荧光定量PCR基础知识

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荧光定量pcr的原理方法

荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。

荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。

2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。

3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。

4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。

PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。

5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。

荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。

6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。

7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。

标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。

8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。

荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。

荧光定量PCR基础知识

内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基也不能是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定，可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正

实时荧光定量PCR介绍课件

实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 21
质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 13
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。
Real Time PCR引物目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

荧光定量PCR技术原理与结果分析

荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。

PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。

在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。

2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。

荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。

因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。

二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。

较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。

3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。

在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。

CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。

4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。

荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。

荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。

5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。

通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。

此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。

荧光定量PCR基础原理ppt课件

荧光定量PCR基础原理
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探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与模板结合探针，其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
荧光定量PCR基础原理
荧光定量PCR基础原理
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普通PCR技术检测模式
普通PCR仪器扩增，约2.5小时
琼脂糖凝胶电泳，约1小时
阴性
无法定量
样品检测结果
阳性
EB染色，约20分钟紫外成像
荧光定量PCR基础原理
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实时荧光定量PCR检测模式
荧光定量PCR仪器扩增，约2小时
光滑S型指数曲线，阳性
检测过程有实时监测数据
Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能量传递）原理设计。
荧光定量PCR基础原理
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TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。
TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针 5′端标识有荧光汇报基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
绝对定量
病原载量定量
GMO成份评定
残留DNA测定
相对定量
基因表示差异比较
治疗伎俩效果评定
荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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SYBR Green I荧光染料作用原理

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

荧光定量pcr的原理

荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。

荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。

首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。

PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。

在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。

PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。

其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。

在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。

荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。

通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。

最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。

通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。

软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。

总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。

这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。

希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。

技术丨一文带你深入解读荧光定量PCR

技术丨一文带你深入了解荧光定量PCR（进阶篇）相信大家都看过小编前面推出的荧光定量PCR实验技术（（新手入门篇）的干货分享吧，那么在进行荧光定量PCR实验时，是否对一些专有名词感到困惑呢？面对状况百出的定量曲线图，分析的时候是否也无从下手呢？今天这篇技术分享，就带你继续深入了解荧光定量PCR中常见概念，以及诸多问题的解读思路。

首先了解荧光定量PCR中有哪些常见的基本概念：➢基线基线是指通常在PCR最初3 至15个循环的信号水平，此阶段扩增产物带来的荧光信号被荧光背景掩盖，因此基线的存在是为了消除扩增早期的荧光背景。

基线一般由仪器自动计算所得，也可以手动设置，当目的基因的表达量较高时，基线的循环数要相应减少。

➢阈值阈值为反应扩增至基线之后即进入指数期时，选择适当位置设定的荧光检出界限，一般定为基线标准偏差的10倍，过低会难以和基线明显区分，过高则会出现循环后期扩增效率降低导致的数据偏差。

➢CT值每个PCR反应管内的荧光信号到达设定荧光阈值时的循环数，CT点位于荧光阈值线与扩增曲线的交点处，由于荧光信号只能与双链DNA结合，因此CT值与起始拷贝数的对数成线性关系，起始模板浓度越高，则CT值越小。

扩增曲线指的是以扩增循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标形成的曲线，扩增曲线分为基线期，对数增长期和平台期➢熔解曲线qPCR扩增结束后，会对扩增产物进行加热，使得双链DNA重新解链，荧光信号下降，而熔解曲线是以温度为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标形成的曲线，它直接反映出荧光信号随着温度变化的情况，对荧光信号值求导可以获得熔解曲线的导数曲线，根据该曲线中的峰值可以直观地判断双链DNA的解链情况。

