间接免疫荧光法检测自身抗体
间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析
( 3 ) , I I F — ANA 一 / L I A一 8 8例 ( 8 8 ) , 总体符 合 率 9 O 。AI D 纽 与 非 AI D 组 自身抗 体 的检 测 结果 比较 差异 有统 计 学意 义 。③ I I F - A NA 一 / L I A+组 中 , 以抗 S S A 抗体 、 抗 Ro 一 5 2抗 体 、 抗 d s — D NA 抗
ABS TRACT Ob j e c t i v e :To e x p l o r e t h e c o r r e l a t i o n o f t h e s p e c i f i c a n t i b o d y r e s u l t s b e t we e n s c r e e n i n g t e s t o f
An a l y s i s O f a u t 0 a nt j b O d i e s d e t e c t i o n b e t we e n i n di r e c t
i mmu n o f l u o r e s c e nc e me t h o d a nd l i n e a r we s t e r n b l o t me t h o d
抗核抗体的检测方法及原理
抗核抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA测定法和免疫印迹测定法。
以下是这些方法的简要介绍和原理:
1.间接免疫荧光法:此方法是检测抗核抗体的常用方法之一。
原理是将待测标本与细胞底物片(如HEp-2细胞)的相应抗原进行反应,然后加入
荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体(通常为抗IgG抗体),形成抗原-抗体-荧光二抗的复合物。
通过荧光显微镜观察,可以判断待测标本中是否存在针对细胞相关抗原的自身抗体。
2.放射免疫法:此方法常用于检测抗DNA抗体。
原理是用同位素标记DNA,与被检血清中的抗DNA抗体结合,然后通过沉淀和对比沉淀物与上
清液中的放射活性,得到DNA的结合活性。
结合率高于一定值(通常为20%)则判断为阳性。
3.ELISA测定法:即酶联免疫吸附法,是一种常用的固相酶免疫测定方法。
原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗去,最后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。
4.免疫印迹测定法:此方法是将混合的抗原作为凝胶电泳分离,然后转印到硝酸纤维素的薄膜上,再用标记抗体进行检测和分析。
以上各种方法都有其特点和适用范围,可以根据实验需求和条件选择合适的方法进行检测。
自身免疫性肝病(AILD)相关自身抗体的检测及临床应用
四、AILD相关自身抗体的检测
1、间接免疫荧光法(IIF)
③抗LKM-1抗体:肝组织可见肝细胞胞质细颗粒型至均质型 的强荧光染色;肾组织仅在近端肾小管上皮细胞胞质荧光染 色;胃组织缺乏特征性的荧光染色。
④抗LC-1抗体:肝组织可见肝细胞胞质颗粒型荧光染色,啮 齿类动物肝组织中央静脉周围的荧光染色明显减弱,但若同 时存在抗LKM-1抗体阳性,此荧光特征通常难以呈现。肾、 胃组织缺乏特征性的荧光染色。
三、AILD相关自身抗体检测的临床应用
在PBC患者一级亲属中,母女、姐妹间AMA的共同阳性率为 10%~20%,远高于普通人群。因此,在PBC患者的亲属中检 测AMA等自身抗体,有利于疾病的早期发现。AMA阳性但 不能明确诊断PBC者,需定期行胆汁淤积相关生化指标的随 访。
总之,检测自身抗体可用于AILD的预测,对肝脏生化指标正 常且AILD相关自身抗体(如ASMA、AMA等)阳性者,应 定期随访,以及进行相关学会指南推荐的其他评估肝脏功能 的新标志物检测,如可预测肝功能正常或轻度异常者的肝硬 化、肝纤维化程度的血清壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)等, 以早期评价肝胆功能,或采取其他临床干预措施。
1、间接免疫荧光法(IIF)
(2)标本、荧光标记二抗:IIF检测血清标本的ANA、 ASMA、抗LKM-1抗体、AMA通常采用1∶40起始的倍比稀 释系统。由于使用不同的检测试剂,可根据试剂说明书,采 用倍比稀释系统或 稀释系统。所用二抗应使用荧光素标记的 抗人IgG抗体。
四、AILD相关自身抗体的检测
四、AILD相关自身抗体的检测
2、其他免疫学方法
