间接免疫荧光检测PBMCPPT课件
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2. 15 ul Ab1 加入玻片上37℃孵育30 min。 PBS洗3 次(3min/次)。
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3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作)
4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察 。
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结果
在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。
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[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
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[方法]
1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（ 含100u/ml肝素）的试管中，混匀。
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Biblioteka Baidu
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将 稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注 意保持两者界面清晰。（关键）
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层 。
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4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加 入另一支已含有2-5mlHank’s液的离心管中， 混匀。
间接免疫荧光 -----检测人外周血单个核细胞
武汉大学基础医学院
免疫学教研室
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熊1 洁
原理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合 ，形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复 合物，在荧光显微镜下呈现荧光。
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外周血单个核细胞分离
------ 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 [原理]
外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单 核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红 细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细 胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左 右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按 密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
5、室温下，1500rpm离心10min。
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6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细 胞浓度。
一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。
7、细胞活力检查
取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高 倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
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材料
1. Ag PBMC 2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1) 3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 4. 洗涤液 5. 荧光显微镜
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方法
1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片 黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干 燥。
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3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作)
4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察 。
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结果
在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。
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[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
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1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（ 含100u/ml肝素）的试管中，混匀。
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2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将 稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注 意保持两者界面清晰。（关键）
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层 。
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4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加 入另一支已含有2-5mlHank’s液的离心管中， 混匀。
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武汉大学基础医学院
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原理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合 ，形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复 合物，在荧光显微镜下呈现荧光。
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外周血单个核细胞分离
------ 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 [原理]
外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单 核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红 细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细 胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左 右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按 密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
5、室温下，1500rpm离心10min。
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6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细 胞浓度。
一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。
7、细胞活力检查
取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高 倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
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材料
1. Ag PBMC 2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1) 3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 4. 洗涤液 5. 荧光显微镜
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方法
1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片 黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干 燥。