间接免疫荧光
间接免疫荧光讲
实验步骤
1. 滴加01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒 内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸 泡，每缸3-5 min，不时振荡。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
间接免疫荧光法检测自身抗体
(二)实验操作的标准化滴定平板技术
实验标准化流程为滴加样品、标记抗体至加样板，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。因为液体被局限在一封闭的空间，不再需要传统“湿盒”，可同时在一致的反应条件孵育大量的标本。下面以间接免疫荧光法为例，介绍滴定平板技术的操作过程：
间接免疫荧光法保留了原基质的完整抗原谱，因而可同时检测大量抗体．获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体)，或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时，就应该选择免疫荧光法。另外，应用免疫荧光法还可检测到一些至今未知的抗体。
在没有荧光显微镜时，可尝试用酶标记的第二抗体代替荧光标记的抗体，但是检测的质量会明显下降。因为在免疫荧光法中，指示剂染色是通过抗体直接结合在细胞抗原上产生的，而免疫酶法，染色则是弥散地围绕在抗原周围的区域。因此免疫酶法并不总是像免疫荧光法那样能区分抗原分布的细小差别。而且应用酶染色时，会导致许多自身抗体不能被区分或根本测不到。仅应用细胞核制备物免疫酶染色的纯光度法评价也是不可取的，因为这不可避免地导致一些自身抗体被漏检。
9．封片加甘油／PBS至盖玻片，每一反应区约10ul。从pBS-Tween缓冲液取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间鲸。将盖玻片轻轻盖在载片上。
10．结果判断 荧光显微镜下观察荧光。
(三)抗体检测的质量控制及注意事项
l．质量控制 自身抗体检测的质量控制是用多种手段对自身抗体存在与否、浓度的多少进行控制和评价，有利于实验室内部、实验室之间对同一标本获取相同具有可比性的结果，是衡量实验室检测水平的一个重要指标。然而．自身抗体检测的质量控制，并不是一件容易的工作。因为不同实验室所用的抗原基质存在差异、抗原的固定方法有差异或不同，血清的稀释方法不同以及操作者对不同荧光模式的识别能力不同等，均可影响到自身抗体的检酒质量。实验室在进行临床检测时，应同时检测阳性对照、阴性对照，以监测结果的准确性。国内急需成立专门的学术机构，参照国际标准，与国际接轨，建立自己当地的标准，开展自身抗体检测的质量控制。
《间接免疫荧光实验》课件
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
临床免疫实验 间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告
实验三、间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体一、实验目的：1、掌握免疫荧光法的原理。
2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。
二、实验原理：间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。
以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。
病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。
三、试验材料：0.1M，pH6.8PBS；小白鼠，待测血清，对照血清（阴性血清），羊抗人IgG荧光抗体、滴管、试管、孵箱、荧光显微镜等。
四、实验步骤：1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干；2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′；3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分；4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃305、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分；6、荧光显微镜镜检。
五、实验结果：荧光显微镜下观察：细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性；抗原片中出现阳性染色细胞为ANA 阳性，否则为阴性；阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
（均质型）细胞核呈均匀一致的荧光(斑点型)细胞核内呈现斑点状荧光六、实验讨论：1、注意事项：1）制作核抗原片（印片）不宜太厚；2）滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片；3）荧光抗体孵育时要注意避光;4）染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。
5）注意各步骤的漂洗要充分。
2、临床意义：1）总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。
绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。
ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。
aqp4 间接免疫荧光法 试剂说明书
aqp4 间接免疫荧光法试剂说明书试剂名称：AQP4 间接免疫荧光法试剂盒一、概述AQP4（Aquaporin 4）是一种重要的跨膜蛋白，广泛存在于中枢神经系统的星形胶质细胞，其功能与水分子的通透性调节密切相关。
AQP4与多种疾病如神经免疫性疾病、脑水肿等关联密切，因此其检测对于临床诊断和治疗具有重要意义。
