0.5%酪蛋白混合，40℃水浴 保温10min，加入2.0ml0.4mol/l三氯乙酸终止反应，静置10min 后过滤。取0.5ml滤液与5.0ml考马斯亮蓝充分混匀，静置5min， 在595nm处，以对照调消光度0，测量样品吸光度。
课题一、生姜蛋白酶的提取与分离纯化 课题二、生姜蛋白酶活力的测定
课题三、生姜蛋白酶含量的测定
课题四、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定蛋白酶分子量
材料：生姜
试剂：0.01%考马斯亮蓝G-250溶液、标准蛋白质溶液、0.5%酪蛋白 溶液、 0.2mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液、 0.05mol/L pH6.0 的磷酸盐 缓冲液、1N HCl、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶丙胶贮液、 浓缩胶丙胶贮液、过硫酸铵溶液、核黄素溶液、电极缓冲液、 40% 蔗糖、pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%溴酚蓝
样品沉降在凝胶面上。
（6）电泳 （7）剥胶 （8）染色以及脱色 取下电泳后的凝胶板，放入染色液中染色1h，倒回染色液，加入脱色
液，脱液4-8h，其间更换脱色液3-4次。将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中
或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。
3、蛋白质分子量计算 电泳迁移率的计算
相对迁移率（MR) = (蛋白质样品移动距离/脱色后胶长） X（染色 前胶长/指示剂移动距离）
实验过程
（1）生姜蛋白酶提取液的制备 取外形完好无损伤，富含纤维的生姜50g，切成小块， 按料液比 1:2 加入磷酸缓冲液，研磨匀浆 30min ，所得 浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液洗涤后， 收集滤液4℃静置2h，离心去沉淀，上清液用磷酸缓冲 液定容至100mL，4℃冰箱贮存待用。
（2）生姜蛋白酶的纯化 丙酮沉淀→盐析→透析 丙酮沉淀：取生姜蛋白酶溶液 20mL ，加入 1.5 倍的 4℃ 预冷丙酮进行沉 淀，沉淀完全后，4℃静置2h，冷冻离心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。 盐析：沉淀用磷酸缓冲液溶解，用四层纱布过滤，滤液再离心 30min, 取上清液缓慢加入 1.2 倍的冷丙酮酸轻轻搅拌 5min ，离心，取沉淀溶于 Ph6.0 的缓冲液中，缓慢加入硫酸铵至 40% 饱和度，低温静置 24h ，离心， 上清液中继续加入硫酸铵至60%饱和度，低温静置24h，离心取沉淀。 透析：沉淀溶于0.01mol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液中，采用截留分子量 14000U 的透析袋进行 4℃ 透析，直至 1% 氯化钡检查无白色沉淀为止。浓缩 干燥得粗酶粉。
从溶液中分离纯化可溶性蛋白质的主流方法包括：
等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电
荷相等 )，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减 弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀
仪器：研钵、透析袋、垂直板电泳装置、分光光度计、离心机、恒 温水浴锅、匀浆机、分析天平、稳流稳压电泳仪
生姜属姜科姜属植物，是一种重要的药 食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同 源的保健品。目前，在食品中开发利用 的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待开发利用 的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁 凝乳、蛋白质水解等方面。开发生姜蛋 白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶 资源长期依赖木瓜、菠萝等少数热带水 果资源的现状。
物，从而有利于悬浮液的过滤。
盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 透析：是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的
一种分离纯化技术。
生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取方法如丙酮、盐析沉淀法、硫酸铵沉 淀法。本研究中采用磷酸盐缓冲液（Ph6.0）提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析，可获得高酶活的 生姜蛋白酶，而且操作简单，成本低，易于产业化。
（2）生姜蛋白酶含量的测定
（3）生姜蛋白酶含量计算
生姜蛋白酶含量（μg/ml）= ［ X*提取液的总体积］ /
样品鲜重（g)
实验过程
1、试剂的配置
①30%分离胶贮液；②10%浓缩胶贮液；③分离胶缓冲液 ④浓缩胶缓冲液；⑤电泳缓冲液；⑥20%过硫酸铵溶液 ⑦1%TEMED；⑧0.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液 ⑨1mol/L HCl；⑩10%SDS；⑪样品溶解液 ⑫染色液；⑬脱色液