由于IIF检测AILD相关自身抗体的实验操作、结果判断等存 在难以标准化,阳性滴度判断依赖于不同的实验基质。因此, IIF检测AILD相关自身抗体需要经过专业培训的实验室人员 和高质量的实验基质。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤:
1.样品准备:根据待测样本类型(如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等)
进行相应的处理。
对于贴壁细胞,需将洁净的盖玻片进行浸泡处理,并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞,可以先进行固定步骤,然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片,需进行相应的处理。
2.固定:固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭:封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合,常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育:根据一抗的说明书,按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗,吸水纸吸尽封闭液后,每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育:滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液,使其完全覆盖
标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间。
取出玻片,洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察:立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),
即可判定为阳性。
请注意,这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程,实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问,建议咨询专业人士。
间接免疫荧光试验的基本原理
间接免疫荧光试验的基本原理
间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,简称IFA)是一种检测抗体的方法。
其基本原理是利用荧光标记的抗人类IgG二抗与被检物中的抗体结合,形成抗原-抗体-荧光二抗复合物,通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和分布情况,来判断被检物中是否存在特定抗体。
具体操作步骤如下:
1. 准备样本:收集被检测物质,如血清、尿液、组织、细胞等。
2. 制备标记荧光素的抗人类IgG二抗:将荧光素标记的二抗与人类IgG反应,制备出荧光素标记的抗人类IgG二抗。
3. 处理被检测物质:将被检测物质加入载玻片上,用荧光素标记的抗人类IgG 二抗处理,使其与被检测物中的抗体结合。
4. 观察荧光信号:在荧光显微镜下观察样本中荧光信号的强度和分布情况,判断被检测物中是否存在特定抗体。
IFA方法具有灵敏度高、特异性强、可同时检测多种抗体等优点,广泛应用于医学、生物学和病毒学等领域中的抗体检测和诊断工作中。
自身抗体检测的常用方法及流程
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1. 酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
ana检测方法
ana检测方法ANA检测方法。
ANA(抗核抗体)是一种自身免疫性疾病的重要指标,其检测方法对于诊断和治疗自身免疫性疾病具有重要意义。
目前,常见的ANA检测方法包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、间接免疫荧光法。
间接免疫荧光法是目前最常用的ANA检测方法之一。
其原理是将待检血清与细胞抗原结合,然后用荧光标记的抗人球蛋白抗体进行染色,通过荧光显微镜观察是否存在抗核抗体。
操作步骤为,将待检血清与细胞抗原混合,孵育后洗涤,再加入荧光标记的抗人球蛋白抗体,最后洗涤并观察荧光显微镜下的荧光情况。
二、酶联免疫吸附法。
酶联免疫吸附法是利用酶标记的二抗或抗原与待检血清中的抗体结合,再加入底物,通过酶的反应产生显色反应来检测抗体的方法。
操作步骤为,将待检血清加入包被抗原的微孔板中,孵育后洗涤,再加入酶标记的抗人球蛋白抗体,最后加入底物并测定吸光度。
三、免疫印迹法。
