间接免疫荧光检测
间接免疫荧光法检测自身抗体
(二)实验操作的标准化滴定平板技术
实验标准化流程为滴加样品、标记抗体至加样板，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。因为液体被局限在一封闭的空间，不再需要传统“湿盒”，可同时在一致的反应条件孵育大量的标本。下面以间接免疫荧光法为例，介绍滴定平板技术的操作过程：
间接免疫荧光法保留了原基质的完整抗原谱，因而可同时检测大量抗体．获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体)，或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时，就应该选择免疫荧光法。另外，应用免疫荧光法还可检测到一些至今未知的抗体。
在没有荧光显微镜时，可尝试用酶标记的第二抗体代替荧光标记的抗体，但是检测的质量会明显下降。因为在免疫荧光法中，指示剂染色是通过抗体直接结合在细胞抗原上产生的，而免疫酶法，染色则是弥散地围绕在抗原周围的区域。因此免疫酶法并不总是像免疫荧光法那样能区分抗原分布的细小差别。而且应用酶染色时，会导致许多自身抗体不能被区分或根本测不到。仅应用细胞核制备物免疫酶染色的纯光度法评价也是不可取的，因为这不可避免地导致一些自身抗体被漏检。
9．封片加甘油／PBS至盖玻片，每一反应区约10ul。从pBS-Tween缓冲液取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间鲸。将盖玻片轻轻盖在载片上。
10．结果判断 荧光显微镜下观察荧光。
(三)抗体检测的质量控制及注意事项
l．质量控制 自身抗体检测的质量控制是用多种手段对自身抗体存在与否、浓度的多少进行控制和评价，有利于实验室内部、实验室之间对同一标本获取相同具有可比性的结果，是衡量实验室检测水平的一个重要指标。然而．自身抗体检测的质量控制，并不是一件容易的工作。因为不同实验室所用的抗原基质存在差异、抗原的固定方法有差异或不同，血清的稀释方法不同以及操作者对不同荧光模式的识别能力不同等，均可影响到自身抗体的检酒质量。实验室在进行临床检测时，应同时检测阳性对照、阴性对照，以监测结果的准确性。国内急需成立专门的学术机构，参照国际标准，与国际接轨，建立自己当地的标准，开展自身抗体检测的质量控制。
《间接免疫荧光实验》课件
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
间接免疫荧光法
间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)是一种常用的特异性检测技术，也是最常见的检测技术之一，可以用于检测抗原分子的特异性结合。
一、IFA的原理：在IFA技术中，使用两种不同的抗体，分别与检测抗原结合，以形成双重抗原抗体复合物，再用夹带抗体获得体外的特异性检测反应；其中，一种抗体称作抗体，另一种抗体称作夹带抗体，具有特定免疫能力，可以将抗原抗体复合物与另外特定抗原进行特异性结合，获得所需的检测反应，而后将夹带抗体对抗原抗体复合物设定与荧光探针结合，从而实现特异性检测。
二、IFA的操作步骤：1、样品处理：将抗原进行均质处理，获得悬浮液。
2、抗体处理：将样哮抗体在恒温下进行稀释，然后添加到抗原悬浮液中，放置回温处理反应，补充抗体，使抗原与抗体完全结合形成复合物。
3、夹带抗体处理：将夹带抗体加入复合物，在恒温下进行反应，以获得抗原/夹带抗体复合物，从而实现特异性检测。
4、荧光标记：将荧光探针与夹带抗体完全结合，使抗原/夹带抗体复合物呈现特定的荧光，从而实现特异性检测。
5、检测：利用适当的仪器检测复合物的活性，并完成IFA的检测。
三、IFA的应用：IFA可以直接用于病毒、细菌、植物、动物等微生物抗原的检测，也可以用于检测抗原蛋白、血清病原体等，具有一定的临床实用价值。
1、应用于病原体鉴定：通过将IFA进行优化，可以对人体和动植物病原体进行识别、诊断和鉴定，给临床实践带来重要的参考价值；2、应用于鉴定疾病：IFA还可以用于检测某种疾病的免疫检测，例如常见的疾病，如流感病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、病毒性肝炎慢性病毒、HIV/AIDS等；3、应用于临床诊断：IFA可以用于对各种疾病进行鉴别诊断和检测，例如：癫痫、睑缝螨虫病、先天性心脏病、脑外膜炎、肺炎、病毒性心肌炎等疾病；4、应用于药物开发：可以在药物研究和开发中应用此技术，以研究对病原生物体或抗原分子的特异性作用，使药物开发进程更加准确、可靠；五、IFA技术优势：1、IFA是一种精确度高、特异性能强的检测技术，可实现灵敏性检测，快速和实时检测，有效提高疾病的检测效率；2、IFA有较强的合并性，可以同时结合不同的抗体，能够更好地检测抗原分子特异性反应；3、IFA具有较低的污染风险，实验中没有生物体的接触，可以有效地控。
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法是一种常用的免疫学实验技术，用于检测目标物质在样品中的表达和定位。
它基于特定抗体与目标物质结合的原理，利用荧光标记的二抗来识别和定位特定抗体的位置。
该方法的步骤如下：
1. 准备样品：收集需要检测的样品，如细胞、组织或体液。
如果是组织样品，需要进行固定和切片处理；如果是细胞样品，需要将其培养在培养皿中。
2. 孵育样品：将样品与特定抗体共孵育，使特定抗体与目标物质结合。
