(完整word版)BrdU免疫荧光、免疫组化增值检测方法
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康.特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1。
1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上.1。
2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1。
3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
(完整word版)免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
细胞增殖实验word版
细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。
目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。
在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。
1.DNA合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。
该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。
该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。
不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。
但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。
该方法的优点就是不再需要放射性物质。
BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。
2.代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。
在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。
可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。
四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。
MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。
因此，MTT 主要作为终点检测方法。
其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。
它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。
其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
EdU细胞增殖检测法的操作教程（附文献）
EdU细胞增殖检测法的操作教程
一、首先用 EdU 来标记细胞
注意:本实验样本是 Hela
细胞，如果使用其它类型的细胞，实验可能需要做调整。
建议 EdU 起始浓度是 10 M，或者根据细胞类型设置几个梯度预实验摸索zui佳EdU浓度，再进行正式实验。
1.在六孔板里的盖玻片上培养细胞，使其生长至所需密度后处理细胞；
2.用 10 mM EdU 溶液在无血清培养基中制备 2x EdU 工作溶液；
3.预热 2x EdU 溶液，然后将 2x EdU
溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中，获得 1x EdU
溶液。
例如，对于zui终浓度为 10 M 的溶液，可用 20 M EdU。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫荧光方法
免疫荧光方法免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
组织免疫荧光
免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。
1. 样品准备(Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。
也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。
这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。
对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
然后就可以进行后续操作。
如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。
对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。
无水乙醇5分钟，两次。
90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。
蒸馏水5分钟，两次。
抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。
2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。
固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。
3. 封闭(Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
(完整word版)常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：（注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟.3。
无水酒精Ⅰ 30秒。
4.无水酒精Ⅱ 30秒。
5.95%酒精Ⅰ 30秒。
6。
95%酒精Ⅱ 30秒。
7。
90％酒精 30秒.8.80%酒精 30秒.9.70％酒精 30秒.10.自来水洗。
（后面的切片脱蜡至水一般都是1—10）11。
0.3%H2O2甲醇处理切片10—20分钟。
12.水洗.13。
抗原修复.14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16。
摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次.18加入二抗孵育30分钟。
19。
PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21。
PBS洗3次，2分钟/次。
22。
DAB—H2O2孵育切片5—10分钟.23.PBS洗，水洗。
24。
Harris苏木素染核5—10分钟.25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)（Labelled streptavidim biotln)1。
切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10—20分钟.3。
水洗。
4。
抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8。
PBS洗3次,每次2分钟。
加入二抗,孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10。
加入SP复合物孵育20—30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12。
DAB—H2O2孵育5-10分钟。
13。
PBS洗，水洗。
14。
Harris苏木素染核5—10分钟。
15.水洗,分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0。
3％H2O2甲醇真空负压处理5min。
3。
水洗。
4。
如果需要,可进行抗原修复。
5。
PBS洗3次,每次1分钟。
6。
加入正常血清真空负压处理5min。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光总结步骤
免疫荧光总结步骤免疫荧光是一种广泛应用于生物学，医学和免疫学研究中的技术。
它利用免疫学原理和荧光色素来检测和定量分析对特定抗原具有特异反应的抗体。