免疫印迹法是利用抗体与抗原特异性结合的原理,通过电泳将待检血清中的抗体与抗原分离,再转膜到膜上,用荧光素等进行染色来检测抗体的方法。
操作步骤为,将待检血清进行电泳分离,再将分离的蛋白转膜到膜上,用特异性抗体结合后再进行染色观察。
综上所述,ANA检测方法有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法和免疫印迹法等多种。
每种方法都有其特定的原理和操作步骤,能够准确、快速地检测出抗核抗体的情况。
在临床诊断中,医生可根据具体情况选择合适的检测方法,以辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
以上就是关于ANA检测方法的介绍,希望对您有所帮助。
ANA的检测方法对于自身免疫性疾病的诊断和治疗具有重要意义,因此在临床实践中需要严格按照操作规程进行检测,以确保结果的准确性和可靠性。
感谢您的阅读!。
自身抗体监测
自身免疫抗体的检测抗核抗体(ANA):经典定义是针对细胞核成分的自身抗体的总称;但现代定义已不局限于细胞核内,而扩展到整个细胞,是针对核酸和核蛋白抗体的总称。
其靶抗原包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞周期蛋白等全部细胞成分。
间接免疫荧光法是检测ANA的标准方法:HEp-2细胞和猴肝细胞。
单特异性检测需进行ELISA检测1.ANA核均质型:对应靶抗原:dsDNA、ssDNA、核小体、组蛋白HEp-2细胞猴肝细胞dsDNA:仅出现在SLE中,阳性率60-90%。
健康人中检测到该抗体,其中85%的人5年内可能会发展为SLE。
免疫荧光法对SLE特异性高,但敏感性不高,因此临床高度怀疑SLE的患者建议行ELISA检测,ELISA方法敏感性更高,但特异性略差。
抗组蛋白抗体:主要见于药物诱导的红斑狼疮(95%)此外还见于30-70%的非药物诱导的红斑狼疮及15-50%的RA。
抗核小体抗体:是SLE非常特异的标志性抗体,与疾病活动度相关,多见于活动性狼疮特别是LN中。
对SLE的特异性几乎为100%,敏感性为58-71%,敏感性较抗DsDNA高。
SLE的检出率。
2 .ANA核粗颗粒型:靶抗原:nRNP Sm荧光模型特征:HEp-2细胞:间期细胞核阳性,呈颗粒样荧光,核仁阴性;分裂期细胞浓缩染色体阴性,染色体周围为颗粒样荧光。
猴肝:肝细胞核阳性,呈颗粒样荧光;核仁阴性。
HEp-2细胞猴肝细胞抗U1-nRNP抗体: 是MTCD的标志抗体,阳性率95-100%,滴度与疾病活动度相关。
抗U1-nRNP也可出现于SLE中,但几乎总伴有抗Sm抗体。
抗Sm抗体在SLE中阳性率5-30%。
3.ANA核细颗粒型:靶抗原:SS-A和SS-BHEp-2:间期细胞核阳性,呈细颗粒样荧光,部分核仁阳性;分裂期细胞浓缩染色体阴性,染色体周围区域颗粒样荧光。
猴肝:肝细胞核呈颗粒样荧光;部分核仁阳性。
但荧光强度比HEp-2细胞弱,抗体滴度低时,可呈阴性反应(与核粗颗粒型不同)。
抗核抗体检测原理
抗核抗体检测原理抗核抗体是指针对细胞核内物质(包括核糖体、线粒体等)的自身免疫抗体。
抗核抗体检测在临床上广泛应用于风湿免疫系统疾病的诊断和鉴别诊断。
抗核抗体检测原理主要是通过ELISA或间接免疫荧光法等技术,检测患者血清中的自身免疫抗体与核抗原结合的情况,来判断是否存在自身免疫反应。
抗核抗体检测的方法有多种,本文将重点介绍ELISA和间接免疫荧光法。
一、ELISA法检测原理ELISA法是酶联免疫吸附试验,又称酶标法。
其检测原理基于抗原与特异性抗体的反应,在一个特定的底物上标记酶使其可定量测定。
ELISA法的具体操作步骤如下:1. 将核抗原制备成微孔板的包被抗原,加入标准物、阳性及阴性对照和待检血清。
2. 洗涤掉未结合物,加入人抗IgG酶标记物,形成抗体-抗原-酶复合物。
3. 清洗掉未结合的抗体,加入底物与显色剂,使酶与底物反应所生成的色素可量化。
4. 通过光密度计测定每个孔的发光程度,根据标准曲线计算出各样本抗体的浓度。
二、间接免疫荧光法检测原理间接免疫荧光法又称间接荧光抗体法,其检测原理是使用荧光标记的细胞核物质(如正常人淋巴细胞的核)作为抗原,检测待测血清中的自身抗体结合情况。
具体操作步骤如下:1. 将正常人淋巴细胞制成薄片,用甲醛固定,形成抗原。
2. 加入待检血清,其中若存在抗核抗体,会与抗原结合形成复合物。
3. 再加入荧光标记的抗人IgG抗体,以荧光染色,并进行显微镜观察。
4. 观察样本的荧光染色程度、荧光颗粒的类型和形态、分布情况等,以判断是否存在抗核抗体的阳性反应或抗核抗体水平的高低。
三、应用抗核抗体检测可以用于如系统性红斑狼疮、硬皮病、混合型结缔组织病等自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断。