这一步骤被称为一抗孵育，加强了对目标物质的识别和特异性。
3. 孵育引导二抗：将荧光标记的二抗与一抗结合。
这个二抗能够识别并结合到一抗上，从而引导荧光标记的二抗定位到目标物质附近。
4. 洗涤：洗涤样品，去除未结合的抗体和二抗，以减少背景噪音。
5. 荧光显微镜观察：将样品放置在荧光显微镜下观察，荧光显微镜可以激发荧光标记的二抗，使其发出可见光。
通过观察荧光信号的位置和强度，可以确定目标物质的存在和定位。
间接免疫荧光法的优点是灵敏度高、特异性好、可以同时检测
多个目标物质等。
它被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中，如检测蛋白质、抗体、细胞标记和组织定位等。
荧光免疫技术测定——间接免疫荧光法检测ANA
三、操作方法
（一）鼠肝片的制备 1、取小白鼠一只，断颈处死。取其肝脏，用生 理盐水洗去残血，吸水纸吸干。 2、印片：小镊子夹取肝脏，剪刀剪成平断面， 将断面印至玻片上，直径为0.5厘米左右的薄膜 （不宜过厚），每片可涂三个，立即吹干。 3、固定：将上述印片放入95％乙醇玻片缸中固 定5分钟， 取出吹干。
高滴度的斑点型ANA常见于MCTD，同时也可 见于SLE、PSS（进行性系统性硬化症）、SS等
核膜型（M）/周边型： 细胞核 的周边形成荧光环。
• 相关抗体：抗dsDNA抗体 • 意义：高滴度周边型ANA几乎仅见于SLE， 特别是活动期SLE，周边型对SLE的诊断价值 极大，且提示病情活动。
核仁型（N）： 荧光着色 主要在核仁区
• 相关的自身抗体：抗不溶性DNP抗体，抗组蛋白抗体， 抗dsDNA抗体
• 意义： 高滴度均质型ANA：SLE 低滴度：RA、慢性肝脏疾病、传染性单核细胞增多症或
药物诱发的狼疮患者。
斑点型（S）： 细胞核内出现颗粒状荧光
• 相关的自身抗体：抗RNP抗体：抗Sm、抗 u1RNP、抗SSB/La等抗体 • 意义：
室中。 3、先观察对照孔，特别是阴性对照应无非特异荧光。
六、报告要求 间接免疫荧光法检测抗核抗体实验原理、结果。
本节内容结束
间接免疫荧光法检测ANA
抗核抗体（antinuclear antibody, ANA）
概念：一组广泛存在于许多自身免疫病患者体内 的抗细胞核成分的自身抗体的统称，主用于自身 免疫病的诊断。
类型：主要是IgG，亦有IgM、IgA、IgD、IgE
特点：无器官和种属特异性。
存在部位：主要存在于血清中，关节滑膜液、胸 水、尿液。
3、滴加荧光素标记的抗人球蛋白抗体（按工 作浓度稀释）15μl，置3微镜下观察结果。
96孔板间接免疫荧光实验步骤
96孔板间接免疫荧光实验步骤96孔板间接免疫荧光实验是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原和抗体的结合情况。
以下是该实验的详细步骤，帮助您完成实验并获得准确的结果。
第一步：准备实验材料和试剂在进行实验前，确保准备好所需的试剂和材料，包括：1. 96孔板：用于进行实验的常用多孔板。
2. 抗原：待测物质，可以是细胞表面抗原、蛋白质、细菌等。
3. 抗体：具有高亲合力和特异性，用于与抗原结合。
4. 荧光标记的二抗：可以与抗体结合并发出荧光信号。
5. 缓冲液：用于稀释抗原和抗体的缓冲液。
第二步：包被抗原1. 取一小部分被测抗原，在适当的浓度下进行稀释。
2. 取出96孔板，并将稀释好的抗原加入孔中。
3. 在孔中加入适量的缓冲液，并在室温下静置一段时间，使抗原与孔壁结合。
第三步：阻断非特异性结合1. 弃去孔中的缓冲液。
2. 加入适量的蛋白质（如牛血清蛋白、羊血清蛋白等）作为阻断剂。
3. 在室温下静置一段时间，以防止非特异性结合。
第四步：加入抗体和二抗1. 弃去阻断剂，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
2. 加入适量的特异性抗体，并在室温下孵育一段时间，使其与抗原结合。
3. 弃去孔中多余的抗体，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
4. 加入适量的荧光标记的二抗，并在室温下孵育一段时间，使其与抗体结合。
第五步：荧光信号检测1. 弃去孔中多余的荧光标记的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
2. 加入适量的检测缓冲液以稀释孔中的荧光信号。
3. 使用荧光读板仪检测每个孔中的荧光强度。
4. 根据结果判断抗原和抗体的结合情况。
第六步：数据分析和结果解释对读取的荧光信号进行数据分析，比较不同孔中的荧光强度。
如果目标抗原与特异性抗体结合，荧光信号应相对较高。
通过对比各孔的荧光强度，可以得出抗原和抗体的结合程度以及目标物质的相对含量。
通过按照以上步骤进行实验，您可以获得准确的间接免疫荧光实验结果。
这种实验方法广泛应用于生物医学研究、诊断试剂的开发和药物筛选等方面。
医学检验·检查项目：间接免疫荧光试验_课件模板
医学检验·各论 间接免疫荧光试验
内容课件模板
医学检验·各论：间接免疫荧光试验 >>>
别名： 间接免疫荧光试验。
医学检验·各论：间接免疫荧光试验 >>>
简介：
用对应某一种抗原的抗体(这里被称 为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一 抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二 抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵 育结合后在荧光显微镜下观察。
