《间接免疫荧光实验》PPT课件

４．第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加 样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物 薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30分钟。
５．清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流 不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装 有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5分钟。
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【注意事项】
1．每次试验应该设阳性和阴性对照。 2． 应注意荧光抗体的质量。 3． 标本应及时检测，并避光保存。
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以HEp-2细胞为基质检测ANA免疫荧光模式
均质型
颗粒型
核仁型
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核膜型
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实验报告
阴性：检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基
质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以 辨认的荧光模式
阳性：检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明
显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式
免疫荧光模式：阳性结果应报告
滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反
应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测
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阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最
适稀释因子为3.162（10的平方根），这样， 每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、 1:32、1:100、1:320、1:1000等）。
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６．加样：滴加20ul FITC标记的羊抗人IgG至洁净加样板的 反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意： 标记的IgG使用前需混匀。
７．第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水 纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面 朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不 要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好， 注意避免阳光直射载片。
试管等
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生物薄片
生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反 应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。
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滴定平板技术： 使实验操作标准化
将标本或试剂滴加 到加样板反应区上，然 后把生物薄片载片盖在 加样板的凹槽里，所有 生物薄片均与液滴接触， 反应同时开始.系统的几 何结构决定了液滴的位 置和高度.
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IIF操作步骤
１．准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂 盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要 触及生物薄片。用笔编号、标记。
２．稀释：用磷酸盐缓冲液1:100稀释血清。注意：阳性和阴 性对照不需稀释，使用前要混匀
３．加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀 释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完 所有待测标本后才开始温育。
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荧光二抗
荧光素及其激发波长和发射波长
荧光素
异硫氰酸荧光素 （FITC）
发射的 荧光色
绿
激发波长 （nm）
495
发射波长 （nm）
528
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荧光显微镜：
落射式荧光显微镜
①不需要额外的聚光镜 ②可产生高对比度的暗视野 ③同时进行明视野、暗视野 的抗原基质定位 ④可观察两种不同的荧光 ⑤可改变荧光的强度
间接免疫荧光实验
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实验原理
固定在载片上的灵长类肝组织和HEp-2细胞 与适当稀释的待检血清反应后,如果待检血 清中有ANA,就会与细胞核成分特异结合,加 入FITC标记的的羊抗人IgG抗体又可与ANA 结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现 荧光。
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试剂与器材
1.抗原片 2.荧光标记的二抗 3.PBS-Tween缓冲液 4.阴、阳性参考血清 5.封片介质:磷酸盐缓冲甘油 6.盖玻片 7.器材:荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸管、
８．清洗：同上。 ９．封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加10ul封
片介质至盖玻片每一反应区。从磷酸盐缓冲液中取出一张 载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。 将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上， 立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。 １０．结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。