对于一些具有高度特异性的抗核抗体或特定细胞核抗原,如抗ds-DNA(双链DNA)抗体,根据抗体阳性水平还可以预测某一个病人的病情的严重程度和治疗效果。
高滴度抗核抗体可预示病情活动度高,反之即预示病情不活跃,治疗效果好等。
抗核抗体诊断标准
抗核抗体诊断标准抗核抗体(ANA)诊断标准是根据患者血清中是否存在自身免疫系统产生的抗核抗体来确定。
抗核抗体是针对细胞核中的结构和分子的抗体,其存在可以提示患者可能存在某些自身免疫性疾病。
一般来说,抗核抗体检测是通过间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)来进行的。
在此方法中,患者血清中的抗核抗体与人类细胞核抗原结合,在荧光显微镜下观察是否出现荧光染色。
如果有荧光染色,则说明患者存在抗核抗体。
根据国际抗核抗体标准化组织(International Consensus on Antinuclear Antibody Patterns, ICAP)的建议,抗核抗体的结果应该按照和特定疾病的关联性进行评估。
常见的抗核抗体模式有以下几种:1. 核周型(Perinuclear pattern, P-ANCA):可提示相关的抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)相关性疾病,如Wegener肉芽肿。
2. 斑点型(Speckled pattern, S-ANA):常见于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、结缔组织病(connective tissue diseases)等。
3. 核周环型(Nucleolar pattern):常见于硬皮病(systemic sclerosis, SSc)等。
4. 角质层型(Epithelial pattern):常见于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等。
需要注意的是,抗核抗体阳性并不代表一定存在自身免疫性疾病,还需要结合临床症状和其他实验室检查结果来综合评估。
因此,对于抗核抗体阳性的患者,通常需要进一步进行深入的检查和评估才能确定是否存在自身免疫性疾病。
自身抗体的实验室检测及临床意义
自身抗体的实验室检测及临床意义自身抗体是指人体免疫系统错误地将自身组织识别为外来入侵物质,从而产生针对自身抗原的抗体。
这些自身抗体可以通过实验室检测来鉴定和定量化,并且具有重要的临床意义。
一、实验室检测实验室检测自身抗体可以通过以下几种常见的方法进行:1.免疫荧光法:该方法通过将被检测物质与标记有荧光的抗体结合,然后观察荧光反应的强度和模式来确定是否存在自身抗体。
例如,典型的抗核抗体(ANA)检测就是采用免疫荧光法。
2.酶联免疫吸附测定法(ELISA):该方法利用酶反应来检测自身抗体的存在。
将被检测物质与特异性抗体结合,然后加入酶标记的抗人免疫球蛋白,再加入底物使酶反应产生颜色变化,通过测定颜色的强度来确定是否存在自身抗体。
3.凝集试验:该方法利用自身抗体对存在抗原的物质进行凝集,观察凝集的程度来确定是否存在自身抗体。
例如,类风湿因子(RF)的检测就是采用凝集试验。
这些实验室检测方法能够对特定的自身抗体进行检测和定量化,从而帮助医生做出医学诊断并制定相应的治疗方案。
二、临床意义检测自身抗体的临床意义非常重要,主要体现在以下几个方面:1.诊断自身免疫性疾病:自身抗体的产生与自身免疫性疾病密切相关,例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、甲状腺自身免疫性疾病等。
通过检测自身抗体,可以帮助医生诊断这些疾病,并确定疾病的类型和严重程度。
2.监测疾病活动和预测预后:一些自身抗体的水平在疾病发作期间会增高,在缓解期间会降低。
因此,定期监测自身抗体的变化可以帮助医生判断疾病的活动程度,并预测预后。
3.指导治疗:一些自身抗体与特定的治疗方法和药物敏感性相关。
通过检测自身抗体,可以帮助医生选择最合适的治疗方案,并预测治疗的有效性。
4.预防疾病发展:有些自身抗体出现在疾病发展的早期阶段,通过早期检测这些抗体,可以帮助医生及时干预和预防疾病的进展。
总之,实验室检测自身抗体具有重要的临床意义,可以帮助医生精确诊断自身免疫性疾病,监测疾病的活动程度和预测预后,指导治疗和预防疾病发展。
自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见
自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见发表时间:2020-12-21T07:35:56.126Z 来源:《健康世界》2020年13期作者:窦荣荣[导读] 自身抗体测定在自身免疫病诊断及鉴别诊断中具有重要作用。
目前,自身抗体检测已在国内临床上普遍开展,其检测方法、试剂质量、仪器设备和操作人员等因素,直接关系到检测结果及报告质量,可能影响临床医师对结果的判断和解读。