Байду номын сангаас 谢谢！
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临床意义：
单份血清效价≥1:64或双份血清效价 呈4倍增长或有IgM抗体出现即可诊断为立 克次体感染。本法不能区分患者感染的立 克次体的类型。特异性抗立克次体的IgM 抗体的出现提示新近感染。
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正常值： <1:64。
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相关检查： 链激酶-链道酶试验、炭疽的凝集反应、 免疫抑制酸性蛋白、ECT检查、循环免疫 复合物、人类免疫缺陷病毒抗体。
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相关症状： 免疫力下降、先天性弓形体、浑身忽冷忽 热、免疫缺陷、暴晒后的皮肤损害、脾肿 大。
医学检验·各论：间接免疫荧光试验 >>>
相关疾病：
间接免疫荧光实验
通过观察荧光强度，可以初步判断抗原表达量， 为定量分析提供参考。
定量与定性分析
定量分析
通过测量荧光强度或计数阳性细胞数 量，对实验结果进行定量分析，得出 抗原表达水平的相对值。
定性分析
根据荧光显微镜下观察到的抗原定位 、细胞形态以及荧光强度，对实验结 果进行定性分析，判断抗原是否存在 以及表达情况。
实验局限性及改进方向
01
02
03
04
实验过程中可能存在假阳性或 假阴性结果，需要进一步优化
实验条件和操作流程。
实验方法的灵敏度和特异性仍 需进一步提高，以适应更广泛
的应用场景。
需要加强实验质量控制，确保 实验结果的稳定性和可靠性。
针对不同抗原和样本类型，需 要进一步探索和改进实验方法 ，以提高其适用性和通用性。
02 实验材料
抗体选择与制备
01
02
03
抗体来源
选择来源于特异性免疫动 物的抗体，如小鼠、兔、 羊等。
抗体纯化
通过亲和层析、凝胶过滤 等方法对抗体进行纯化， 去除杂蛋白和聚合物。
抗体标记
选择荧光染料对抗体进行 标记，常用的荧光染料有 FITC、TRITC、Cy3等。
细胞或组织样本
细胞培养
将细胞在适宜的培养基中培养， 保持细胞活性。
06 参考文献
参考文献
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实验步骤
间接免疫荧光实验通常包括细胞或组织固定、抗体孵育、洗涤、加入荧光标记的第二抗体 、再次洗涤和荧光显微镜观察等步骤。
实验注意事项
在进行间接免疫荧光实验时，需要注意控制实验条件，如温度、pH值和抗体浓度等，以 保证实验结果的准确性和可靠性。同时，需要注意荧光标记物的选择和使用，以及避免非 特异性染色等问题。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学和生命科学领域中的分析技术。
根据不同的用途和操作方法，免疫荧光技术可以分为以下几类：
1. 直接免疫荧光法
直接免疫荧光法是一种最简单的免疫荧光技术，通常用于检测单一抗原。
该方法将荧光标记的抗体直接与待检测物接触，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
2. 间接免疫荧光法
间接免疫荧光法是一种常用的免疫荧光技术，可用于检测多个抗原或抗体。
该方法通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，然后使用荧光标记的二级抗体识别和结合一级抗体，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
3. 间接免疫荧光染色法
间接免疫荧光染色法是一种特定的间接免疫荧光技术，通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，再使用被标记的一级抗体结合一级抗体，形成免疫复合物。
该方法可以用于检测多个抗原或抗体，并且适用于细胞和组织的检测。
4. 光度法免疫荧光
光度法免疫荧光是一种快速、准确的免疫荧光技术，用于检测微量物质，如细菌和病毒。
该方法通过对待测样品进行化学反应，形成荧光物质，然后测量荧光信号强度。
5. 免疫电子显微镜法
免疫电子显微镜法是一种高分辨率的免疫荧光技术，用于检测细胞和分子水平上的抗原或抗体。
该方法使用标记有金颗粒的抗体，进行免疫染色，然后使用电子显微镜观察荧光信号。
总之，免疫荧光技术是一种多功能的生物分析技术，可用于各种生命科学领域，其中不同的分类方法可以根据需要进行选择。
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法介绍组织免疫荧光间接法（Tissue Immunofluorescence Indirect Method）是一种常用的免疫组化技术，用于检测组织样本中的特定抗原。
该方法利用荧光标记的二抗与靶抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置来确定抗原的存在和分布。
实验步骤1. 组织处理1.收集组织样本，并固定在含有4%的 paraformaldehyde 的缓冲液中。
