荧光定量PCR基础知识

MGB探针
R：荧光报告基团 NFQ：非荧光淬灭基团 MGB：小沟结合物（增加探针Tm值）
MGB探针的优势
• 提高信噪比
没有背景荧光 更高的淬灭效率
• 提高Tm值
15 mer 提高18℃ 探针更短只要13-19个碱基
• 更多一重PCR（淬灭基团不占通道）
• 需要与模板序列完全匹配才可以结合（适合检测SNP） • 兼并、探针量高的情况也可结合
淬灭基团种类 DABCYL TAMRA BHQ1 BHQ2 BHQ3 荧光报告基团种类 6-FAM， TET， JOE， HEX，Cy3等 6-FAM， TET， JOE， HEX等 6-FAM， TET， Cy3， JOE， HEX等 Cy3， Texas Red， Cy5， TAMRA， ROX等 Cy5， Cy5.5等
线性图谱
半对数图谱
CT值由阈值确定
Threshold（阈值）
CT
CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应 管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
数学关系
• Log浓度与Ct呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出 样品中所含的模板量。
Байду номын сангаас
TaqMan探针设计要点
TaqMan Probe Primer 尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好是 PCR产物大小建议50-150bp 探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 GC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体 Tm值:68-70℃ Probe长度： 13-25bp (TaqMan MGB Probe) 13-30bp （TaqMan Probe） 终浓度：0.2~0.25uM 3’端的前4个碱基不能有3个以上的G 避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A 选择C比G多的链当探针 5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基 也不能是G。5' 端染料最好连接在T或C碱基上。 Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp 终浓度：0.2uM~0.5uM 3’端的前5个碱基不能超过2 个C/G
• B • C
• D
• ROX™ dye
• E
仪器的校正
5 仪器的维护和校正
误
差 来 源
定义
• 纯荧光光谱：标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX, SYBR, FAM，VIC ，这些信息存储于计算机中，在数据分析的时候使用。荧光 基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。 • 原始光谱视图（Raw Date ）: 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。 背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
两种方法的比较
TaqMan®
• 优势
−
Sybr® Green I
• 优势
−
更特异 不需要考虑二聚体 可以进行多重反应 不需要优化 拥有已开发的试剂盒
比较便宜
− − − −
• 不足
− − − −
−
特异性差 需要做融解曲线 不能进行多重反应
• 不足
−
需要进行优化
须根据自行设计实验
比较昂贵
报告集团及淬灭基团的选择vic
染料法原理
• SYBR Green I是一种DNA小沟 结合染料
• 游离时不发光
• 与DNA结合时发光
• 每一轮反映结束后收集荧光，检 测体系中双链产物的量。
溶解曲线：derivative view
•反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某一温度区域变性为单链，双链结合 染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其 监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。
定量PCR体系
• 普通的PCR体系 • 模板,引物,dNTPs, buffer,Taq酶 • 加入各种类型的荧光染料
定量PCR原理
• 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 • 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍
• 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号
• 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强
荧光定量PCR基础
纲 要
定量 PCR 介绍 荧光定量PCR化学原理 仪器的校正 定量 PCR实验要素 数据分析
定量 PCR常见故障排查
常见应用
定量 PCR 介绍
什么是荧光定量PCR
指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样 品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。
不同滤光片对应的发光集团
• 滤光片 • A • 7000和7300荧光定量PCR系统 • SYBR®Green I, FAM™ dyes • VIC®, JOE™ dyes • NED™, TAMRA™, • 7500荧光定量PCR系统 • SYBR®Green I, FAM™ dyes • VIC®, JOE™ dyes • NED™, TAMRA™ dyes CY3™ dyes • ROX™, Texas Red® dyes • CY5™ dye
定量PCR的优点
1. 敏感度: 可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足 够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增) 2. 高分辨率: 1倍分辨率
3. 动力学范围宽: 约9个数量级.
4. 快: 节省时间和劳力 (不需要跑胶). 5. 安全: 不用EB或放射性物质
荧光定量PCR化学原理
光学结构简图
典型的PCR四阶段
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
PCR理论方程 N = N0x (1+e)n
N=产物分子数 N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数
PCR方程只在指数期成立
荧光PCR信号方程
什么是阈值
• 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 • 控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉 点确定 CT 值。
两种化学方法
探针法 染料法
Taqman探针法原理
•完整的探针：5′端荧光基团吸收 能量后将能量转移给临近的3′端 荧光淬灭基团（发生荧光共振能 量转移，FRET）
•退火，探针与模板结合，引物 在聚合酶作用下进行延伸反应， 遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性 将探针切碎到反应体系中
•报告基团与淬灭基团距离变大， 在激发光的作用下发荧光