间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524)
《间接免疫荧光实验》课件
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。
一、实验步骤1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）（1）对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。
待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散）固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3、通透（目的是使抗体进入胞内）0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
间接免疫荧光
间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG
间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG目的微小巴贝西IgG抗体试剂盒用来检测或半定量人微小巴贝西IgG抗体。
试验总结和解释北美巴贝西虫病是由微小巴贝西虫引起的，通过被感染的蜱的叮咬传播，通常认为贝西虫病可以通过噬吞噬细胞无形体和（或）伯氏疏螺旋体共传播。
传统方法通过外周血涂片制作薄血膜观察红细胞内部特征性的内含物。
免疫荧光法用微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞作为特征性内含物的来源用来进行特异性抗体检测。
病人血清稀释缓冲液在孔板中孵化使得抗体和微小巴贝西抗原反应。
洗板移去未反应的血清蛋白，然后加入荧光标记的抗人IgG，这个结合物需要时间与抗原抗体化合物反应。
再一次洗板移去未反应的结合物。
反应结果通过荧光显微镜，观察，阳性结果被视为苹果绿的荧光内含物包裹在被感染的红细胞里。
空白对照是没有荧光或荧光类似物在对照孔，阳性对照通过高倍稀释确定最高活性或终点稀释。
试剂加样板10*12孔涂有包括微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞，真空包装。
IgG结合物，2.5ML黄色帽滴管含有亲和纯化的DyLight 488荧光标记羊抗人牛血清白蛋白IgM和伊文思兰试剂。
阳性对照，0.5ML蓝色帽滴管含有人反应性的血清1:64的稀释倍数，终点滴度是1：512。
阴性对照，0.5ML红色帽滴管含有人非反应性的血清1:50倍稀释。
封片剂，1ML白色帽滴管含有50%甘油磷酸盐缓冲液。
PBS，1L粉剂溶于1L纯净水中配制成PH7.2的磷酸盐缓冲液。
警告1.对照血清经过食品药品管理局的传染性检测，然而由于没有测试能确保传染性不存在，这些试剂和血清标本应避免皮肤接触和摄入。
2.反应板是经过化学灭活的抗原，具有潜在的传染性，应进行相应处理。
保存试剂盒应存放在2-8℃，在室温中打开滴管和加样板袋。
标本采集血液凝固后离心分离血清，血清移至密封的灭菌管，存放在2-8℃。
如果实验操作超过五天，样品存放在-20℃冷冻。
急性期标本在疾病发作期采样，恢复期标本在间歇期收集检查滴度变化。
间接免疫荧光讲ppt课件
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就 有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一Βιβλιοθήκη （内铺一层浸湿的纱布垫）3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法是一种检测细胞内蛋白质表达及其定位的重要方法。
该方法通过使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以快速准确地检测出目标蛋白质存在的位置。
该方法的操作步骤如下：
1. 取得样本组织，并将其固定在载玻片上。
2. 使用相应的特异性抗体与荧光素作为探针，将其加入样本中。
3. 让样本与探针反应一定的时间，使其充分结合。
4. 用洗涤液清洗样本，去除未与探针结合的抗体和荧光素。
5. 使用激光显微镜观察样本，在激光的照射下，荧光素会发出荧光信号，以此确定目标蛋白质的存在及其位置。
组织免疫荧光间接法具有以下优点：
1. 高灵敏度：与其他方法相比，该方法可以检测到非常低浓度的目标
蛋白质。
2. 高特异性：该方法使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以清楚地
确定目标蛋白质的位置。
3. 快速准确：该方法操作简便，可以在较短的时间内得到结果。
4. 多功能：该方法还可以用于检测不同种类的细胞和组织中的蛋白质。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如：
1. 需要耗费大量的抗体，并且抗体需要提前准备。
2. 对于一些表达较低的蛋白质，由于检测的灵敏度限制，结果可能会
产生假阴性。
3. 由于需要使用荧光素，该方法对于一些染料不稳定的样本有一定的
局限性。
总之，组织免疫荧光间接法是一种快速准确的检测蛋白质存在和位置
的方法，可以广泛应用于医学、生物学等各领域的科研中。
但是，我
们在进行该方法时需要注意其局限性，以保证获得准确的结果。
免疫荧光方法【精品】
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。
常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。
2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。
3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。
4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。
5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。
6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。
二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。
2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。
3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。
根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。
4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。
根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。
注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。
2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。
3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。
4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。
5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。
6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。
(1) 直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体( 如抗 A 和抗 B) 以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2) 间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油： 0.01M PBS (1 ：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5 、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6 、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于4℃保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2 、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清 +荧光标记物 ;(2) 阴性对照：阴性血清 +荧光标记物 ;(3) 荧光标记物对照： PBS+ 荧光标记物。