窦荣荣空军军医大学第一附属医院临床免疫科陕西西安 710032摘要:自身抗体测定在自身免疫病诊断及鉴别诊断中具有重要作用。
目前,自身抗体检测已在国内临床上普遍开展,其检测方法、试剂质量、仪器设备和操作人员等因素,直接关系到检测结果及报告质量,可能影响临床医师对结果的判断和解读。
关键词:自身免疫病;抗体检测;方法一、自身免疫病诊断抗体检测的必要性自身抗体是指针对自身组织,器官、细胞及细胞成分的抗体。
人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持,正常的免疫反应有保护性防御作用,即对自身组织、成分不发生反应。
—旦自身耐受的完整性遭到破坏,则机体视自身组织、成分为“异物”,而发生自身免疫反应,产生高滴度的自身抗体时,对自身组织产生损伤,导致自身免疫病发生,出现贫血,肝功能也不好,腰疼,关节疼,天冷手指发白,口干、眼干等临床表现。
自身免疫性疾病的特点之一是与全身多系统多器官有所关联,自身抗体主要用于自身免疫性疾病的检测,但同时也会也牵扯到其他疾病。
自身抗体和肿瘤等其他疾病的关联,目前也成为研究中的热点,而且已经有成果应用到临床上。
例如,肌炎病人如能够查出自身抗体呈阳性,继发恶性肿瘤的可能性甚至高达50%-70%;再如干燥综合征病人继发淋巴瘤的风险很高。
有研究表明,自身免疫性疾病与一些常见的心血管疾病也有很大相关性。
研究发现,很多指标在疾病产生之前就已经发生了异常变化;自身免疫性疾病能否尽早地得到诊断治疗,与其预后密切相关。
例如,类风湿关节炎如果能够得到及时的诊断治疗,就能避免发病之后的关节变形,使病人免受坐轮椅的痛苦。
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法是一种常用的检测技术,广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
其原理基于抗体和抗原的特异性结合。
首先,在间接免疫荧光法中,我们需要一个目标分子的抗体,这个抗体通常被称为第一抗体。
第一抗体是由动物(如小鼠)制备的,它能够与待检测的目标分子(如特定蛋白质)发生特异性结合。
然后,我们需要一个与第一抗体相对应的二抗(第二抗体)。
二抗是由动物(如兔子)制备的抗体,它能够与第一抗体结合形成免疫复合物。
在免疫检测中,我们通常会将目标分子标记上荧光染料。
这样,在荧光显微镜下观察时,我们就能够看到目标分子的荧光信号。
具体操作时,将待检测的样本与第一抗体一起孵育。
如果样本中存在目标分子,第一抗体就会与目标分子结合。
接下来,我们加入与第一抗体相对应的荧光标记的二抗。
这样,二抗就会结合到已经与目标分子结合的第一抗体上,形成免疫复合物。
随后,通过荧光显微镜观察样本。
由于荧光染料的存在,目标分子会发出荧光信号,从而在显微镜下观察到荧光标记的信号。
通过测量荧光信号的强度和分布情况,我们就能够间接地推断
样本中是否存在目标分子,并进一步研究其功能和表达情况。
总的来说,间接免疫荧光法利用抗体-抗原的特异性结合和荧光标记的二抗,实现了对目标分子的检测和定量分析。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性,被广泛应用于生物医学研究和临床实验室中。
ana检测方法
ana检测方法Ana检测方法。
在生物医学领域,ana检测是一项非常重要的实验技术,它可以用来检测人体内自身抗体的存在情况,帮助医生诊断各种自身免疫性疾病。
而ana检测方法的准确性和可靠性对于疾病的诊断和治疗至关重要。
下面将介绍几种常用的ana检测方法。
首先,间接免疫荧光法是一种常用的ana检测方法。
该方法通过将患者的血清与组织切片或细胞标本结合,然后使用荧光显微镜观察是否出现荧光抗体标记的细胞核。
这种方法对于多种自身免疫性疾病的诊断具有很高的敏感性和特异性,因此被广泛应用于临床实验室。
其次,酶联免疫吸附试验(ELISA)也是一种常用的ana检测方法。
这种方法通过将患者的血清与抗原结合,然后使用酶标记的二抗结合,最终通过底物的反应来检测抗体的存在情况。
ELISA方法操作简单、灵敏度高,可以同时检测多种抗体,因此在临床诊断中得到了广泛应用。
另外,免疫印迹法(Western Blot)也是一种常用的ana检测方法。
该方法通过将患者的血清中的抗体与特定抗原结合,然后通过电泳和转膜技术将抗原分离并转移到膜上,最后使用特异性荧光素标记的二抗来检测抗体的存在情况。
这种方法对于多种抗体的检测具有很高的特异性和准确性,因此在临床诊断中得到了广泛应用。
最后,流式细胞术也是一种常用的ana检测方法。
该方法通过将患者的外周血细胞与荧光标记的抗体结合,然后通过流式细胞仪来检测抗体的存在情况。
这种方法操作简单、快速,可以同时检测多种抗体,因此在临床实验室中得到了广泛应用。