二、试剂成分及保存1. 主抗体：AQP4抗体，冻干粉末，-20℃保存；2. 辅助抗体：包括草鱼抗鸡IgG荧光素、羊抗胶素HRP，液态，2-8℃保存；3. 缓冲液：含有磷酸盐缓冲液、Tween-20、胶原蛋白等，液态，2-8℃保存；4. 荧光素底物：稳定的荧光素底物液，4℃保存；5. 防护添加剂：NaN3，保存于室温，避免光照；6. 封闭试剂及洗涤缓冲液：液态，2-8℃保存。
三、试剂准备1. 主抗体制备：将冻干的AQP4抗体加入指定的体积的去离子水中，充分溶解后可使用。
避免反复冻融，分装后-20℃保存。
2. 辅助抗体制备：将草鱼抗鸡IgG荧光素与羊抗胶素HRP按指定比例混合，制成辅助抗体混合液。
3. 缓冲液制备：根据试剂盒标签上的说明，将缓冲液与去离子水按指定比例混合，得到合适的工作液。
四、试剂使用1. 取适量的标本切片，加入缓冲液中进行润湿处理，去除切片中存在的酶。
2. 进行抗原修复，使用适当的缓冲液进行煮沸或酶解，以恢复抗原的免疫原性。
3. 将修复后的标本切片进行冷却处理。
4. 加入主抗体，将冻干粉末溶解后的主抗体适量滴于标本切片上，避免气泡产生，保证充分接触。
5. 在室温下孵育标本切片，使主抗体与标本中的AQP4结合。
6. 进行洗涤步骤，使用洗涤缓冲液洗涤标本切片，去除未结合的主抗体。
7. 加入辅助抗体混合液，使其与标本中的主抗体结合。
8. 进行第二次洗涤步骤，保证未结合的辅助抗体被洗去。
9. 加入荧光素底物，使其与辅助抗体结合，并形成荧光信号。
10. 观察并分析标本切片中的荧光信号，根据信号的分布和强度来判断AQP4的表达状况。
《间接免疫荧光法》课件
06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育 时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干 扰，解决方案是使用去内源性荧光 物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决 方案是使用更稳定的荧光物质或采 用避光染色技术。
研究展望
01
02
03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如 自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞 内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真 菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和 污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术 ，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染 色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和 诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实 验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体 ，间接免疫荧光法能够特异地 识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定 位抗原的位置，有助于了解抗 原在细胞或组织中的分布情况 。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免 疫荧光法能够直观地展示抗原 的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可 获得，该方法可能无法应用。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
间接免疫荧光法
间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)是一种常用的特异性检测技术，也是最常见的检测技术之一，可以用于检测抗原分子的特异性结合。
一、IFA的原理：在IFA技术中，使用两种不同的抗体，分别与检测抗原结合，以形成双重抗原抗体复合物，再用夹带抗体获得体外的特异性检测反应；其中，一种抗体称作抗体，另一种抗体称作夹带抗体，具有特定免疫能力，可以将抗原抗体复合物与另外特定抗原进行特异性结合，获得所需的检测反应，而后将夹带抗体对抗原抗体复合物设定与荧光探针结合，从而实现特异性检测。
二、IFA的操作步骤：1、样品处理：将抗原进行均质处理，获得悬浮液。
2、抗体处理：将样哮抗体在恒温下进行稀释，然后添加到抗原悬浮液中，放置回温处理反应，补充抗体，使抗原与抗体完全结合形成复合物。
3、夹带抗体处理：将夹带抗体加入复合物，在恒温下进行反应，以获得抗原/夹带抗体复合物，从而实现特异性检测。
4、荧光标记：将荧光探针与夹带抗体完全结合，使抗原/夹带抗体复合物呈现特定的荧光，从而实现特异性检测。
5、检测：利用适当的仪器检测复合物的活性，并完成IFA的检测。
三、IFA的应用：IFA可以直接用于病毒、细菌、植物、动物等微生物抗原的检测，也可以用于检测抗原蛋白、血清病原体等，具有一定的临床实用价值。
1、应用于病原体鉴定：通过将IFA进行优化，可以对人体和动植物病原体进行识别、诊断和鉴定，给临床实践带来重要的参考价值；2、应用于鉴定疾病：IFA还可以用于检测某种疾病的免疫检测，例如常见的疾病，如流感病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、病毒性肝炎慢性病毒、HIV/AIDS等；3、应用于临床诊断：IFA可以用于对各种疾病进行鉴别诊断和检测，例如：癫痫、睑缝螨虫病、先天性心脏病、脑外膜炎、肺炎、病毒性心肌炎等疾病；4、应用于药物开发：可以在药物研究和开发中应用此技术，以研究对病原生物体或抗原分子的特异性作用，使药物开发进程更加准确、可靠；五、IFA技术优势：1、IFA是一种精确度高、特异性能强的检测技术，可实现灵敏性检测，快速和实时检测，有效提高疾病的检测效率；2、IFA有较强的合并性，可以同时结合不同的抗体，能够更好地检测抗原分子特异性反应；3、IFA具有较低的污染风险，实验中没有生物体的接触，可以有效地控。
