免疫组化和荧光
免疫组化与免疫荧光的区别2页
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免疫组化和免疫荧光的区别是免疫荧光属于免疫组化，是免疫组化中的一种技术方法。
免疫组化检查指应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，确定组织或细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对的定量检查。
按标记物质的种类分类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤分类，可分为直接法和间接法，间接法的灵敏度提高了许多。
综上，免疫荧光法是免疫组化检查的一种技术方法。
免疫组化与免疫荧光都是经过免疫原，两者原理相似，仅是显色剂不同。
免疫组化使用酶进行显色，而免疫荧光一般不使用酶进行显色。
另外，免疫组化通常在明视野进行观看，而免疫荧光则是在暗视野观看。
患者进行治疗首先需明确诊断疾病，若无精准诊断则无精准治疗。
免疫组化与免疫荧光的真正目的均为明确病理诊断，以便患者获得精准治疗。
免疫组化是应用免疫学的基本原理，也就是抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织
细胞内的抗原，对其进行定位、定性和相对定量的研究。
进行免疫组化的时候，经常使用的显示剂包括荧光素、酶、金属离子或者是同位素。
免疫荧光就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素，标记在抗体或者抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
免疫组化染色和免疫荧光染色
免疫组化染色和免疫荧光染色英文回答：Immunohistochemistry (IHC) vs. Immunofluorescence (IF)。
Immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) are both immunostaining techniques used to localizespecific proteins or other molecules within cells or tissues. While they share some similarities, there are also key differences between the two techniques.IHC.Uses antibodies conjugated to an enzyme (e.g., horseradish peroxidase) or a hapten (e.g., biotin)。
Detects proteins using enzymatic or chemical amplification.Produces a permanent, brown or red precipitate at thesite of antibody binding.Can be used on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections or frozen tissue sections.Typically provides good spatial resolution but limited sensitivity.Can provide semi-quantitative or quantitative data (e.g., number of positive cells, intensity of staining)。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
摘要：
I.免疫组化
A.定义
B.应用
C.优点
D.缺点
II.免疫荧光
A.定义
B.应用
C.优点
D.缺点
III.两者比较
A.共同点
B.不同点
C.选择方法的因素
正文：
免疫组化是一种免疫学技术，通过使用特定抗体来检测组织切片中特定抗原的存在。
这种技术通常用于诊断和治疗疾病，研究基因表达和细胞信号通路。
免疫组化可以提供有关分子在细胞和组织中的定位信息，以及它们在疾病中的作用。
免疫荧光是一种类似的免疫学技术，它使用荧光标记的抗体来检测特定抗原的存在。
与免疫组化不同，免疫荧光可以在活细胞和组织中进行。
这使得免疫荧光成为研究细胞功能和分子动态的理想方法。
免疫组化和免疫荧光之间的主要区别在于它们的应用和检测方法。
免疫组化通常用于检测组织切片中特定抗原的存在，而免疫荧光可以在活细胞和组织中进行。
此外，免疫组化使用化学方法来检测抗原，而免疫荧光使用荧光标记的抗体来检测抗原。
选择免疫组化或免疫荧光方法的因素包括研究目的、样本类型和实验设计。
例如，如果研究目的是检测特定抗原在组织中的定位，则免疫组化可能是更好的选择。
如果研究目的是研究活细胞中的分子动态，则免疫荧光可能是更好的选择。
总之，免疫组化和免疫荧光是两种常用的免疫学技术，它们都可以用于检测特定抗原的存在。
排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片
排雷攻略：⼀⽂教会你免疫组化、免疫荧光如何制⽚看⽚最近带着新进门的研⼀师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染⾊？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，师妹问的这⼏个问题就是⼀个问题。