综上所述,ana检测方法在临床诊断中具有非常重要的意义。
不同的检测方法各有优缺点,医生需要根据具体的临床情况来选择合适的检测方法。
未来随着生物医学技术的不断发展,相信会有更多更准确、更可靠的ana检测方法出现,为自身免疫性疾病的诊断和治疗提供更多的帮助。
自身免疫性疾病的临床检测
自身免疫性疾病的临床检测摘要】目的讨论自身免疫性疾病检测。
方法对采集到的样本进行检测。
结论某些原因削弱或破坏健康人的自身免疫耐受,免疫系统就会对自身组织或成分产生免疫应答,这被称为自身免疫。
由于自身免疫而产生的疾病被称为自身免疫病。
诊断自身免疫病的重要方法是做自身免疫检测。
【关键词】自身免疫性疾病检测某些原因削弱或破坏健康人的自身免疫耐受,免疫系统就会对自身组织或成分产生免疫应答,这被称为自身免疫。
由于自身免疫而产生的疾病被称为自身免疫病。
诊断自身免疫病的重要方法是做自身免疫检测。
一、类风湿因子(RF)测定【参考值】<30U/ml【临床意义】1.RF对类风湿关节炎的诊断及预后判断具有一定的临床意义,RF转阴或含量降低,可作为评价药物治疗及病情缓解的一个指标。
70%~90%的类风湿关节炎(RA)患者RF阳性,但RF阴性不能排除RA诊断。
2.RF可作为自身免疫性疾病的辅助诊断,如RF阳性率SLE为53%,皮肌炎、硬皮病及恶性贫血均为80%,自身免疫性溶血型贫血为75%,慢性活动性肝炎为60%,舍格伦(干燥综合征)可达90%~100%。
3.慢性感染性疾病RF也可呈阳性,如亚急性细菌性心内膜炎、结核、梅毒、及某些高球蛋白血症等。
4.各种不同类型RF的检出具有不同的临床意义。
IgG类RF与RA患者的滑膜炎、血管炎症状密切相关;IgA类 RF与RA患者关节外症状有关;IgM类RF的含量与RA的活动性无密切关系;IgE类RF见于RA和青年型RA,在关节液和胸腔积液中IgE类RF高于同一患者的血清水平。
【注意事项】1.不抗凝静脉血标本检测。
2.标本避免脂血、溶血。
3.健康人有5%的人RF阳性,70岁以上的人阳性率甚至高达10%~25%,但临床意义不明。
二、自身抗体测定(一)抗核抗体(ANA)【参考值】阴性(ANA滴度≤1:100) (间接免疫荧光法)【临床意义】1.用于临床自身免疫性疾病的辅助诊断,在不同疾病中,特别是风湿性疾病有诊断价值。
间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测分析
间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测分析摘要】:目的:研究并探讨间接免疫荧光法(IIF)与线性免疫印迹法(LIA)对自身抗体的检测价值。
方法:于2013年1月~2015年10月,随机选取100例自身免疫性疾病患者和100例非自身免疫性疾病患者进行研究,分别设置为AID组、非AID组,对这200例患者进行间接免疫荧光法检测,检测其自身抗体,对间接免疫荧光法检测结果为阴性的患者进行线性免疫印迹法检测。
结果:AID组中的IIF阴性/LIA阳性表达患者所占比例较之非AID组明显更高(P<0.05),而IIF阴性/LIA阳性表达的患者中,AID组的LIA(+)和LIA(±)患者所占比例均高于非AID组(P<0.05)。
结论:在自身免疫性疾病的临床诊断过程中,在采用间接免疫荧光法检测后,还应对间接免疫荧光法检测为阴性的患者进行线性免疫印迹法检测,以减少漏诊,提高自身免疫性疾病的诊断准确性。
【关键词】:自身免疫性疾病;抗核抗体;间接免疫荧光法;线性免疫印迹法本次研究为了探讨间接免疫荧光法(IIF)与线性免疫印迹法(LIA)对自身抗体的检测价值,特选取100例自身免疫性疾病患者和100例非自身免疫性疾病患者进行研究,先进行间接免疫荧光法检测,对间接免疫荧光法检测结果为阴性的患者进行线性免疫印迹法检测,并对检测结果进行分析。
现整理分析如下。
1一般资料和研究方法1.1一般资料于2013年1月~2015年10月,随机选取100例自身免疫性疾病患者和100例非自身免疫性疾病患者进行研究,分别设置为AID组、非AID组,AID组:均被确诊为自身免疫性疾病,男女患者的性别分布比例为48:52,年龄分布于25~65岁之间,平均年龄为(46.72±18.40)岁。
非AID组:均排除自身免疫性疾病,男女患者的性别分布比例为50:50,年龄分布于23~69岁之间,平均年龄为(46.82±18.41)岁。
间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析
间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析王梦涛;赵婵媛;刘小玲;卢春利;王锐【摘要】目的:探讨自身特异性抗体筛查试验间接免疫荧光法(IIF)与确认试验线性免疫印迹法(LIA)检测结果的相关性。