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法是一种检测细胞内蛋白质表达及其定位的重要方法。
该方法通过使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以快速准确地检测出目标蛋白质存在的位置。
该方法的操作步骤如下：
1. 取得样本组织，并将其固定在载玻片上。
2. 使用相应的特异性抗体与荧光素作为探针，将其加入样本中。
3. 让样本与探针反应一定的时间，使其充分结合。
4. 用洗涤液清洗样本，去除未与探针结合的抗体和荧光素。
5. 使用激光显微镜观察样本，在激光的照射下，荧光素会发出荧光信号，以此确定目标蛋白质的存在及其位置。
组织免疫荧光间接法具有以下优点：
1. 高灵敏度：与其他方法相比，该方法可以检测到非常低浓度的目标
蛋白质。
2. 高特异性：该方法使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以清楚地
确定目标蛋白质的位置。
3. 快速准确：该方法操作简便，可以在较短的时间内得到结果。
4. 多功能：该方法还可以用于检测不同种类的细胞和组织中的蛋白质。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如：
1. 需要耗费大量的抗体，并且抗体需要提前准备。
2. 对于一些表达较低的蛋白质，由于检测的灵敏度限制，结果可能会
产生假阴性。
3. 由于需要使用荧光素，该方法对于一些染料不稳定的样本有一定的
局限性。
总之，组织免疫荧光间接法是一种快速准确的检测蛋白质存在和位置
的方法，可以广泛应用于医学、生物学等各领域的科研中。
但是，我
们在进行该方法时需要注意其局限性，以保证获得准确的结果。
间接免疫荧光实验
通过观察荧光强度，可以初步判断抗原表达量， 为定量分析提供参考。
定量与定性分析
定量分析
通过测量荧光强度或计数阳性细胞数 量，对实验结果进行定量分析，得出 抗原表达水平的相对值。
定性分析
根据荧光显微镜下观察到的抗原定位 、细胞形态以及荧光强度，对实验结 果进行定性分析，判断抗原是否存在 以及表达情况。
实验局限性及改进方向
01
02
03
04
实验过程中可能存在假阳性或 假阴性结果，需要进一步优化
实验条件和操作流程。
实验方法的灵敏度和特异性仍 需进一步提高，以适应更广泛
的应用场景。
需要加强实验质量控制，确保 实验结果的稳定性和可靠性。
针对不同抗原和样本类型，需 要进一步探索和改进实验方法 ，以提高其适用性和通用性。
02 实验材料
抗体选择与制备
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抗体来源
选择来源于特异性免疫动 物的抗体，如小鼠、兔、 羊等。
抗体纯化
通过亲和层析、凝胶过滤 等方法对抗体进行纯化， 去除杂蛋白和聚合物。
抗体标记
选择荧光染料对抗体进行 标记，常用的荧光染料有 FITC、TRITC、Cy3等。
细胞或组织样本
细胞培养
将细胞在适宜的培养基中培养， 保持细胞活性。
06 参考文献
参考文献
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实验步骤
间接免疫荧光实验通常包括细胞或组织固定、抗体孵育、洗涤、加入荧光标记的第二抗体 、再次洗涤和荧光显微镜观察等步骤。
实验注意事项
在进行间接免疫荧光实验时，需要注意控制实验条件，如温度、pH值和抗体浓度等，以 保证实验结果的准确性和可靠性。同时，需要注意荧光标记物的选择和使用，以及避免非 特异性染色等问题。
直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同
直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同免疫荧光细胞化学方法的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。
方法具体种类有直接法、间接法、夹心法和补体法等。
在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。
1、直接法：这是最早的方法。
其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。
该方法评价：简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。
但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
2、间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。
在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。
目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
3、如果你有针对待查抗原一抗（荧光素标记），而且你的待检抗原表达也比较丰富的话，做直接法也未尝不可。
不过如果你不具备上述两个条件的话，还是推荐你做间接法。
4、如果你做的是细胞骨架，那么就是用直接免疫荧光。
如果是一般的蛋白表达，这个要看有没有试剂是直接标记的；如果没有，还是只能考虑间接荧光。
直接荧光相对间接荧光可以避免非特异姓染色，当然步骤也少了些。
我做过细胞骨架的直接染色，效果很好。
来源：互联网。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法介绍组织免疫荧光间接法（Tissue Immunofluorescence Indirect Method）是一种常用的免疫组化技术，用于检测组织样本中的特定抗原。
该方法利用荧光标记的二抗与靶抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置来确定抗原的存在和分布。
实验步骤1. 组织处理1.收集组织样本，并固定在含有4%的 paraformaldehyde 的缓冲液中。
固定时间通常为 1-2 小时。
2.将固定的组织样本进行脱水和包埋处理，以便进行切片。
3.切割薄片，通常为 4-6 微米的厚度，并将其固定在载玻片上。