归根结底，涉及到“免疫”⼆字总是离不开抗原抗体反应的，⼆者都属于免疫检测技术⼿段，⽽免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应⽤在组织和细胞⽅⾯，前者采⽤的是化学发光的⽅法，后者是荧光。
因为我们在⽂献中看到的，很多⼈都会选择做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初⼊实验室的新⼿们带来了误区。
其实⽹上已经有很多详细的操作步骤，所以⼩六⼉今天想为各位新⼿朋友们总结⼀下我认为的免疫组化和免疫荧光制⽚看⽚的⼩技巧，帮助⼤家排雷区，同时也提出⾃⼰的⼀些疑问，希望能得到解答（因为本⼈只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两⽅⾯为主，内容若有⽋缺，欢迎⼤家补充）。
免疫组化1、取材时要尽量去除⾎液的⼲扰：⼩⿏⿇醉后，从左⼼⽿插⼊针头，⼼尖处剪开⼀个⼩⼝，然后将PBS缓慢打⼊⼼脏中，缓慢跳动的⼼脏会将PBS运送⾄全⾝。
50ml的PBS⽤量对于Balb/c或昆明⼩⿏的体积⽽⾔就已⾜够，这⼀步骤对于像肺、肝和脾脏这样⾎管丰富的脏器取材极为重要。
2、取材时要尽量做到表⾯积⼤、厚度⼩：理想的取材厚度是2mm，这样的尺⼨可以让后续的固定、脱⽔等操作达到理想的效果。
器材选择上，⼿术⼑和超市购买的⼑⽚都可以，只要⼑⽚锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。
因为脏器的表⾯都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第⼀是不好切，第⼆是弧形的⼀⾯肯定是厚度超标，所以这⾥建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切⾯处再切⼀⼑取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。
3、取材后的组织需⽴即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
免疫组化和免疫荧光的区别
请问你曾经被ＩＨＣ、ＩCＣ和IF所困扰过吗?作者：北京义翘神州在实验中,有没有一种感觉,就是对免疫组化(ＩHＣ),免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清,那么今天我们就来讨论一下这三者的区别,先贴图上来以便有个大致的区分。
从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同,可以分为组织和细胞检测技术。
因此，才会延伸出三个相近的概念。
为了更好的区分这三个概念,我们还可以根据他们的英文词根来分析一下,他们的英文名分别是免疫组织化学Ｉｍｍuｎｏhistoｃｈｅmistry (ＩHＣ)，免疫细胞化学Imｍunocyｔocheｍisｔry (ＩＣC），免疫荧光 Imｍｕnofluｏresｃｅnｃｅ (ＩＦ)。
词根分析:Immuno－指的是免疫技术(例如，抗体和抗原的结合）Histｏ-指的是组织(细胞以及它周围的细胞外基质)Cyｔo-指的是细胞(不包含细胞外的基质)Chｅmistry-在这里指的是化学检测方法（例如,颜色的变化)Fluｏrｅscence-对被激发的荧光团的检测通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。
这三个应用技术都属于免疫技术,都是将抗原与抗体的结合可视化,即通过一定的方法可以直接看到实验结果。
而常用的方法就是化学显色和荧光显色。
如果报告标签是酶促的,就是免疫化学,如果是荧光的，就是免疫荧光。
其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Iｍmunｏｆluoresｃｅｎce （IF),但若是写成免疫组织荧光(IHＦ)或是免疫细胞荧光(IＣF），那我们是不是就豁然开朗了。
虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛,但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。
可能文字描述还是有些晦涩难懂,那我们就直接上图吧。
先不看下面答案,仅从几张图片,你能明白哪张图代表哪种应用吗?A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（1００01-R043-50)—人胎盘B 免疫细胞化学:兔α微管蛋白单克隆抗体抗—MEF1细胞Ｃ免疫荧光组织：兔Cdk５单克隆抗体—鸡脑组织D免疫荧光细胞:兔ＪNK2/ＭAPK9（10745-R0０4-5０）单克隆抗体—人Hela细胞A图和B图是免疫化学（Ｉmmuｎｏcｈｅmｉstry），这种应用是抗体检测目标蛋白,发生了化学反应,然后显色，根据样本类型的不同,又可以分为免疫组织化学（A）和免疫细胞化学(B）。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence，简称IF）是常用于研究细胞和组织中蛋白质分布和定位的实验技术。
免疫组化：免疫组化是通过使用特异性抗体来检测和定位组织切片中特定蛋白质的技术。
它包括将组织切片与特异性抗体结合，然后使用染色试剂使抗原-抗体复合物形成染色反应，从而可视化目标蛋白质的位置。
该技术常用于研究细胞分化、组织病理学和肿瘤学等领域。
免疫荧光：免疫荧光是利用荧光染料（荧光标记的二抗或直接标记的一抗）结合目标抗原的方法来检测和定位组织或细胞中的蛋白质。
通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后使用荧光标记的二抗或直接标记的一抗与抗原-抗体复合物结合，使目标蛋白质在显微镜下产生荧光信号，以观察其位置。