固定时间通常为 1-2 小时。
2.将固定的组织样本进行脱水和包埋处理，以便进行切片。
3.切割薄片，通常为 4-6 微米的厚度，并将其固定在载玻片上。
2. 抗原修复1.将载玻片上的组织薄片放入含有抗原修复缓冲液的容器中，进行抗原修复处理。
抗原修复缓冲液的选择取决于待检测的抗原类型。
2.根据抗原修复缓冲液的要求，进行适当的温度和时间处理。
3. 阻断非特异性结合1.使用适当的阻断缓冲液，将载玻片上的组织薄片进行非特异性结合的阻断处理。
常用的阻断缓冲液包括牛血清白蛋白（BSA）和非特异性抗体。
2.根据阻断缓冲液的要求，进行适当的温度和时间处理。
4. 靶抗体孵育1.将待检测的靶抗体稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
2.在恰当的温度和时间下，让靶抗体与组织中的特定抗原结合。
5. 一抗探针孵育1.选择与待检测靶抗体不同种属的一抗探针，并将其稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
2.在恰当的温度和时间下，让一抗探针与待检测靶抗体结合。
6. 二抗标记1.选择与一抗探针种属不同的二抗，并将其标记上荧光物质，如荧光素或荧光二抗。
2.将标记的二抗稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
3.在恰当的温度和时间下，让标记的二抗与一抗探针结合。
7. 荧光显微镜观察1.使用荧光显微镜观察载玻片上组织薄片的荧光信号。
2.调整荧光显微镜的参数，如曝光时间、荧光滤光片等，以获得清晰的图像。
3.分析和记录荧光信号的强度和位置，以确定抗原的存在和分布。
免疫荧光间接法注意事项
免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。
通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。
免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。
在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。
通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。
【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。
免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。
这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。
在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。
需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。
这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。
免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。
只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。
所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
间接免疫荧光法
目 录
• 引言 • 间接免疫荧光法原理 • 间接免疫荧光法实验步骤 • 间接免疫荧光法在生物医学领域的应用 • 间接免疫荧光法优缺点及改进方向 • 间接免疫荧光法实验操作注意事项
01 引言
目的和背景
研究目的
介绍间接免疫荧光法的原理、应用和优缺点，为相关领域的研究提供参考。
背景
随着免疫学、生物技术和医学的不断发展，间接免疫荧光法作为一种重要的免 疫学技术，在疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域发挥着越来越重要的 作用。
抗体孵育与荧光标记
一抗孵育
选用特异性针对目标抗原的抗体作为 一抗，与固定好的抗原进行孵育，使 抗体与抗原结合。
清洗
二抗孵育
选用与一抗种属匹配的荧光标记二抗， 与一抗结合，形成荧光标记的抗体-抗 原复合物。
去除未结合的一抗，减少非特异性荧 光干扰。
显微镜观察与结果分析
荧光显微镜观察
在荧光显微镜下观察样本，激发荧光并捕捉荧光信号。
肿瘤标志物检测
肿瘤相关抗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ检测
利用特异性抗体与肿瘤相关抗原结合， 通过荧光显微镜观察荧光信号，辅助 肿瘤的诊断和分类。
肿瘤特异性抗体检测
检测患者血清中针对肿瘤特异性抗原 的抗体，用于肿瘤的早期发现和病程 监测。
05 间接免疫荧光法优缺点及 改进方向
优点
高灵敏度
间接免疫荧光法能够检测到非常 低浓度的目标抗原或抗体，具有
病毒抗体检测
检测患者血清中特异性病毒抗体的存 在和滴度，用于病毒感染的诊断和病 程监测。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
利用间接免疫荧光法检测患者血清中针对自身组织抗原的抗 体，用于自身免疫性疾病的诊断和分类。
间接免疫荧光检测过程