2. 抗原修复1.将载玻片上的组织薄片放入含有抗原修复缓冲液的容器中，进行抗原修复处理。
抗原修复缓冲液的选择取决于待检测的抗原类型。
2.根据抗原修复缓冲液的要求，进行适当的温度和时间处理。
3. 阻断非特异性结合1.使用适当的阻断缓冲液，将载玻片上的组织薄片进行非特异性结合的阻断处理。
常用的阻断缓冲液包括牛血清白蛋白（BSA）和非特异性抗体。
2.根据阻断缓冲液的要求，进行适当的温度和时间处理。
4. 靶抗体孵育1.将待检测的靶抗体稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
2.在恰当的温度和时间下，让靶抗体与组织中的特定抗原结合。
5. 一抗探针孵育1.选择与待检测靶抗体不同种属的一抗探针，并将其稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
2.在恰当的温度和时间下，让一抗探针与待检测靶抗体结合。
6. 二抗标记1.选择与一抗探针种属不同的二抗，并将其标记上荧光物质，如荧光素或荧光二抗。
2.将标记的二抗稀释到适当的浓度，然后将其加到载玻片上的组织薄片上。
3.在恰当的温度和时间下，让标记的二抗与一抗探针结合。
7. 荧光显微镜观察1.使用荧光显微镜观察载玻片上组织薄片的荧光信号。
2.调整荧光显微镜的参数，如曝光时间、荧光滤光片等，以获得清晰的图像。
3.分析和记录荧光信号的强度和位置，以确定抗原的存在和分布。
免疫荧光间接法注意事项
免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。
通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。
免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。
在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。
通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。
【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。
免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。
这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。
在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。
需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。
这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。
免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。
只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。
所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
间接免疫荧光法
目 录
• 引言 • 间接免疫荧光法原理 • 间接免疫荧光法实验步骤 • 间接免疫荧光法在生物医学领域的应用 • 间接免疫荧光法优缺点及改进方向 • 间接免疫荧光法实验操作注意事项
01 引言
目的和背景
研究目的
介绍间接免疫荧光法的原理、应用和优缺点，为相关领域的研究提供参考。
背景
随着免疫学、生物技术和医学的不断发展，间接免疫荧光法作为一种重要的免 疫学技术，在疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域发挥着越来越重要的 作用。
抗体孵育与荧光标记
一抗孵育
选用特异性针对目标抗原的抗体作为 一抗，与固定好的抗原进行孵育，使 抗体与抗原结合。
清洗
二抗孵育
选用与一抗种属匹配的荧光标记二抗， 与一抗结合，形成荧光标记的抗体-抗 原复合物。
去除未结合的一抗，减少非特异性荧 光干扰。
显微镜观察与结果分析
荧光显微镜观察
在荧光显微镜下观察样本，激发荧光并捕捉荧光信号。
肿瘤标志物检测
肿瘤相关抗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ检测
利用特异性抗体与肿瘤相关抗原结合， 通过荧光显微镜观察荧光信号，辅助 肿瘤的诊断和分类。
肿瘤特异性抗体检测
检测患者血清中针对肿瘤特异性抗原 的抗体，用于肿瘤的早期发现和病程 监测。
05 间接免疫荧光法优缺点及 改进方向
优点
高灵敏度
间接免疫荧光法能够检测到非常 低浓度的目标抗原或抗体，具有
病毒抗体检测
检测患者血清中特异性病毒抗体的存 在和滴度，用于病毒感染的诊断和病 程监测。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
利用间接免疫荧光法检测患者血清中针对自身组织抗原的抗 体，用于自身免疫性疾病的诊断和分类。
间接免疫荧光实验
滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反
应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测
阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最
适稀释因子为3.162（10的平方根），这样， 每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、 1:32、1:100、1:320、1:1000等）。
绿
495
发射波长 （nm）
528
荧光显微镜：
落射式荧光显微镜
①不需要额外的聚光镜 ②可产生高对比度的暗视野 ③同时进行明视野、暗视野 的抗原基质定位 ④可观察两种不同的荧光 ⑤可改变荧光的强度
IIF操作步骤
１．准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂 盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要 触及生物薄片。用笔编号、标记。