免疫荧光技术广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和医学诊断领域。
这两种技术在原理上非常类似，但在应用上有一些区别。
免疫组化主要用于固定的组织切片，可用于定量和定位分析。
而免疫荧光通常用于固定的细胞，可以提供更高分辨率的蛋白质定位信息，并可以进行多色荧光共标记以研究多个蛋白质的相互作用和定位。
无论是免疫组化还是免疫荧光，都依赖于合适的抗体选择和样本处理步骤来确保结果的准确性。
技术的选择应根据研究
的目的和样本的性质进行评估和决策。
if免疫荧光和免疫组化
if免疫荧光和免疫组化免疫荧光和免疫组化是两种常见的生物学实验技术，它们在疾病诊断、生物学基础研究和临床医学中具有重要的应用。
if免疫荧光和免疫组化都是基于免疫反应的原理，可以用来检测和定位蛋白质、抗体、细胞等各种生物学分子或细胞。
if免疫荧光技术是指在细胞或组织标本中，利用特异性抗体与目标蛋白发生特异性结合，再使用与抗体结合的荧光标记物进行检测。
if免疫荧光技术可用于检测和定位目标蛋白在细胞或组织中的表达情况及其分布规律。
if免疫荧光技术的操作步骤一般包括标本处理、抗体染色、荧光物检测、显微镜观察及结果判断等，具体实验步骤如下：1. 标本处理：将待检测的组织标本制作成薄片，并通过石蜡切片等技术固定，去除脂肪和其他细胞成分，避免对结果的影响。
2. 抗体染色：选择与目标蛋白特异性结合的荧光抗体，并将其加入到标本液中，与目标蛋白结合。
3. 荧光物检测：通过荧光显微镜等特殊仪器，观察荧光抗体与目标蛋白的结合情况，荧光染色只在目标蛋白位置上发光。
4. 显微镜观察：经荧光显微镜观察，在目标蛋白位置显示出强烈的荧光信号，并根据信号的强度、分布等评价目标蛋白的表达情况。
5. 结果判断：根据观察到的荧光信号的强度和位置，判定目标蛋白是否存在以及在细胞或组织中的表达量和分布情况等。
免疫组化技术则是一种用于检测检测蛋白质在细胞、组织和器官中的分布及表达强度的方法。
其操作步骤与if免疫荧光技术基本相同，仅在荧光物检测环节不同，免疫组化技术使用的是酶标测技术。
下面给出免疫组化的具体步骤：1. 标本处理和抗原检测：同if免疫荧光技术，将标本固定在载玻片上，并加入特异性抗体并进行染色处理。
2. 二抗结合：加入与特异性抗体结合的二次抗体，二抗在结合特异性抗体时，又结合了一个辣根过氧化物酶标记物。
3. 底物显色：将含有底物的试剂涂在标本上，试剂中的底物会被辣根过氧化物酶催化，产生可见的显色反应，显示出蛋白质的位置。
4. 显微镜观察：同if免疫荧光技术，通过显微镜观察，评价标本中蛋白质的表达量和分布情况。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。
虽然它们都是用于检测特定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上却有着明显的区别。
在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地理解并灵活运用这两种技术。
1. 免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。
它的操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。
在实验过程中，首先需要将样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。
随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。
接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。
2. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。
它的操作流程也包括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤较为类似。
不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。
在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适用于体内和体外实验样本。
而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的技术手段。
在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。
通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学研究。
免疫组织化学、免疫荧光染色
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学研究中常用的实验技术方法。
它们都是通过利用抗体与目标抗原的特异性结合来检测和定位特定蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
尽管它们的目的相似，但在具体实验步骤、原理和应用方面存在一些差异。
本文将对免疫组化法和免疫荧光染色法的区别进行详细阐述，以帮助读者更好地理解这两种常见实验技术。
一、实验步骤和原理1.免疫组化法：免疫组化法是一种通过使用抗原与特异性抗体相结合的技术，将抗体标记物（一般为酶）转化为可见信号，并用于检测和分析目标分子在细胞或组织中的表达情况。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合、再次洗涤和显色等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法是利用荧光标记的抗体来检测和定位目标抗原的一种技术。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合和荧光染色等。