以下是免疫荧光实验的基本步骤的总结，包括标本处理，抗体染色，显微镜观察和数据分析等。
1.标本处理：免疫荧光实验的第一步是准备样本。
这可能涉及到对细胞、组织、流体或血液样品进行处理，以获得要检测的目标抗原。
处理方法根据实验的目的和样本的性质而不同。
例如，对于细胞和组织样品，可以使用固定剂或冰冻剂来固定或保存目标抗原。
2.抗体染色：染色是免疫荧光实验中的关键步骤。
要进行染色，请使用已知与目标抗原结合的抗体。
这些抗体可以通过购买商业化的荧光标记抗体或自己标记的可溶性抗体。
抗体可以选择单克隆抗体或多克隆抗体，具体取决于实验的需要。
3.抗体交联：为了增强信号的强度和稳定性，必须进行抗体交联。
这意味着将荧光染料链接到抗体上，使其能够与目标抗原结合并发光。
通过选择适当的荧光标记剂和进行适当的染色条件，可以实现高灵敏度和特异性的检测。
4.样品处理：在进行显微镜观察之前，必须对样品进行适当的处理。
这可能包括去除非特异性背景信号，如细胞的内部自动荧光，以及对细胞进行固定或渗透处理，以使抗体能够进入细胞内部。
5.显微镜观察：准备好的样品被放置在显微镜载玻片上，并使用荧光显微镜观察。
荧光显微镜能够通过特定的荧光滤光片选择性地激发荧光标记染料，并观察其发射。
通过调整显微镜的焦距和放大倍数，可以获得目标抗原的高质量图像。
6.图像采集和分析：观察到的图像应该被摄取下来，并使用图像分析软件进行定量分析。
可以测量目标抗原的信号强度、定位和数量，并与对照组进行比较。
一些常用的图像分析软件还具有进一步处理和建模的功能，以获得更详细和精确的数据。
7.数据解释：最后，通过分析和解释数据来得出结论。
抗原的定量结果可以与其他实验结果进行比较，并根据研究的目的得出相关结论。
如果需要，可以使用统计学方法对数据进行进一步分析。
免疫荧光与免疫组化技术
一、组织病理学技术 与细胞病理学技术
• 2、细胞病理学技术： • 是以组织学为基础，研究组织碎片、细胞群团、
单个细胞形态和结构以及细胞间比邻关系，并探 讨组织来源的一门科学。
• 从阴道脱落细胞学到非妇科脱落细胞学，再到细 针穿刺细胞学，巴氏理论和技术对恶性肿瘤和癌 前病变的诊断起了重要作用。近年来，液基膜式 薄层细胞学技术和液基离心沉淀式薄层细胞学技 术代替传统的巴氏涂片，使宫颈低度病变和高度 病变的检出率有了显著提高。
七、激光扫描共聚焦显微术
• 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)又称粘附式细胞仪 ，是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础 上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所 观测的对象进行数字图像处理的一套观察、分析 和输出系统。
• LSCM技术具有高灵敏度、高分辨率等特点，可 进行定性、定量、定时、定位的分析测量。在形 态学观察方面，可对标本各层分别成像，对活细 胞行无损伤的“光学切片”，有“显微CT”之称 。LSCM在抗原表达、荧光定位、样本内部结构 等形态观察方面有着无可比拟的优势。
二、免疫荧光与免疫组化技术
• 2、免疫组化技术： • 免疫组织化学也称免疫细胞化学，是应用
标记抗体寻找组织细胞中抗原的方法来检 测组织细胞中化学成分的技术。 • 目前，免疫组化染色技术已广泛应用于医 学科研、临床诊断和鉴别诊断、肿瘤的生 物学行为及分型与起源判断、靶向药物筛 选、病原体检测等领域
三、分子病理学技术
十一、生物信息学技术
• 采用计算机科学、信息技术和数学的理论和方法 来研究生物信息的交叉学科。可进行生物学数据 的研究、存档、显示、处理和模拟，包括高通量 生物学数据分析、基因的功能注释和分类、蛋白 质相互作用网络构建、根据网络的拓扑性质挖掘 网络重要节点以及蛋白质及其突变体的空间结构 分析与模拟、核苷酸和氨基酸序列分析，新基因 的发现和蛋白质结构的预测等。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化检测CD34+的表达1基本原理免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
威斯腾生物 400-675-6758（1）1×PBS（pH 7.4， 2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；（7）DAB工作液（临用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀释贮存液1 mg/ml）。
（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。
2主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD) 浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台苏州净化设备公司TC2323型CO2恒温孵箱美国SHEL LAB 公司恒温烤箱上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) 美国Beckman公司抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海磁力搅拌器(79-1) 江苏江阴科研器械厂0.22um纤维素滤膜德国BM公司0.45um混合纤维素滤膜德国BM公司1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) 德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 美国细胞计数板上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUS CK-40) 日本倒置显微镜（OLYMPUS) 日本照像系统(OLYMPUS BH-2) 日本切片机：德国Leica展片机：德国Leica，HI1210型烤片机：德国Leica，HI1220型3实验方法3.1载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
免疫组化实验方法
1醛类固定剂：穿透性较强,收缩性小,是常用的固定剂.如10％中性福尔 马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等.
2非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定,常与戊二醛或多聚甲醛 混合使用.
3丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖,保存抗原性较好.但对低分子蛋白 质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差,和其它试剂混合使用加以 解决,如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等.
2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过, 尽可能的减少非特异性着色背景.加一抗前,用封闭液 可以是BSA或二抗来源的正常动物血清充分封闭,以阻 断非特异性结合位点.
3胞外区、胞内区.对于胞内区抗体,染色时需要使 用穿孔剂,而胞外区抗体不必使用.
22
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响,用于活体内标记, 结合物应无毒,附加抗原性小.
7
常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶 标法,亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段,则可 将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法 一步法、间接法二步法、桥连法等.每进行 一步结合反应.都会产生一次阳性结果的放 大效应.敏感性由高到低依次为桥连法、间 接法、直接法.
11
酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体, 再借酶对底物的特异性催化作用,生成有色的 不溶性产物,于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察.
• 常用的酶--辣根过氧化物酶HRP,碱性磷酸酶 ALP及葡萄糖氧化酶GOD等.
• 优点：与免疫荧光技术相比,终产物可在普通 光镜下观察,切片能够长久保存,经锇酸处理后, 电子密度增强,可用于电镜观察.