滴定平板技术： 使实验操作标准化
将标本或试剂滴加 到加样板反应区上，然 后把生物薄片载片盖在 加样板的凹槽里，所有 生物薄片均与液滴接触， 反应同时开始.系统的几 何结构决定了液滴的位 置和高度.
荧光二抗
荧光素及其激发波长和发射波长
荧光素
异硫氰酸荧光素 （FITC）
发射的 激发波长
荧光色 （nm）
注意事项】
1．每次试验应该设阳性和阴性对照。 2． 应注意荧光抗体的质量。 3． 标本应及时检测，并避光保存。
５．清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流 不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装 有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5分钟。
６．加样：滴加20ul FITC标记的羊抗人IgG至洁净加样板的 反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意： 标记的IgG使用前需混匀。
７．第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水 纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面 朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不 要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好， 注意避免阳光直射载片。
间接免疫荧光检测过程
间接免疫荧光检测过程
嘿，咱今天就来讲讲那个间接免疫荧光检测过程哈。
记得有一次我在实验室里，要做这个检测。
那场面，就跟一场神秘的探险似的。
首先呢，咱得准备好样本，这就好比是要去探险得先找好装备一样。
把样本小心翼翼地放在玻片上，就好像给它找了个安稳的小窝。
接下来，就是加一抗啦。
这一抗就像是我们探险时的秘密武器，得准确地给它加到样本上，可不能有一点儿马虎。
然后呢，得让它好好地反应一会儿，这时候就感觉时间过得特别慢，就像等一个重要的消息一样焦急。
等了一阵子，就得把多余的一抗洗掉啦，就像把身上沾的灰尘洗掉一样。
接着，就是加二抗啦，二抗一加上，就好像给样本穿上了一件特别的外衣。
看着那些色彩慢慢显现出来，真的特别神奇。
再经过一系列的操作，最后在显微镜下观察，哇，那画面，就像打开了一个神奇的微观世界的大门。
看到那些荧光标记的地方，就像是找到了宝藏一样兴奋。
总之，这间接免疫荧光检测过程就像一场充满惊喜和挑战的旅程，每一步都得认真对待，才能最终看到那让人惊叹的结果呀。
这就是间接免疫荧光检测过程啦！。
间接免疫荧光法检测ANA标准操作程序
间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF )检测ANA标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠，为临床诊断提供可靠的参考依据【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【方法】间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF)。
【标本的采取和保存】随机静脉血3ml，分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
【原理】稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在Hep -2细胞(人喉癌上皮细胞)抗原基质上，如果被检清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性地和抗原基质片上Hep-2细胞中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物(主要是IgG类)，再与兔或羊抗人免疫球蛋白IgG荧光标记抗体结合，在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞细胞核和/或细胞浆抗原位置发出特异的亮绿色荧光，为抗核抗体(antinuxlear antibodies, ANA )阳性。
【仪器】荧光显微镜【试剂】ANA IIF试剂盒，德国欧蒙公司产品，每个反应区有两种抗原复合基质：猴肝组织和人Hep-2细胞。
【操作程序】1.准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记：(为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
间接免疫荧光
谢谢
应用：筛选药物分子， 提高药物研发效率
局限性：需要荧光标记 的抗体，可能影响药物 活性
3
间接免疫荧光的优缺点
优点
灵敏度高：可 以检测到低浓 度的抗原或抗
体
特异性强：可 以区分不同的
抗原或抗体
操作简便：实 验步骤简单，
易于操作
结果直观：荧 光信号明显， 易于观察和判
断结果
缺点
01
操作复杂，需要熟练
间接免疫荧光
演讲人
目录
01. 间接免疫荧光的原理 02. 间接免疫荧光的应用 03. 间接免疫荧光的优缺点
1
间接免疫荧光的原理
荧光抗体
荧光抗体是间接免疫荧光 实验的关键试剂
荧光抗体由荧光素和抗体 结合而成
荧光抗体可以特异性识别 抗原
荧光抗体在间接免疫荧光 实验中发挥重要作用
荧光标记
01
原理：利用荧光素与抗体结合，形成荧光抗体
02
荧光抗体制备：将荧光素与抗体结合，形成荧光抗体
03
荧光抗体检测：将荧光抗体与待测抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号
04
荧光信号分析：通过荧光信号的强弱和位置，分析抗原的存在和分布情况
检测方法
样品制备：将待测样品进行 固定、染色等处理
抗体标记：将荧光素标记的 抗体与待测样品进行反应
荧光检测：使用荧光显微镜 观察样品中的荧光信号
掌握操作待结果
03
实验结果受多种因素
影响，如抗体浓度、
荧光染料浓度等
04
实验成本较高，需要
购买昂贵的抗体和荧
光染料
改进方向