从实验步骤和原理上看，免疫组化法和免疫荧光染色法在很多方面是相似的。
它们都需要进行对抗原的取样和固定等预处理步骤，以及对目标抗原的特异性抗体进行结合。
然而，主要的区别在于信号检测和可见性。
免疫组化法使用酶标记物并在显色反应中产生可见的染色物质，而免疫荧光染色法则通过荧光标记的抗体在荧光显微镜下进行直接可视化。
二、应用领域1.免疫组化法：免疫组化法广泛应用于细胞生物学和组织学研究中，常用的应用领域包括但不限于肿瘤标记、蛋白质表达和定位、细胞内分子信号通路等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法在细胞和组织研究中具有重要作用。
它常用于细胞活力检测、细胞分子定位、免疫分型、细胞凋亡检测等。
免疫组化法更适合定性分析和形态学研究，而免疫荧光染色法则更适合定量分析和定位研究。
在实际应用中，研究者可以根据自己的研究目的选择合适的方法，或者根据具体需求结合两种方法进行分析。
三、我的个人观点和理解免疫组化法和免疫荧光染色法作为两种常见的免疫化学实验技术，都在生物医学研究领域发挥着重要的作用。
免疫组化和荧光
体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 显色来
确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性 的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗 体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
2014-3-21
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实验步骤
脱蜡水化： 二甲苯Ⅰ 20min 二甲苯Ⅱ 20min 无水乙醇Ⅰ 10min 无水乙醇Ⅱ 10min 95%乙醇 5min 80%乙醇 5min 75%乙醇 5min 50%乙醇 过一遍 蒸馏水 过三遍 高压修复 4min 流水冷却 PBS冲洗 5min×3次
6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗孵育之后的 浸洗要充分； 7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
2014-3-21 12
免疫荧光常见问题的处理
• •
• • • 非特异性染色产生原因及其解决方案： ⑴游离荧光素残留在二抗中。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。 ⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结 合。 ⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原， 可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。 ⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗 其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 ⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的 阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 ⑹荧光素不纯、标本固定不当等。 ⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至 最佳。 ⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应， 阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、 或固定方式不同等原因所致。
免疫荧光和免疫组化
免疫荧光和免疫组化问题如下：1. 免疫荧光好还是做免疫组化好？我倾向于做免疫组化，但老板倾向做荧光，我想两种方法都了解一下，能否介绍一下两种方法的详细步骤（protocol）。
2. 一抗、二抗抗体（包括荧光抗体）如何选择，哪个公司的比较好？浓度怎么掌握？其实IHC和IFC本质都是一样的。
只是最后的显色方法不一样，IHC是用酶加底物进行显色反应，用普通光镜观察；IFC是直接用带有荧光物质连接的二抗与一抗结合，在相应波长的激发光下观察。
我也倾向于IHC，理由如下：IHC的级联放大作用使得抗原比较少的组织也能有很强的着色。
我一般用Vector公司的Elite系列ABC kit，HRP－DAB显色系统。
IHC的切片可以长期保存。
很多时候试验做出来了，需要反复的看片子。
而IFC的有荧光猝灭，无法长久保存。
所以不利于反复阅片。
IFC有利于做Multiple Labeling，比如在同一location的两种或多种抗原的比较，通常用IFC；IFC还多用于活细胞的staining，但如果是石蜡切片，总会有一些自发荧光现象存在。
所以个人认为，能用IHC的时候建议不用IFC。
详细protocol请在本版内search一下，已经有很多的讨论了。
一抗通常买DAKO、SIGMA、VECTOR，二抗可以选择相应公司的，也可以买SANTA CRUZ的，比较便宜一些。
荧光二抗建议买Molecular Probe的，现在和Invitrogen合并了。
浓度先参考data sheet上的，不过还是自己要optimize一下，比如建立个浓度梯度。
阴性对照用相同种属来源动物的IgG。
