菠萝蛋白酶的制备及活力测定

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菠萝蛋白酶的提取实验报告

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。

关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。

其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。

本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。

1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件

菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。
本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
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0.140 0.582 （稀释5倍）
中国药科大学生化设计性实验报告
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参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图
根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量
中国药科大学生化设计性实验报告
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参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
（三）菠萝蛋白酶活力的测定
2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528% （五）结果讨论
从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：
1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷杨洋刘杨
何威刘鄂龙
中国药科大学生化设计性实验报告
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参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶； 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验； 3、学习酶比活力的计算；

菠萝蛋白酶的提取和活力测定

三、实验材料和试剂
1、实验材料
新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、实验试剂柠檬酸钠维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 PH至7.0）激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁冻存备用
菠萝汁
纱布过滤
酶复合物沉淀
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作按下表操作
试管号标准蛋白（0.1mg/ml) 1 0 0 1.0 4 0 2 0.1 0 0.9 4 0.115 3 0.2 0 0.8 4 0.148 4 0.4 0 0.6 4 0.245 5 0.6 0 0.4 4 0.395 6 0.8 0 0.2 4 0.525 7 1.0 0 0 4 8 0 1.0 0 4
离心
澄清液
2000r/min，7min离心加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
上清液沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心
钠加溶适液量，
1.5% 氯化
酶复合物

菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定

2、测酶活试剂（1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml）酶液（ml）激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯酶活（U）酶活（U）平均值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3

菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定

试管号 1 1%酪蛋白（ml) 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.7 5 0.8
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影响。需要多次实验确定所加的量，避免反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中，可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain），从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方法

菠萝蛋白酶的制备及其活力测定

1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。

2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。

3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。

1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。

4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。

0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。

0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。

5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。

0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。

】扩大10倍体积。

6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。

激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。

】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。

1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。

也可以用6mol的稀释。

器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。

菠萝蛋白酶的提取分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定１5食安(1)班张凯摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法与透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度得菠萝皮经两种不同得纯化方法处理,菠萝皮中得蛋白酶都能被有效纯化,但就是蛋白酶活性会损失一部分、关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性;前言菠萝蛋白酶(bromelａｉｎ)就是从菠萝植株中提取得一类蛋白水解酶得总称,主要存在于菠萝茎与果实中,根据提取部位得不同,分为茎菠萝蛋白酶与果菠萝蛋白酶。

Mａrcaｎo于18９1年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶、随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药与化工领域有很好得利用价值。

1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。

目前,菠萝蛋白酶得一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域、随着提取纯化技术得不断进步,高活性得菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工与食品领域。

[１］利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶得获取途径与应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境得污染;随着市场对菠萝加工产品需求量得增大,对于菠萝皮得研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要得功能成分蛋白酶得分离、纯化与性质得研究更有意义、[２]本文通过对菠萝皮蛋白酶得提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性得影响因素,并解决实验存在得一些问题、1实验材料与仪器１、1实验材料与试剂新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量８00０~１４０00),0。

１mo1／ＬpH 7.8磷酸缓冲液配制(ＰBS),0.0１mｏ1/L pH 7。

８磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mｍo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mｍo１/L EDTA—Na2(乙二胺四乙酸二钠)],10%三氯乙酸(TCＡ)。

1、2实验仪器７2２型可见光分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;７52型光栅分光光度计:北京光学仪器厂;TＤL－６0B台式离心机:上海安宁科学仪器厂;D5Ｍ离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;DK-８Ｄ电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;可控硅恒温水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司;AMPUT电子天平:深圳安普特科技有限公司;BS１１０S分析天平北京赛多利斯天平有限公司;ＤS—１型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;HZS-H型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

菠萝中提取菠萝蛋白酶

四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤实验操作方法法和步
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁冻存备用
菠萝汁
5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。 6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。
三、实验材料和试剂 1、实验材料、新鲜菠萝、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂、维生素c 0.1%EDTA溶液柠檬酸钠维生素单宁溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化氯化钠溶液酪蛋白溶液氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调磷酸缓冲液（磷酸缓冲液溶解磷酸二氢钾， PH至7.0）至）激活剂（磷酸缓冲液，激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含，磷酸缓冲液内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）现配现用）硫代硫酸钠和现配现用
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷杨洋刘杨何威刘鄂龙
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验 3、学习酶比活力的计算
二、实验基本原理
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（1）班杨泽杰摘要：本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。

实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。

关键词：菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。

菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000，等电点 9.55，最适pH 在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。

菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。

金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

1 实验材料与仪器1.1实验材料与试剂1.1.1 实验材料新鲜菠萝（3个），透析袋1.1.2 实验试剂（1）盐析粗提液0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL）（2）酶活力测定试剂1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)] ，10％三氯乙酸(TCA) 1.2实验仪器和用品1.2.1实验仪器HJ-6多头磁力搅拌器：常州国华电器有限公司MC-H18S012多功能红外炉：广东美的生活电器制造有限公司DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂GKC110R2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表有限公司TD5M低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司UV5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司PL1502-S电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司BCD-539WT冰箱：青岛海尔股份有限公司1.2.2实验用品（1）以组为单位的用品大试管18mm×200 mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2， 200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。

菠萝蛋白酶的提取与活力测定

上清液沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯化钠溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最佳提取条件。
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计算酶的比活性 • 酶的比活性 • （F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew×0.116×10） • E275——275nm处得吸光度 • Ew——每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg • 0.116——275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨酸/10ml）的吸光度 • 10——反应时间，min
•
温度范围： 50～60℃
•
作用PH值: 6.0～9.0
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三、实验材料和试剂 1、实验材料
新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂柠檬酸钠维生素C 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA2Na,现配现用）
工艺流程：菠萝下脚料→压榨→汁液→去杂质→澄清液→超滤浓缩→浓缩液→降温→加有机溶
剂沉淀（ 95%乙醇）→湿酶→减压干燥→酶制品
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谢谢观赏
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二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用

菠萝蛋白酶活力的测定

菠萝蛋白酶活力的测定•碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应，利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。

•（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现不同深浅的蓝色）1、实验材料（1）实验器材榨汁机、电热恒温水浴锅、分析天平、紫外分光光度计等。

（2）实验试剂1）对照样品溶液：酪氨酸溶液0.05g/L，用0.1mol/LHCl溶液配制。

2）菠萝汁：市售菠萝压榨后过滤即得。

3）菠萝汁稀释液：称取L-半胱氨酸盐酸0.53g，EDTA0.22g，分别兑少量溶解后，混合，用NaOH(0.1mol/L)调pH至4.5，加水至100mL（新鲜配制）。

4 ）底物溶液：精确称取酪蛋白0.6g ，加Na2HPO4溶液（0.005mol/L ）80mL ，用1mol/L 盐酸调pH 至7.0 ，加水至100mL （新鲜配制）。

5 ）三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸溶液1.80g ，醋酸钠2.99g ，加水少量使溶解，加冰醋酸1.98mL ，加水稀释至100mL 。

2、操作步骤（1）供试溶液的配制将菠萝切碎，置于榨汁机中榨汁，用4层纱布过滤，弃初滤液，取滤后菠萝汁10mL，加菠萝汁稀释液10mL，放置15min，制成供测试用液。

（2）供试液酶解后吸光度值的测定取上述供试液1mL，置带塞试管中，于37℃预热10min后，迅速加入已经37℃预热10min的底物溶液5mL，加入起准确计时反应10min，立即加入三氯醋酸5mL终止反应，混合后过滤，滤液在275mn处以水作参照，测吸光度A。

（3 ）空白试验取上述供试液1mL ，置带塞试管中，于37 ℃预热10min 后，迅速加入已经37 ℃预热10min 的三氯醋酸5mL ，加入起准确计时反应10min ，立即加入底物溶液5mL 终止反应，混合后过滤，滤液在275nm 处以水作参照，测吸光度A0。

菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定

ABCD
2. 配置反应液
将底物和缓冲液混合，加入适量的酶液，调整反应体系。
4. 数据处理
根据测定的数据，计算酶活力并进行分析。
结果与分析
结果表示
以表格或图表形式表示测定的吸光度或荧光强度变化，以及计算得到的酶活力数据。
结果分析
根据实验结果，分析菠萝蛋白酶的活性水平，比较不同条件下酶活力的变化，探讨影响酶活性的因素。
白酶的粗品。
பைடு நூலகம்
结果与分析
结果
通过上述实验步骤，成功制备出菠萝蛋白酶的粗品。
分析
通过对实验结果的分析，可以得出制备菠萝蛋白酶的最佳条件和参数，为后续的酶活力测定和酶学性质研究提供基础。
03
菠萝蛋白酶活力的测定
测定方法
紫外分光光度法
利用菠萝蛋白酶分解底物产生特定波长的紫外吸收，通过测定吸光度变化计算酶活力。
感谢观看
菠萝蛋白酶的应用
01
在食品工业中，菠萝蛋白酶可用于改善食品的口感和质地，如肉类嫩化、奶酪制造等。
02
在医药领域，菠萝蛋白酶具有抗炎、抗水肿、促进伤口愈合等
作用，可用于治疗炎症、创伤等疾病。
在农业上，菠萝蛋白酶可以作为生物农药，用于防治植物病虫
03
害。
研究目的与意义
01
菠萝蛋白酶作为一种天然的蛋白质水解酶，具有广泛的应用前景。
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
• 引言 • 菠萝蛋白酶的制备 • 菠萝蛋白酶活力的测定 • 结论
01
引言
菠萝蛋白酶简介
菠萝蛋白酶是一种植物来源的蛋白水解酶，具有高效催化蛋白质的能力。
菠萝蛋白酶具有较广的底物特异性，可以水解多种蛋白质底物。

菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定

二、菠萝蛋白酶在医药保健品业的应用
1、抑制肿瘤细胞的生长 2、对心血管疾病的防治：能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风, 缓解心绞痛症状,缓和动脉收缩, 加速纤维蛋白原的分解。 3、用于烧伤脱痂：菠萝蛋白酶能选择性地除皮使新皮移植得以尽早行
4、消炎作用：菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿，菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。 5、增进药物吸收：将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素, 阿莫西林等)联用, 能提高其疗效。相关研究表明, 它能促进抗生素在感染部位的传输, 从而减少抗生素的用药量。据推断, 对于抗癌药物, 也有类似的作用。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。
（三）菠萝蛋白酶活力的测定 1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至 10ml,离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号、、、、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴； 5、然后按下表操作
试管号 1 1%酪蛋白（ml) 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.7 5 0.8
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。

分子量为33 000 , 等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。

水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。

属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。

品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。

它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。

因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。

对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。

与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。

它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。

3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。

菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。

菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法 [91]。

每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反应体系总体积（mL）；t 为反应时间10min。

菠萝蛋白酶的制备及活力测定

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菠萝蛋白酶的生物学特征
三、储运特性库房通风低温干燥所需灭火剂：水,泡沫沙土,二氧化碳干粉所需灭火剂：泡沫,沙土二氧化碳,干粉泡沫沙土二氧化碳四、物理性质白色至浅棕黄色无定形粉末。溶于水，白色至浅棕黄色无定形粉末。溶于水，水溶液无色至淡黄有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白。色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。属糖蛋白。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。尚有水解酰胺基键和酯类的作用。解酰胺基键和酯类的作用。分子量：分子量：约33000DA 等电点pH值等电点值：9.35 最适pH值最适值：7 最适温度： ℃ 最适温度：45℃
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实验仪器与试剂
1、仪器：压榨机、吸附槽、虹吸管、盐析槽、离心仪器：压榨机、吸附槽、虹吸管、盐析槽、溶解罐、玻璃棒、烧杯、漏斗、抽滤机、机、溶解罐、玻璃棒、烧杯、漏斗、抽滤机、电子天平等 2、试剂：菠萝、0.05%苯甲酸钠溶液、4%高岭土、试剂：菠萝、0.05%苯甲酸钠溶液、4%高岭土、苯甲酸钠溶液高岭土 16%氢氧化钠溶液质量分数7% 9%的食盐盐酸、氢氧化钠溶液、 7%— 的食盐、 16%氢氧化钠溶液、质量分数7%—9%的食盐、盐酸、质量分数为25 硫酸铵、体积分数1 25﹪ 质量分数为25﹪硫酸铵、体积分数1：3的盐酸等
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2、吸附
将汁液移人吸附槽中将汁液移人吸附槽中搅拌，同时加入 4 吸附槽高岭土，％的高岭土，搅拌约 20 min，在 10℃吸附， ℃ 30～60 min，用虹吸排掉上清液收集高岭土～，吸附物
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生物化学实验设计1

生物化学实验设计1菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、目的要求1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。

3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。

本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。

4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。

菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。

此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。

聚乙二醇(PEG) 为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。

三、实验材料（一）试剂和材料1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L 氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。

（二）实验仪器1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37℃）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；四、试验方法（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min 离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用（二）菠萝蛋白酶活力的测定1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号1、2、3、4、5，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37℃水浴；5、然后按下表操作试管号 1 2 3 4 5 6 7 8标准酪蛋0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0白（0.1mg/mL）待测酶蛋白0 0 0 0 0 0 0 1.0（mL）磷酸缓冲液1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0（mL）考马斯亮蓝4 4 4 4 4 4 4 4（mL）通过测定不同试管中菠萝蛋白酶的吸光度A的值，进而确定酶活力的大小。

菠萝蛋白酶测定实验报告

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（5）班马俊宇201430520516摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。

从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。

同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。

关键词：菠萝蛋白酶纯化酶活性蛋白质含量前言菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用[1]。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。

其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能[2]。

菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.0~5.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活[3]。

本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。

1 实验材料与仪器1．1 实验材料与试剂新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇1．2 实验仪器电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2 实验方法2．1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min 至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

菠萝蛋白酶的制备及活性测定

菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。

菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。

一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。

八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。

1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。

Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。

结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。

Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。

1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。

菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。

菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。