间接免疫荧光检测

3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作) 4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。
外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单 核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红 细胞和多核细胞比重较大，为 1.092 左右，而淋巴细 胞和单核细胞比重为 1.075左右。利用比重为 1.077左 右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按 密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
[材料]
4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加 入另一支已含有 2-5mlHank’s 液的离心管中， 混匀。 5、室温下，1500rpm离心10min。
6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细 胞浓度。 一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。 7、细胞活力检查 取 1滴细胞悬液加 1滴 2%台盼蓝染液，作湿片高 倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
材 料
1. Ag PBMC 2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1) 3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 4. 洗涤液 5. 荧光显微镜
方 法
1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片 黑色圈圈背面中央, Fra Baidu bibliotek止5-10分钟，待PBMC干 燥。
2. 15 ul Ab1 加入玻片上37℃孵育30 min。 PBS洗3 次(3min/次)。
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
[方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液 （含100u/ml肝素）的试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将 稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注 意保持两者界面清晰。（关键） 3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。
原 理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合， 形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合 物，在荧光显微镜下呈现荧光。
外周血单个核细胞分离 ------ 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理]