[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
间接免疫荧光法
活细胞间接免疫荧光法1 转染细胞4h后，用PBST洗涤三次。
2 固定。
用置于-20℃预冷的甲醇进行固定，500 ul/孔，室温作用10 min。
用PBST洗涤三次。
3 封闭4 一抗加入1：100倍稀释的阳性血清（用1%的BSA稀释）200 ul/孔，37℃作用1h。
用PBST 洗三次5 二抗加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY(用1%的BSA稀释)，200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次。
6 荧光显微镜下观察结果。
转染Vero 细胞4h后，用PBST洗涤三次，用置于-20℃保存的冷丙酮(丙酮：乙醇=2：3)进行固定，500uL/孔，室温作用10min。
用PBST洗涤三次，加入1：100倍稀释的ARV阳性血清200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次，加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY，200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次一．实验器材：1．器材：40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等。
2．试剂：单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、叠氮钠（NaN3）等。
二．方法（微量法）1．将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。
用含0.1% NaN3PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml（5000万-1亿/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗（第一抗体）50ul（同时加入AB型血清5ul）振荡混匀，置4℃，至少30分钟。
2．用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。
3．加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。
4．用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。
免疫荧光步骤注意事项
（一）免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。
将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。
而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。
固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。
固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
固定液分为简单固定液和混合固定液。
因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。
西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。
固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。
主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。
3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。
将固定液注入血管，以达到充分的固定。
免疫荧光间接法注意事项
免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。
通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。
免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。
在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。
通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。
【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。
免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。
这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。
在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。
需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。
这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。
免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。
只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。
所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
间接免疫荧光
间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
免疫荧光的雷区该如何避免
5、共定位的视野该如何选择？答：共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达，6、视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点。
答：有两种情况可造成：1，拍照时PBS量过少引起的非特异性；2，PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致成功免疫荧光如下图：三、除此之外，这些注意事项也要牢记1、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。
但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。
如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
2、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。
在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。
使用只有二抗染色的片子3、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。
通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。
前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。
使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。
另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
4、封闭条件的优化选择为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。
封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是万能的封闭血清。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。
免疫荧光实验五大挑战疑难解答