将标准品倍比稀释后，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标生成的标准曲线。

一般拷贝数的对数与Ct值成线性关系。

接着将待测样本的Ct值代入标准曲线公式即可计算出样品初始拷贝数。

完美的扩增曲线呈现S型走势，平台期、基线期平直，指数期呈线性，拐点清晰，但在实际操作过程中，通常会遇到各种异常的曲线图，那么不同的扩增曲线及熔解曲线分别代表着什么呢？➢扩增曲线异常1、扩增曲线不平滑这种情况如果排除仪器信号接收或者检测孔异常的问题，那就需要考虑模板浓度不足，导致信号太弱接收不稳定，可以尝试提高模板浓度重新进行qPCR实验。

荧光定量PCR手册

荧光定量PCR手册一、什么是荧光定量 PCR荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在 DNA 扩增反应中，通过荧光信号的实时监测来定量分析特定核酸序列的技术。

简单来说，它能告诉我们样本中特定基因的数量有多少。

这一技术在生物学、医学、农学等众多领域都发挥着重要作用。

比如，在医学诊断中，能检测病毒或细菌的感染量；在基因研究中，可分析基因的表达水平。

二、荧光定量 PCR 的原理荧光定量 PCR 的原理基于传统的 PCR 技术，但增加了荧光检测的环节。

在 PCR 反应中，DNA 会被不断复制。

我们会在反应体系中加入一种特殊的荧光探针或荧光染料。

这些荧光物质的荧光强度会随着 PCR 反应的进行而发生变化。

当 PCR 反应开始时，荧光信号很弱。

随着反应的进行，DNA 不断扩增，荧光信号逐渐增强。

通过检测荧光信号的强度变化，我们就能实时了解 PCR 反应的进程，并计算出初始样本中目标 DNA 的含量。

三、荧光定量 PCR 的实验流程（一）样本准备首先，需要从待检测的生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取出 DNA 或 RNA。

提取的质量和纯度对后续实验结果至关重要。

（二）引物和探针设计设计合适的引物和探针是关键步骤。

引物是一小段能与目标 DNA 序列特异性结合的寡核苷酸，它们决定了 PCR 反应扩增的区域。

探针则用于检测扩增产物，通常带有荧光标记。

（三）PCR 反应体系配置将提取的核酸模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs 等试剂按照一定的比例混合，配置成 PCR 反应体系。

（四）PCR 反应将配置好的反应体系放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序，进行 PCR 反应。

（五）数据分析PCR 反应结束后，仪器会给出荧光信号的变化曲线。

通过对这些曲线进行分析，可以得出目标基因的初始含量。

四、荧光定量 PCR 的关键要素（一）引物和探针的设计引物和探针的特异性、长度、GC 含量等都会影响 PCR 反应的效率和特异性。

荧光定量PCRPPT课件

仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器等设备正常运行，并按照实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性，设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本，并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理，如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光信号的变化，收集数据以供后续分析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理，如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续的研究或实际应用中，如基因表达分析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定量PCR实验结果进行解读，并评估其可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针标记特异性检测目标，通过荧光信号的累积和检测，实现对目标序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也相应增强，通过实时监测荧光信号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。

荧光定量PCR基本原理

荧光定量PCR基本原理引言荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种广泛应用于生物学研究的分子生物学技术，它可以快速、敏感地检测和定量DNA或RNA的特定序列。