供参考。
GOOD LUCK!免疫荧光结果分析及抗体选择——许多问题你思考过吗？/bbs/topic/24548838?keywords=%E5%85 %8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%E7%BB%93%E6% 9E%9C%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7 %96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97免疫荧光因其直观、色彩鲜明而被广泛用于检测各种蛋白的定位表达。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和免疫荧光（immunofluorescence，IF）是现代生物医学研究中非常重要的技术手段。
它们能够帮助研究人员检测和定位体内特定的抗原分子，从而解析其在生物体内的表达及分布情况。
在研究疾病机制、诊断疾病以及筛选新药的过程中，免疫组化和免疫荧光技术起到了至关重要的作用。
免疫组化技术利用抗体的高度特异性与抗原结合的原则，通过显色或荧光等方式便于观察和定量，从而实现对特定蛋白分子的检测。
与传统的组织学染色方法相比，免疫组化技术具有更高的灵敏性和特异性。
它可以用于研究肿瘤细胞的表型和基因型，识别细胞类型和分化状态，表达和分布丰度评估等方面。
免疫组化的步骤一般分为抗原解表、抗体孵育、二抗复合、显色/荧光和显微镜观察等几个关键步骤。
首先，需要对组织样本进行固定和包埋处理，以保证组织结构的完整性。
然后，通过切片和石蜡脱脂等处理，将样本表面的蛋白质解表，暴露出所需的抗原位点。
接下来，将特异性的抗体与样本中的抗原结合，以形成特定的抗原-抗体复合物。
之后，通过孵育次级抗体，将荧光染料或酶标记物与抗原-抗体复合物结合，以便于后续的检测和可视化。
最后，利用显微镜观察样本，并根据染色或荧光信号分析目标蛋白的表达和分布情况。
免疫荧光技术与免疫组化技术类似，但其主要用于可视化荧光信号。
在免疫荧光技术中，孵育过程中的抗原-抗体复合物会被荧光标记的二抗所结合，从而形成荧光信号。
这种信号可以直接通过荧光显微镜观察，也可以通过激光共聚焦显微镜等高分辨率成像设备进行观察和记录。
免疫荧光技术适用于检测蛋白质在细胞和组织中的分布、定位以及与其他蛋白质的相互作用等方面的研究。
总的来说，免疫组化和免疫荧光技术在现代生物医学研究中发挥着重要的作用。
它们可以帮助我们了解细胞和组织中特定蛋白质的表达和分布情况，进而揭示疾病的发生机制和药物的作用机理。
在临床诊断中，免疫组化和免疫荧光技术也可以提供重要的辅助信息，用于疾病的鉴别诊断和预后评估。
免疫荧光和免疫组化的异同点
免疫荧光和免疫组化的异同点1. 免疫荧光与免疫组化简介免疫荧光和免疫组化，听起来好像是在讨论一些高大上的科学实验，其实它们都是我们在生物医学领域常用的检测方法。
就像一对好基友，各有各的长处，互相补充，真是默契得很。
简单来说，免疫荧光主要是用来观察细胞或组织中的特定抗原，而免疫组化则是通过染色来显示这些抗原。
就像两位艺术家，一个擅长用光影来表现，另一个则用色彩来渲染。
哎，想象一下，如果这两位艺术家碰撞出火花，那画面简直美不胜收！2. 免疫荧光的特点2.1. 直观而美丽说到免疫荧光，它就像夜空中的星星，闪闪发光。
使用荧光染料，科学家可以把特定的蛋白质标记得明亮无比。
当你用荧光显微镜一看，哇，那画面简直惊艳。
就好像那些蛋白质在舞台上尽情演出，让你一眼就能认出它们的存在。
而且，这种方法特别灵敏，即便是微量的抗原也能被轻松捕捉到，简直是“神探”级别的。
2.2. 多重标记的魅力免疫荧光还有一个特别牛的地方，就是可以进行多重标记。
你可以同时标记多个不同的抗原，就像在一幅画中加入各种色彩，让整个画面更丰富多彩。
这样一来，你就能更全面地了解细胞或组织中的分子组成，真是一举两得。
想想看，研究人员通过免疫荧光，能像侦探一样，揭开细胞内的秘密，真是让人佩服得五体投地。
3. 免疫组化的特点3.1. 经典与传统再来说说免疫组化，虽然名字听上去有点复杂，但其实它是个老朋友了。
免疫组化的关键在于使用酶标记，经过一系列的染色反应，最后形成一种可见的颜色。
你可以把它想象成在纸上作画，经过精细的涂抹，最后呈现出一幅动人的作品。
很多时候，这种方法会用来观察组织切片，帮助医生诊断疾病，简直是医学界的“救星”。
3.2. 稳定而可靠免疫组化的另一个优点是它的稳定性。
一旦染色完成，图像就不会像免疫荧光那样随着时间的推移而消失，简直像一幅永恒的名画，值得细细品味。
虽然在灵敏度上可能不如免疫荧光，但在临床应用中，它的可靠性和稳定性可不是盖的。
所以说，免疫组化就像是那个老实本分的朋友，总是能在关键时刻提供帮助。
免疫荧光和免疫组化的相同点和不同点
免疫荧光和免疫组化是生物医学领域中常用的实验技术，它们在研究细胞和组织中蛋白质的表达和定位方面都发挥着重要作用。
虽然它们在某些方面有相似之处，但在其他方面又有明显的不同。
接下来，我将从深度和广度两个方面对免疫荧光和免疫组化进行全面评估，并撰写一篇高质量、深度和广度兼具的文章，以便您能更加全面、深刻地理解这两种实验技术。
深度上看，免疫荧光和免疫组化都是通过特异性的抗体与待检测蛋白质结合，从而实现对蛋白质检测的技术手段。
在免疫荧光中，待检测的蛋白质通常会与荧光素标记的抗体结合，形成荧光复合物，通过荧光显微镜或流式细胞术等来观察和分析。
而在免疫组化中，通过酶标记的二抗结合来对蛋白质进行检测，进而通过染色反应观察和分析。
两者均能够实现对蛋白质的高度特异性检测，但在技术操作和结果分析方面存在着一定的差异。
在广度上看，免疫荧光和免疫组化在研究领域中的应用也存在差异。
免疫荧光广泛应用于细胞生物学和免疫学研究中，因其高灵敏度和高分辨率的特点，常用于检测和定位细胞内蛋白质的表达和分布情况。