提高灵敏度：通过优化 抗体和荧光染料，提高 检测灵敏度
间接免疫荧光实验
间接免疫荧光实验学院：第一临床学院学号：2014203020059专业：临床检验诊断学姓名：杨勇文实验目的采用间接免疫荧光法检测I型单纯疱疹病毒患者血清中的单纯疱疹抗体实验原理免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
染色程序主要分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。
第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG抗体。
如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
实验材料单纯疱疹病毒1型病毒感染细胞抗原片、荧光素标记的抗人IgG抗体、PBS洗液、伊文思蓝（用双蒸水稀释至1/6000）实验步骤1、将病毒抗原片从低温冰箱中取出，吹干。
2、将患者血清1：200稀释后，每孔滴加10μL，置湿盒37℃，45min。
3、自来水充分洗涤，PBS洗两次，吹干。
4、于每孔滴加含伊文思蓝的荧光素标记抗体10μL，置湿盒37℃，30min。
5、自来水充分洗涤，PBS洗两次，吹干。
6、吹干、封片、镜检。
7、结果：细胞浆内见翠绿色颗粒状荧光点为典型的阳性细胞，出现“+”即可鉴定此血清抗体为阳性。
结果判定一般根据荧光颗粒的多少，亮度强弱及阳性细胞的数量来判定结果，可分为以下4个等级“—”：无荧光，为阴性。
“+”：阳性细胞≤25%，为极弱的可疑荧光。
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间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性
1 材料和仪器
293细胞
大鼠抗LMP2单克隆抗体
FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体
荧光显微镜
2 检测方法
2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)
2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定
显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
可以4度过夜，这样染色效果好。
二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。
Jdzhangwenjun525@
1. 直接免疫荧光法测抗原
（1）基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
（2）试剂与仪器
λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
λ荧光显微镜
λ玻片架
λ滤纸
λ37℃温箱等。
（3）实验步骤
①滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/ L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
⑤立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+ ++ ++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
（4）注意事项
1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
①标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
②特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
2.间接免疫荧光法测抗体
（1）基本原理
染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。
第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG抗体。
如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
（2）试剂与仪器
λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
λ荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。
λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
λ荧光显微镜
λ玻片架
λ滤纸
λ37℃温箱等。
（3）实验步骤
1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0. 01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
6)重复操作3。
7)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
8)荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
（4）注意事项
1)荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2)每次试验时，需设置以下三种对照：
①阳性对照：阳性血清+荧光标记物
②阴性对照：阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
For immunof luorescence analysis, cells were grown on coverslips, fixed in 4% paraformaldehyde for 20 min, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 (Sigma) in PBS for 15 min, both at room temperature.。