本文将介绍荧光定量PCR的基本原理及其在科研和临床实验中的应用。

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR是在普通PCR的基础上进行改进的技术。

荧光定量PCR利用荧光染料标记的PCR产物在PCR过程中产生的荧光信号的数量，来定量测定起始模板序列的数量。

其基本原理如下：1.DNA扩增：首先，通过PCR反应扩增起始模板序列，其中包括所需检测的特定DNA或RNA序列。

PCR反应包括变性、退火和延伸等步骤，通过复杂的温度变化过程进行。

2.引物标记：在PCR反应中，引物（primers）与起始模板序列的互补区域结合，并在退火温度下启动扩增反应。

荧光引物（fluorophore-labeled probes）通常使用荧光团与一个受体团连结在一起，这样在PCR反应中就能发出荧光信号。

3.荧光信号检测：PCR反应进行中，特定的荧光探针与扩增产物特异性结合，释放出荧光信号。

荧光信号的数量与起始模板序列的数量成正比。

通过测量荧光信号的强度，可以间接反映起始模板序列的初始数量。

4.标准曲线法：为了定量测定起始模板序列的数量，可以利用一系列已知浓度的标准样品制作标准曲线。

通过测量荧光信号与标准曲线之间的关系，可以推算出未知样品中起始模板序列的浓度。

荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在科研和临床实验中有广泛的应用，主要包括以下方面：1.基因表达分析：荧光定量PCR可以用于测量特定基因的表达水平，从而研究基因的功能和调控机制。

通过比较不同组织、不同时间点或不同处理条件下特定基因的表达水平，可以获得相关生物过程的重要信息。

2.病原体检测：荧光定量PCR可以用于检测和鉴定各种病原体，如细菌、病毒和真菌等。

它可以快速、准确地诊断疾病，并且能够检测低浓度的病原体。

万字长文讲清荧光定量pcr

万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基于PCR技术的定量分析方法，它可以对DNA或RNA样品中的目标序列进行定量测定。