而免疫组化则更多用于组织学研究中，通过对组织切片进行染色反应，实现对蛋白质在组织结构中的定位和表达水平的分析。
两者在生物医学研究中各有侧重，但都对蛋白质研究提供了重要的技术支持。
免疫荧光和免疫组化在原理和应用上存在着一定的相似性和差异性。
深度上看，它们在技术操作和结果分析方面具有明显的差异；广度上看，它们在生物医学研究领域中的应用也存在差异。
然而，无论是免疫荧光还是免疫组化，都为蛋白质检测和定位提供了重要的实验手段，对于生物医学领域的发展具有重要意义。
在我的个人观点和理解方面，我认为免疫荧光和免疫组化作为生物医学研究中常用的实验技术，虽然在原理和应用上存在差异，但在实际研究中往往需要根据具体的研究目的和对象选取合适的技术手段。
在未来的研究中，可以通过结合这两种技术手段，实现对蛋白质表达和定位的更全面和深入的研究，为生物医学领域的发展提供更多的可能性。
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①防止标本从玻片上脱落；
②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗
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5min)
PBS冲洗 5min×3次
10%山羊血清封闭 37℃，50min
一抗
4 ℃ ,过夜
复温
37 ℃ ，1h
PBS 冲洗
5 min x3 次
二抗
30 min
PBS 冲洗
5 min x3 次
DAB显色
＜1min /(DAPI 5min)
PBS冲洗
(盖片，观察。)
苏木素复染 1min
自来水冲洗
脱水，透明，封片。
实验步骤
脱蜡水化：
二甲苯Ⅰ 20min
二甲苯Ⅱ 20min
无水乙醇Ⅰ 10min
无水乙醇Ⅱ 10min
95%乙醇 5min
80%乙醇 5min
75%乙醇 5min
50%乙醇 过一遍
蒸馏水
过三遍
高压修复 4min
流水冷却
PBS冲洗 5min×3次
3%H2O2 15 min，37 ℃/(0.5%Triton
4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
免疫组化常见问题的处理
标本无染色 ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂(一抗、二抗、三抗及底物等)。 ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和
DAB显色 一般住数盖秒片-数某分一钟拐，角胞，浆而蛋另白一可手以拿适对当
避光
复染
时面间的长那一个点拐，角而，胞接核近蛋封白片则液要近短端。 的拐角先降低，直至接触到液体 时为止
封片
石蜡切片在染色过程中出现脱片现象
1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时 间和提高烤片温度；
2）用含有多聚赖氨酸的玻片； 3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作 时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方， 让它流下冲洗组织；
抗原修复——原因 *常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时 分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等， 常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
实验原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有 高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的 一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗 体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 显色来 确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性 的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗 体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
免疫组化图片
免疫荧光图片
免疫组化与免疫荧光
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使 标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组 织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组 织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法； 用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原 法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体 球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结 合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少 应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。