间接免疫荧光

间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性

1 材料和仪器

293细胞

大鼠抗LMP2单克隆抗体

FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体

荧光显微镜

2 检测方法

2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。

2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。

2.3 收集293细胞。用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。

2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。

2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。

2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。

2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。PBS洗8~9遍，保持湿润。

2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。PBS洗8~9遍，室温晾干。(如用PBS有颗粒沉淀)

2.8 伊文氏蓝负染5分钟。超纯H2O洗3遍，室温晾干。

2.9 50%甘油封片。

2.10 显微镜下观察照相。

3 结果判定

显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。检测结果应为阳性。

注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。

2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。

3、丙酮固定过夜效果较好。

PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。

培养液成分太多了。而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。

抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下，有很多protocol。一般一比几百到一万都有，依抗体而定。可以4度过夜，这样染色效果好。

二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。

Jdzhangwenjun525@

1. 直接免疫荧光法测抗原

（1）基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

（2）试剂与仪器

λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

λ荧光显微镜

λ玻片架

λ滤纸

λ37℃温箱等。

（3）实验步骤

①滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/ L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

⑤立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+ ++ ++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

（4）注意事项

1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

①标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

②特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

2.间接免疫荧光法测抗体

（1）基本原理

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

（2）试剂与仪器

λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。

λ荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。

λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

λ荧光显微镜

λ玻片架

λ滤纸

λ37℃温箱等。

（3）实验步骤

1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。