与传统PCR方法相比，荧光定量PCR具有更高的灵敏度和准确性。

在荧光定量PCR中，首先需要设计一对引物，它们能够特异性地结合到目标序列的两个相邻区域上。

引物的设计需要考虑多个因素，如引物长度、GC含量、Tm值等。

引物的合成通常由专业实验室完成，确保其质量和纯度。

在PCR反应中，首先将DNA或RNA样品与引物、荧光探针和酶进行混合。

然后，在一台PCR仪中，通过一系列的温度变化，使DNA 或RNA样品经历一系列的变性、退火和延伸过程，从而得到目标序列的扩增产物。

在PCR反应过程中，荧光探针发挥着重要的作用。

荧光探针通常由一个引物序列和一个荧光染料序列组成。

当荧光探针结合到目标序列上时，荧光染料与引物序列之间的约束被打破，导致荧光信号的释放。

荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，可以通过荧光定量PCR仪进行检测和定量分析。

荧光定量PCR仪是一种专门用于测量荧光信号的仪器。

它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并根据荧光信号的变化来确定目标序列的初始浓度。

荧光定量PCR仪通常配备有相应的软件，可以自动分析和处理荧光信号数据，生成定量分析结果。

荧光定量PCR在许多领域都得到了广泛应用。

例如，在生物医学研究中，荧光定量PCR可以用于检测病原体的存在和数量，帮助诊断和治疗疾病。

在农业科学中，荧光定量PCR可以用于检测转基因作物的存在和数量，以及检测植物病原体的感染情况。

在环境科学中，荧光定量PCR可以用于监测水体和土壤中的微生物污染情况。

荧光定量PCR的发展和应用为科学研究和实验室诊断提供了重要的工具。

它不仅提高了DNA或RNA分析的灵敏度和准确性，还大大加快了实验的进行速度。

随着技术的不断改进和创新，相信荧光定量PCR将在更多的领域发挥重要作用，为人类的健康和环境保护做出更大的贡献。

荧光定量PCR技术原理与结果分析

荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。

本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。

一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。

在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。

1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。

2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。

3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。

4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。

二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。

根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。

Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。

(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。

扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。

(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。

Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。

2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。

常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。

∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。

荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。

如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

荧光定量PCR

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。

其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。

荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。

2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。

因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。

TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。

在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。

荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。

cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。

2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。

3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。

4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。

荧光PCR技术基础

荧光PCR技术基础荧光PCR技术是一种聚合酶链反应（PCR）的应用形式，它通过荧光标记分子来监测PCR反应的进程，进而实现特定DNA序列的检测和定量分析。

PCR反应基础PCR反应是一种基于DNA多次复制的技术，可以在数小时内从少量DNA样品中扩增出数百万份DNA分子。

PCR反应需要一组起始DNA链（即模板），以及两个引物（分别定位模板的起始和终止位置）。

PCR反应通过多次循环加温、退火、延伸步骤来复制目标DNA序列。

每次循环，DNA模板被加热至高温水平（约95°C），使其完全分离。

此后，在较低温度（大约60°C）下，引物与模板DNA形成稳定的杂交，并在聚合酶作用下延伸DNA链。

这个循环重复了30到40次，每个循环后，DNA的数量增加了一倍，因此在几个小时内可以在初始DNA的基础上扩增大约1亿倍或更多。

荧光PCR的原理荧光PCR利用荧光效应检测PCR反应进程。

在PCR过程中，聚合酶用引物控制DNA合成的方向，并且与一个用于生成荧光或发光信号的荧光或发光探针配对。

荧光探针是一种荧光染料，其分子内包括足够的正负电荷来阻止其绑定到DNA上。

当荧光探针与与其序列完全相匹配的DNA某个位置相邻时，它的序列被专门设计为允许探针开口并绑定到DNA上。

一旦荧光标记绑定到DNA上，激发荧光的能量就可以通过荧光检测器进行监测。

荧光PCR的优势相对于传统的PCR技术，荧光PCR具有显著的优势。

一方面，荧光PCR可以同时定量检测多个DNA分子，因为可以使用多个荧光探针，每个探针可以与一个不同的DNA目标匹配。

这意味着可以在一个PCR反应中同时检测多个目标DNA序列的存在和数量。

另一方面，荧光PCR具有高灵敏度和高精确度，因为可以使用荧光探针来检测特定DNA序列的存在，并且可以根据荧光信号的大小来确定该DNA序列的数量。

荧光PCR的应用荧光PCR是广泛使用的分子生物学技术之一，在医药、生物学和环境科学等领域都有广泛应用。

万字长文讲清荧光定量pcr

万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种基于PCR技术的快速、高灵敏度和高特异性的DNA 定量方法。

它利用DNA扩增和荧光探针结合的原理，可以快速准确地定量目标DNA的含量。

荧光定量PCR主要分为两个步骤：扩增和检测。

在扩增步骤中，通过PCR反应使目标DNA被放大成大量的拷贝，并引入荧光标记的引物。

在检测步骤中，通过荧光探针与扩增产物结合，并测量荧光信号的强度，从而确定目标DNA的含量。

具体步骤如下：1. 反应体系的准备：根据实验需要，制备PCR反应液，包括引物、荧光探针、缓冲液、dNTPs、酶等。

2. DNA模板的准备：从待测样本中提取DNA，并进行纯化和浓缩。

3. PCR扩增反应：将DNA模板与引物和荧光探针加入PCR反应液中，进行PCR扩增反应。

PCR反应可以选择不同的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。

4. 荧光信号检测：在PCR扩增反应过程中，荧光探针与目标DNA 结合形成双链结构，荧光信号被激发并发射。

荧光信号可以通过荧光实时定量PCR仪器进行检测和记录。

5. 数据分析：根据荧光信号的强度，可以计算目标DNA的含量。

通常，荧光信号的强度与目标DNA的初始浓度成正比。

荧光定量PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性。

由于荧光信号可以实时检测和记录，所以可以在PCR反应过程中实时监测目标DNA的含量变化。

此外，荧光定量PCR可以同时检测多个目标DNA，并且可以定量非常低浓度的DNA样本。

荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、基因表达分析等领域得到了广泛的应用。

它可以用于检测病原体、基因表达水平、突变等，对于研究疾病的发生机制、筛选药物靶点、预测疾病进展等具有重要意义。

同时，荧光定量PCR也是一种常用的基因分型方法，可以用于DNA指纹鉴定、亲子鉴定等。

荧光定量PCR作为一种快速、高灵敏度和高特异性的DNA定量方法，已经成为生命科学研究和临床诊断的重要工具。

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