免疫荧光细胞化学染色方法
免疫荧光细胞化学染色方法免疫荧光细胞化学染色是一种常见的细胞分析方法，通过使用荧光标记的抗体来检测特定蛋白质在细胞中的表达情况。
该方法不仅能够检测蛋白质在细胞中的定位，还能提供关于蛋白质功能和相互作用的信息。
在本文中，我将详细介绍免疫荧光细胞化学染色方法的步骤、原理和应用。
免疫荧光细胞化学染色方法的步骤主要包括：样品处理、抗体染色、显微镜观察和图像分析。
首先，需要准备和处理细胞样品，通常包括固定和渗透化步骤。
这些步骤有助于维持细胞的形态和结构，并使细胞膜通透性增加，这样抗体才能够进入细胞内结合特定的蛋白质。
然后，将荧光标记的一抗添加到细胞样品中，并进行适当的孵育时间，使抗体能够与目标蛋白质结合。
接下来，在洗涤步骤中，需要将未结合的抗体和其他非特异性结合物清洗掉。
最后，在显微镜下观察样品，并使用图像分析软件进行定量分析。
免疫荧光细胞化学染色方法的原理基于抗原-抗体反应和荧光标记。
抗体是一种特异性结合到特定抗原的蛋白质。
在免疫荧光细胞化学染色中，抗体与目标蛋白质结合后，可以用荧光标记的二抗来准确检测该结合。
荧光标记的二抗可以与一抗结合，从而使目标蛋白质以荧光标记的形式可视化。
这样，可以在显微镜下用合适的光源激活荧光标记，然后通过滤光片选择性地观察和分析特定波长的荧光。
免疫荧光细胞化学染色方法在生物医学研究中具有广泛的应用。
一方面，它可以用来研究细胞的蛋白质定位和表达水平。
通过将不同荧光标记的抗体用于细胞中的不同蛋白质，可以同时观察多个蛋白质的表达情况和相互作用。
另一方面，这种方法还可以用于研究疾病的发生和发展机制。
通过比较正常细胞和病变细胞中蛋白质的表达差异，可以找到潜在的疾病标志物，并为疾病诊断和治疗提供重要的依据。
总结起来，免疫荧光细胞化学染色方法是一种重要的细胞分析技术，可以用于研究细胞的蛋白质表达、定位和相互作用。
通过使用荧光标记的抗体，可以准确地检测特定蛋白质的表达情况，并提供有关蛋白质功能和相互作用的信息。
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BrdU免疫荧光
取第三代细胞接种于六孔板中，在接种的基础培养基中加入BrdU(终浓度为20μmol/ml), 3d 后将细胞爬片行BrdU免疫荧光染色，倒置荧光显微镜观察。
免疫荧光检测步骤如下：1）固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min；2）变性：将固定好的细胞爬片PBS洗3次，每次5 min（摇床转速60）；2 mol/L的HCl室温下变性60 min；3）中和：0.1 mol/L的硼酸钠（PH8.5）中和10 min, PBS冲洗10 min, 3次；4)孵一抗：用1% BSA溶液稀释抗BrdU抗体至终浓度为6μg/ml，在细胞爬片上滴加150-300μL，37℃湿盒中孵育60 min；将孵好一抗的细胞爬片PBS洗10min，3次；5)孵二抗：用1% BSA溶液按1:600稀释FITC结合的goat anti-rabbit二抗，37℃湿盒中孵育60 min，将孵好二抗的细胞爬片PBS洗3次，每次10 min，注意避光；6)染核：每张爬片200μl浓度1ug/ml的DAPI溶液浸染3 min，PBS洗2次，每次5 min；7)封片：中性树胶封片，荧光显微镜观察。
BrdU免疫组化
（1）将制作的5μm厚的石蜡切片于60℃烘箱中烤片24 h。
（2）二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10 min。
（3）梯度乙醇水化各5 min，100%、95%、85%、75%乙醇。
（4）
（4）流水冲洗5 min。
（5）
（5）3%H2O2室温避光孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶的活性。
（6）
（6）PBS浸泡5 min，3次，在低速摇床上振摇水洗。
（7）
（7）加入0.1%胰酶抗原修复20min。
（8）
（8）PBS水洗2-3次，各5 min。
（9）
（9）山羊血清室温下封闭20min。
（10）
（10）封闭后倒去血清，勿洗，滴加按说明书稀释的一抗，4℃过夜或者37℃两小时。
（11）（11）PBS冲洗，5 min×3次。
（12）
（12）滴加1：100稀释的二抗，37℃孵育30 -60min，PBS冲洗，5 min×3次。
（13）（13）DAB显色，在显微镜下掌握染色的程度（一般约3-8s，无需看到组织变黄，组织变黄一般大部分已假阳性），流水冲洗5 min。
（14）
（14）苏木精复染2 min，1%盐酸酒精分化10-20s。
（15）
（15）脱水、透明，中性树胶封片。
（16）
（16）显微镜下观察，采集图片。
检验细胞增殖的检验方法：BrdU标记法
1、细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0 期。
2、终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。
3、弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。
4、甲醇/醋酸固定10min。
5、经固定的玻片空气干燥，0.3％H2 O2 -甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6、5％正常兔血清封闭。
7、甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8、冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。
（17）9、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。