方法:用 IIF 法作为抗核抗体(ANA)的筛查试验,用 LIA 法作为抗核抗体谱(ANAs)特异性抗体的确认试验,对自身免疫性疾病组(AID)及非 AID 疾病对照组进行检测分析,并将检测结果分为四组:IIF-ANA+/LIA+组,IIF-ANA+/LIA-组,IIF-ANA-/LIA+组和 IIF-ANA-/LIA-组。
结果:①在611例 AID 组中,IIF-ANA+/LIA+336例(55%),IIF-ANA+/LIA-116例(19%),IF-ANA-/LIA+55例(9%),IIF-ANA-/LIA-104例(17%)。
②在100例非 AID 组中,IIF-ANA+/LIA+2例(2%),IIF-ANA+/LIA-7例(7%),IIF-ANA-/LIA+3例(3%),IIF-ANA-/LIA-88例(88%),总体符合率90%。
AID 组与非 AID 组自身抗体的检测结果比较差异有统计学意义。
③ IIF-ANA-/LIA+组中,以抗 SSA 抗体、抗Ro-52抗体、抗 ds-DNA 抗体、抗组蛋白抗体、抗 Jo-1抗体为主要检测出的阳性自身抗体。
AID 组 IIF-ANA+/LIA-中,ANA检测核型以均质型、斑点型为主,混合核型以均质斑点型为主,荧光检测滴度以1∶40~1∶320为主;非 AID 组 IIF-ANA+/LIA-中,核型以斑点型为主,荧光滴度以1∶40~1∶320为主。
结论:AID 患者可能会出现 IIF-ANA 检测阳性而 LIA-ANAs 检测阴性或者 IIF-ANA 检测阴性而LIA-ANAs 检测阳性,检查除了进行 IIF 筛查 ANA 外,还需进行自身抗体谱的特异性抗体确认实验。
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(二)实验操作的标准化滴定平板技术
实验标准化流程为滴加样品、标记抗体至加样板,然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里,这时,载片上的所有生物薄片均与液滴接触,反应同时开始。因为液体被局限在一封闭的空间,不再需要传统“湿盒”,可同时在一致的反应条件孵育大量的标本。下面以间接免疫荧光法为例,介绍滴定平板技术的操作过程:
间接免疫荧光法保留了原基质的完整抗原谱,因而可同时检测大量抗体.获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体),或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时,就应该选择免疫荧光法。另外,应用免疫荧光法还可检测到一些至今未知的抗体。
在没有荧光显微镜时,可尝试用酶标记的第二抗体代替荧光标记的抗体,但是检测的质量会明显下降。因为在免疫荧光法中,指示剂染色是通过抗体直接结合在细胞抗原上产生的,而免疫酶法,染色则是弥散地围绕在抗原周围的区域。因此免疫酶法并不总是像免疫荧光法那样能区分抗原分布的细小差别。而且应用酶染色时,会导致许多自身抗体不能被区分或根本测不到。仅应用细胞核制备物免疫酶染色的纯光度法评价也是不可取的,因为这不可避免地导致一些自身抗体被漏检。
9.封片加甘油/PBS至盖玻片,每一反应区约10ul。从pBS-Tween缓冲液取出一张载片,用纸擦干背面和四边,注意不要擦拭反应区间鲸。将盖玻片轻轻盖在载片上。
10.结果判断 荧光显微镜下观察荧光。
(三)抗体检测的质量控制及注意事项
l.质量控制 自身抗体检测的质量控制是用多种手段对自身抗体存在与否、浓度的多少进行控制和评价,有利于实验室内部、实验室之间对同一标本获取相同具有可比性的结果,是衡量实验室检测水平的一个重要指标。然而.自身抗体检测的质量控制,并不是一件容易的工作。因为不同实验室所用的抗原基质存在差异、抗原的固定方法有差异或不同,血清的稀释方法不同以及操作者对不同荧光模式的识别能力不同等,均可影响到自身抗体的检酒质量。实验室在进行临床检测时,应同时检测阳性对照、阴性对照,以监测结果的准确性。国内急需成立专门的学术机构,参照国际标准,与国际接轨,建立自己当地的标准,开展自身抗体检测的质量控制。
间接免疫荧光法检测自身抗体
自身抗体诊断的标准技术是间接免疫荧光法,其特点是特异性强,阳性与阴性样品的信号强度对比明显,通过显微镜观测能够精确地判断组织或细胞内荧光的分布。自身抗原的位置决定了其相应抗体的典型的荧光模式,所有与此典型模式不相关区域的染色被认为是非特异性染色。即使偶尔伴有强的非特异性染色,但弱的特异性信号也能够被识别。间接免疫荧光法不需要复杂、费时的化学制备程序,而酶联免疫吸附测定等实验,要取得高特异性则必须提取和纯化抗原,并将其吸附于固相载体上,如果抗原不纯,则相关抗体会出现假阳性结果。
3.实验报告及解释