与Molecular Probes 一起成为荧光成像艺术家—免疫荧光实验五大挑战疑难解答Molecular Probes ®免疫荧光实验五大挑战疑难解答引言 .....................................................................................................3五大挑战疑难问题概述..........................................................................3背景荧光及其解决方案.. (4)背景荧光概述 .................................................................................4背景荧光的来源 .............................................................................4如何减少背景荧光 ..........................................................................5荧光成像中的光漂白效应及其消除方法 (6)光漂白效应概述 .............................................................................6如何改进光漂白效应 ......................................................................7荧光成像中的光串色效应 . (8)光串色效应介绍 .............................................................................8如何使光串色效应最小化 (9)活细胞成像中的光毒性及其消除方法 (9)光毒性现象.....................................................................................9如何避免光毒性 ...........................................................................10荧光成像中的光照度不均匀 . (11)光照度不均匀现象 ........................................................................11如何改进光照度不均问题 .............................................................11Molecular Probes ® 荧光检测&分析课堂 ............................................12细胞成像诊断工具小贴士 .. (13)目录Molecular Probes ®免疫荧光实验五大挑战疑难解答免疫荧光实验五大挑战疑难解答引言大多数情况下，科学都是1%的灵感加99%的重复试验，反复审视那些有瑕疵的结果并找出改进之处是收获科学硕果的重要一环。
新手细胞免疫荧光实验常见问题解答
新手细胞免疫荧光实验常见问题解答一提到蛋白实验，大家想到最多的就是Western blot，其实除了WB，免疫荧光技术也是一项很好的检测蛋白定位和表达的辅助试验。
今天，小六儿想跟大家分享一下自己在做免疫荧光试验的一些经验。
1、细胞密度细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。
无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。
免疫荧光对细胞密度的要求不同于细胞划痕实验。
我们在做细胞划痕的时候，一定要等到细胞长满才可以进行后续操作，但是免疫荧光并不需要这么多的细胞数量，镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。
第一张图可能不是很清楚，玻片四周的细胞较多，中间的细胞较少。
20倍镜下DAPI核染色可见细胞密度较大，其中亮度更显著的地方很可能是多层细胞叠加的效果。
那么我们该如何控制好细胞爬片时的密度呢？我们需要考虑的到爬片的尺寸和细胞生长时间。
爬片是一个动词，其实就是将玻片放到培养皿中，让细胞在玻片上生长。
第一点：我们要保证玻片上的细胞以单细胞层生长。
在这一点上，个人认为悬浮细胞很容易被吹打混匀，玻片上的细胞基本上可以保证处于同一层面。
但是贴壁细胞本身很喜欢抱团生长，所以镜下总是一簇一簇的细胞聚集，这种情况下就很难保证细胞生长同一层面了。
那么我们在做这一步的时候，建议大家用10μl的小枪头吸取细胞悬液，在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样（见下图），这么做相当于在缓慢加样的过程中，玻片上的细胞又完成了一次从外向内和从内向外的混匀过程，防止某一部位的细胞聚集。
加样结束后，镜下观察细胞初步密度。
如果细胞密度过大，可以将玻片上的细胞悬液吸回再重新稀释；如果细胞密度可以，只是还存在部分细胞聚集，可以用5ml的注射器针头轻轻拨动细胞悬液，注射器针头相对于10μl的枪头还是细的，不会破坏细胞形态。
第二点：我们要考虑到细胞生长的速度。
间接免疫荧光的心得体会
间接免疫荧光的心得体会
间接法又称为荧光抗-抗体法。
需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。
一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
间接免疫荧光法的注意事项：
1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2.每次试验时，需设置以下三种对照：
阳性对照：阳性血清+荧光标记物
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3.标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4.一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
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间接免疫荧光法操作流程（2）
加荧光标记抗体 温育 清洗 封片 结果判断
1 sec flush 1 min cuvette
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (1)
实验准备阶段： • • • • 清洁工作台 用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区，用纸巾吸干。 在作某些特殊检测时需要使用消毒液清洗加样板。 只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。
EUROIMMUN
温育过程中有液体蒸发
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(6)
按传统的方法温育: 有肉眼可见的FITC结晶。
用滴定平板技术温育： 没有FITC结晶。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(7)
组织切片没有任何反应
主要的原因：
在温育过程中有血清或二抗的丢失。 缓冲液质量不好。
EUROIMMUN
清洗
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法(6)
荧光素标记的二抗（结合物）的使用：
• 荧光二抗直接使用
• 不要将结合物放在阳光直射处。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (7)
载片在第一次清洗后的处理：
• 从小杯中垂直取出载片。 • 用事先叠好的纸巾从背面擦拭载片。
• 不要擦拭反应区之间的间隙。
• 5秒钟内进行第二次温育。 • 从现在开始，避免阳光直射载片，直至实验结束。
EUROIMMUN
载片的擦拭
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (8)
封片：
• 可用聚苯乙烯封片板。 • 盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。 • 用纸巾擦拭载片的背面和四周，不要擦拭反应区间隙。 • 将载片有生物薄片的一面朝下，盖在已准备好的盖玻片上，将盖玻片
间接免疫荧光法实验操作常见问题 及解决方法
EUROIMMUN
间接免疫荧光法所遇问题的解决方法
1. 2. 3.
实验操作 避免错误 识别错误的来源
EUROIMMUN
间接免疫荧光法操作流程（1）
准备 稀释 加样 血清温育
1 sec flush
清洗
1 min cuvette
EUROIMMUN
对照
过度干燥
EUROIMMUN
载片过度干燥(2) (血清温育后5分钟猴肝)
参照
过度干燥
EUROI
Trocknung nach Konjugatschritt 载片过度干燥 (3) BIOCHIP Mitte (20er) ( 酶结合物温育后 5分钟)
参照
过度干燥
EUROI
载片保存不当 (温度或湿度过高)
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1)
当出现问题时，我们应该检查：
• 组织切片完整与否。
• 基质是否有缺损。
• 组织形态是否完整。 • ....