间接免疫荧光检测过程
嘿，咱今天就来讲讲那个间接免疫荧光检测过程哈。
记得有一次我在实验室里，要做这个检测。
那场面，就跟一场神秘的探险似的。
首先呢，咱得准备好样本，这就好比是要去探险得先找好装备一样。
把样本小心翼翼地放在玻片上，就好像给它找了个安稳的小窝。
接下来，就是加一抗啦。
这一抗就像是我们探险时的秘密武器，得准确地给它加到样本上，可不能有一点儿马虎。
然后呢，得让它好好地反应一会儿，这时候就感觉时间过得特别慢，就像等一个重要的消息一样焦急。
等了一阵子，就得把多余的一抗洗掉啦，就像把身上沾的灰尘洗掉一样。
接着，就是加二抗啦，二抗一加上，就好像给样本穿上了一件特别的外衣。
看着那些色彩慢慢显现出来，真的特别神奇。
再经过一系列的操作，最后在显微镜下观察，哇，那画面，就像打开了一个神奇的微观世界的大门。
看到那些荧光标记的地方，就像是找到了宝藏一样兴奋。
总之，这间接免疫荧光检测过程就像一场充满惊喜和挑战的旅程，每一步都得认真对待，才能最终看到那让人惊叹的结果呀。
这就是间接免疫荧光检测过程啦！。
间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体 临床免疫学
实验三、间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体一、实验目的：1、掌握免疫荧光法的原理。
2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。
二、实验原理：间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。
以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。
病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。
三、实验步骤：1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干；2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′；3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分；4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃305、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分；6、荧光显微镜镜检。
四、实验结果：待测血清镜下可见明亮，清晰，圆点状荧光，大小不一。
有均质型、斑点型、核膜型，其中以均质型多见。
各型如下图所示：对照血清为细胞不发出荧光；镜下见到模糊，较暗淡，块状荧光，无细胞形为非特异性荧光。
抗核抗体(均质型) 抗核抗体(斑点型) 抗核抗体(核膜型)实验讨论：一、注意事项：1、制作核抗原片（印片）不宜太厚；2、滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片；3、荧光抗体孵育时要注意避光;4、染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。
5、注意各步骤的漂洗要充分。
间接免疫荧光法检测ANA标准操作程序
间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF )检测ANA标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠，为临床诊断提供可靠的参考依据【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【方法】间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF)。
【标本的采取和保存】随机静脉血3ml，分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
【原理】稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在Hep -2细胞(人喉癌上皮细胞)抗原基质上，如果被检清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性地和抗原基质片上Hep-2细胞中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物(主要是IgG类)，再与兔或羊抗人免疫球蛋白IgG荧光标记抗体结合，在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞细胞核和/或细胞浆抗原位置发出特异的亮绿色荧光，为抗核抗体(antinuxlear antibodies, ANA )阳性。
【仪器】荧光显微镜【试剂】ANA IIF试剂盒，德国欧蒙公司产品，每个反应区有两种抗原复合基质：猴肝组织和人Hep-2细胞。
【操作程序】1.准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记：(为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG
间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG目的微小巴贝西IgG抗体试剂盒用来检测或半定量人微小巴贝西IgG抗体。
试验总结和解释北美巴贝西虫病是由微小巴贝西虫引起的，通过被感染的蜱的叮咬传播，通常认为贝西虫病可以通过噬吞噬细胞无形体和（或）伯氏疏螺旋体共传播。
传统方法通过外周血涂片制作薄血膜观察红细胞内部特征性的内含物。
免疫荧光法用微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞作为特征性内含物的来源用来进行特异性抗体检测。
病人血清稀释缓冲液在孔板中孵化使得抗体和微小巴贝西抗原反应。
洗板移去未反应的血清蛋白，然后加入荧光标记的抗人IgG，这个结合物需要时间与抗原抗体化合物反应。
再一次洗板移去未反应的结合物。
反应结果通过荧光显微镜，观察，阳性结果被视为苹果绿的荧光内含物包裹在被感染的红细胞里。
空白对照是没有荧光或荧光类似物在对照孔，阳性对照通过高倍稀释确定最高活性或终点稀释。
试剂加样板10*12孔涂有包括微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞，真空包装。
IgG结合物，2.5ML黄色帽滴管含有亲和纯化的DyLight 488荧光标记羊抗人牛血清白蛋白IgM和伊文思兰试剂。
阳性对照，0.5ML蓝色帽滴管含有人反应性的血清1:64的稀释倍数，终点滴度是1：512。
阴性对照，0.5ML红色帽滴管含有人非反应性的血清1:50倍稀释。
封片剂，1ML白色帽滴管含有50%甘油磷酸盐缓冲液。
PBS，1L粉剂溶于1L纯净水中配制成PH7.2的磷酸盐缓冲液。
警告1.对照血清经过食品药品管理局的传染性检测，然而由于没有测试能确保传染性不存在，这些试剂和血清标本应避免皮肤接触和摄入。
2.反应板是经过化学灭活的抗原，具有潜在的传染性，应进行相应处理。
保存试剂盒应存放在2-8℃，在室温中打开滴管和加样板袋。
标本采集血液凝固后离心分离血清，血清移至密封的灭菌管，存放在2-8℃。
如果实验操作超过五天，样品存放在-20℃冷冻。
急性期标本在疾病发作期采样，恢复期标本在间歇期收集检查滴度变化。
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6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细 胞浓度。 一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。 7、细胞活力检查 取 1滴细胞悬液加 1滴 2%台盼蓝染液，作湿片高 倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
材 料
1. Ag PBMC 2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1) 3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 4. 洗涤液 5. 荧光显微镜
方 法
1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片 黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干 燥。
2. 15 ul Ab1 加入玻片上37℃孵育30 min。 PBS洗3 次(3min/次)。
3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作) 4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。
原 理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合， 形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合 物，在荧光显微镜下呈现荧光。
外周血单个核细胞分离 ------ 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理]
外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单 核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红 细胞和多核细胞比重较大，为 1.092 左右，而淋巴细 胞和单核细胞比重为 1.075左右。利用比重为 1.077左 右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按 密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
[方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液 （含100u/ml肝素）的试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将 稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注 意保持两者界面清晰。（关键） 3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。