(1)阴性:在整个检测系统(包括各种质控)正常的情况下,当待检标本在合适的起始稀释度下,实验基质没有明显的荧光染色,或没有可辨认的荧光模型时,称此待检的血清样本的某种自身抗体阴性。
(2)阳性:整个检测系统(包括各种质控性对照的特异荧光,且有明鲜可以辨认的荧光模式,称此待检血清标本的某待检抗体阳性。
4.第一步温育 将载片贴有基质的一面朝下盖在加样板的凹糟里,反应即开始。室温下温育30分钟。
5.冲洗 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗载片1秒钟(注意水流不要太急,不要直接对着基质),然后立即将其浸入装有PBS-Tween缓冲液的小杯,浸洗至少1分钟。
6.加样滴加20ul异硫氰酸荧光素标记的抗人球蛋白至一洁净加样板的反应区,完全加完方可继续温育。异硫氰酸荧光素标记抗人球蛋白使用前需混匀,用PBS-Tween缓冲液稀释。
实验室工作者需要经过一定的专业训练并不断实践,方可胜任荧光显微镜下的读片工作。显微镜下的结果判断,为综合知识的体现,到目前为止,尚没有任何仪器可取代人工读片。
(一)实验基质的选择和血清的稀释度
1.实验基质的选择用间接免疫荧光法对自身抗体进行测定的效果,在很大程度上取决于基质的质量(包括基质本身的质量及制备的质量)。这些实验基质,通常是用动物或人类的细胞或组织,经一系列方法进行处理,如Hep-2细胞的培养、吸附和固定,玲冻组织切片的制备、贴片等。国内不少实验室仍在自制实验基质,这已越来越不适应实验标准化、规范化、现代化的需要,建议应尽可能选择生产工艺先进、质控措施严格的商品化试剂盒,以保证实验结果准确可靠。检测不同的自身抗体应选择不同来源的实验基质(不同动物的不同组织)。
7.第二步温育从PBSTween缓冲液中取出一张载片,5秒钟内用吸水纸擦干背面和边缘后,立即盖在加样板上,注意不要擦拭反应区。注意避免阳光直接照射载片,室温温育30分钟。
8.冲洗用烧杯盛PBS—Tween缓冲液流水冲载片1秒钟(水流不要太急,不要直接对着基质),然后立即将其浸入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。
2.实验结果的进一步确认(两级测定) 间接免疫荧光法,提供了对自身抗体进行筛选的理想途径。许多情况下,仅使用该方法就可为临床提供足够的诊断信息,不需要做进一步的实验。在自身抗体的检测中,称间接免疫荧光法为“水平1测定”。如果有必要对自身抗体进行进一步的单特异性区分,则可应用其他方法,如酶免疫测定法、对流免疫电泳及免疫双扩散法等,称这些实验为“水平2测定。酶免疫测定法所用的抗原必须为纯化的。许多抗原不易被纯化,且很多自身抗体的确切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2细胞柱测到的抗体及小部分组织抗体,进行进一步单特异性检测。然而抗体的最终区分,需要使用纯化的抗原作为实验基质。单独的“水平2”测定,不能适应自身抗体检测的需要。特别是对抗核抗体的测定,单做“水平2”测定将会漏掉某些自身抗体,故必须同时用免疫荧光法进行检测。
注意,有时申请报告中,申请检测的自身抗体结果为阴性,而发现其他自身抗体为阳性。在这种情况下,如果该检测到的自身抗体有明显的临床意义,则要报告此结果。如该自身抗体无明确临床意义,则可不报告,以避免造成混乱。但如果临床医生与实验室工作者进行研究合作,则可报告或另外进行交流。
(3)免疫荧光模式;对阳性结果应报告其荧光模式,以初步提供自身抗体针对的靶抗原特异性,为进一步进行“水平2”检测提供信息。
2.血清的稀释度 一般来讲,一个待测标本,要测定某种或多种自身抗体,通常需要先测定一个起始稀释度。如该稀释度的检测结果为阴性,则认为该抗体或多种抗体不显著存在(无临床价值),通常无需稀释标本做进一步检测。如果该稀释度的检测结果为阳性,则认为该抗体明显存在(可能有临床意义),可将标本做进一步稀释,以获得该抗体的滴度。因此确定待测标本合适的起始稀释度,显得十分重要。由于待测血清的起始稀释度是结合临床统计所得,而不同的实验室采用的方法学有差异,故不同实验室的血清起始稀释度可能不同。另外,为了避免前带现象的发生,有时对可疑的阴性标本,尚需进一步的稀释后进行测定。
(4)滴度:滴度的定义为:与相同稀释倍数的阴性血清比较,能观测到的特异性的荧光反应的最高稀释度。检测结果应该报告滴度,为临床提供动态的信息,因为自身抗体阳性患者,在诊断和治疗过程中,要做多次检测,且有些自身抗体的滴度与病情密切相关。
1.准备 检查加样板:观察是否反应区亲水而周边疏水,如果不是,用湿纸巾擦干净,随后从试剂盒中取出载片,等平衡至室温时方可打开包装。注意不要触摸生物薄片,用笔编号、标记。
2.稀释血清 根据使用者实验设计,用PBS-Tween缓冲液稀释血清,每次实验均需阳性、阴性对照,使用前要混匀。
3.加样 按顺序分别滴加25ul稀释后血清至加样板每一反应区,避免产生气泡。滴加完所有待测标本后再开始温育。