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2)
当出现问题时，我们应该：
• 重做实验，以排除实验操作中的错误。
缓冲液配置只使用PBS
正常操作
缓冲液配置只使用PBS：
背景不干净，1：100滴度结果变阴性
清洗时只冲洗不浸泡
正常操作
清洗时只冲洗不浸泡： 结果转阴，可能出现 Hep-2阴性，肝片阳性 结果
酶结合物1：10稀释
正常操作
酶结合物1：10稀释：
中滴度结果转阴
二抗加样量过多
正常操作
二抗加样30ul：
• 可用防水的黑色标记笔在生物薄片载片的正面作标记。 • 只能在手可触摸的区域作来自记。• 不要触摸生物薄片。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法工作台的布置
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (2)
样本稀释阶段：
• 在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。 • 用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。 • 确保已稀释标本的量足够用于所计划的所有实验。 • 用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。
盖玻片表面有水滴。
显微镜有问题。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的 来源(3)
气泡：
• 封片不正确。 • 除去封片基质中的气体。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的来源(4)
荧光强度减弱：
主要的原因： 显微镜调整的不合适。 本来应直接使用的血清又作了进一 步的稀释。 荧光素标记的二抗暴露在阳光直射 处。 温育后的载片暴露在阳光直射处。
荧光有增强
二抗加样量少
正常操作
二抗加样量为15ul： 荧光减弱
37℃温育
正常操作
37℃温育：
反应性增强，滴度升高
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (4)
血清温育阶段：
• • • • 确保液滴与生物薄片接触良好。 避免样本之间相互接触。 避免快速移动加样板。 确保生物薄片与加样板的反应区吻合良好。
•
避免缩短或延长温育时间。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法(5)
清洗：
• 用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片 (用大口杯，不要用细颈瓶)。 • 流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的小杯中浸洗。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(5)
组织有非特异性反应
主要的原因： 在显微镜镜检过程中生物薄片区域被淬灭。 温育过程中有气泡产生。 温育过程中有液体蒸发。
有肉眼可见的FITC结晶。
EUROIMMUN
显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭
EUROIMMUN
温育过程中有气泡
参照
温度或湿度过高
EUROIMMUN
使用自来水配置PBS-吐温缓冲液
正常操作
使用自来水配置 PBS-吐温缓冲液： 细胞不清晰，背景 不干净
使用蒸馏水清洗浸泡载片
正常操作
使用蒸馏水清洗浸泡载片：
细胞肿胀变形，滴度下降
PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周
正常操作
PBS吐温缓冲液 常温放置1周： 背景不干净
EUROIMMUN
由刮或擦拭所引起的基质损坏
EUROIMMUN
由于挤压所引起的基质损坏
EUROIMMUN
由于掀盖玻片所引起的基质损坏
EUROIMMUN
灰尘颗粒
EUROIMMUN
组织折叠
EUROIMMUN
没有进行血清温育
EUROIMMUN
没有进行二抗温育
EUROIMMUN
载片过度干燥(1) (血清温育后5分钟Hep-2细胞)
粘起来。
• 立即检查盖玻片与载片是否吻合良好 ，必要时可调整盖玻片的位置。
EUROIMMUN
封片
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(9)
结果判断：
• 将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。 • 使用合适的目镜和滤光片。 判断组织用的目镜有：20x，dry, Apertur 0,6 e. g. Planapochromat, Plan Neofluar (Zeiss), HC PL Fluotar (Leica) objectives for evaluation of cells: 40x, dry, Apertur 0,7 e. g. Plan Neofluar (Zeiss), HCX PL Fluotar (Leica) filters: e. g. Exciting filter 450-490 nm, Suppression filter Long-Pass 520 nm • 确保光线合适。 • 如果模板片中ANA的荧光模型不能达到预期的强度，应更换灯泡。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (3)
滴加样本至加样板的反应区：
• 应把窗户关上，以避免已稀释样本的蒸发。
• 因塑料制品会吸附抗体，造成抗体浓度的下降，所以最好用玻璃管稀 释样本。
• 将样本滴加在加样板的反应区。
• 加样量要准确。 • 避免产生气泡。 • 加完所有样本后方可开始温育。
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1)
当出现问题时，我们应该检查是否有：
• • • • • 图像不清 气泡 荧光强度减弱 组织有非特异反应 组织根本不反应
EUROIMMUN
间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2)
镜下图像不清
主要的原因：
封片基质过量。 盖玻片与载片吻合不好。 目镜的镜头模糊不清。 使用了两张盖玻片。 盖玻片表面模糊不清。