间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524)

间接免疫荧光法操作流程（2）
加荧光标记抗体 温育 清洗 封片 结果判断
1 sec flush 1 min cuvette
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (1)
实验准备阶段： • • • • 清洁工作台 用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区，用纸巾吸干。 在作某些特殊检测时需要使用消毒液清洗加样板。 只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。
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温育过程中有液体蒸发
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(6)
按传统的方法温育: 有肉眼可见的FITC结晶。
用滴定平板技术温育： 没有FITC结晶。
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(7)
组织切片没有任何反应
主要的原因：
在温育过程中有血清或二抗的丢失。 缓冲液质量不好。
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清洗
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间接免疫荧光法问题的解决方法(6)
荧光素标记的二抗（结合物）的使用：
• 荧光二抗直接使用
• 不要将结合物放在阳光直射处。
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (7)
载片在第一次清洗后的处理：
• 从小杯中垂直取出载片。 • 用事先叠好的纸巾从背面擦拭载片。
• 不要擦拭反应区之间的间隙。
• 5秒钟内进行第二次温育。 • 从现在开始，避免阳光直射载片，直至实验结束。
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载片的擦拭
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (8)
封片：
• 可用聚苯乙烯封片板。 • 盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。 • 用纸巾擦拭载片的背面和四周，不要擦拭反应区间隙。 • 将载片有生物薄片的一面朝下，盖在已准备好的盖玻片上，将盖玻片
间接免疫荧光法实验操作常见问题 及解决方法
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间接免疫荧光法所遇问题的解决方法
1. 2. 3.
实验操作 避免错误 识别错误的来源
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间接免疫荧光法操作流程（1）
准备 稀释 加样 血清温育
1 sec flush
清洗
1 min cuvette
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对照
过度干燥
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载片过度干燥(2) (血清温育后5分钟猴肝)
参照
过度干燥
EUROI
Trocknung nach Konjugatschritt 载片过度干燥 (3) BIOCHIP Mitte (20er) ( 酶结合物温育后 5分钟)
参照
过度干燥
EUROI
载片保存不当 (温度或湿度过高)
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1)
当出现问题时，我们应该检查：
• 组织切片完整与否。
• 基质是否有缺损。
• 组织形态是否完整。 • ....
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2)
当出现问题时，我们应该：
• 重做实验，以排除实验操作中的错误。
缓冲液配置只使用PBS
正常操作
缓冲液配置只使用PBS：
背景不干净，1：100滴度结果变阴性
清洗时只冲洗不浸泡
正常操作
清洗时只冲洗不浸泡： 结果转阴，可能出现 Hep-2阴性，肝片阳性 结果
酶结合物1：10稀释
正常操作
酶结合物1：10稀释：
中滴度结果转阴
二抗加样量过多
正常操作
二抗加样30ul：
• 可用防水的黑色标记笔在生物薄片载片的正面作标记。 • 只能在手可触摸的区域作来自记。• 不要触摸生物薄片。
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间接免疫荧光法工作台的布置
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (2)
样本稀释阶段：
• 在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。 • 用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。 • 确保已稀释标本的量足够用于所计划的所有实验。 • 用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。
盖玻片表面有水滴。
显微镜有问题。
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的 来源(3)
气泡：
• 封片不正确。 • 除去封片基质中的气体。
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的来源(4)
荧光强度减弱：
主要的原因： 显微镜调整的不合适。 本来应直接使用的血清又作了进一 步的稀释。 荧光素标记的二抗暴露在阳光直射 处。 温育后的载片暴露在阳光直射处。
荧光有增强
二抗加样量少
正常操作
二抗加样量为15ul： 荧光减弱
37℃温育
正常操作
37℃温育：
反应性增强，滴度升高
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (4)
血清温育阶段：
• • • • 确保液滴与生物薄片接触良好。 避免样本之间相互接触。 避免快速移动加样板。 确保生物薄片与加样板的反应区吻合良好。
•
避免缩短或延长温育时间。
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间接免疫荧光法问题的解决方法(5)
清洗：
• 用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片 (用大口杯，不要用细颈瓶)。 • 流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的小杯中浸洗。
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(5)
组织有非特异性反应
主要的原因： 在显微镜镜检过程中生物薄片区域被淬灭。 温育过程中有气泡产生。 温育过程中有液体蒸发。
有肉眼可见的FITC结晶。
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显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭
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温育过程中有气泡
参照
温度或湿度过高
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使用自来水配置PBS-吐温缓冲液
正常操作
使用自来水配置 PBS-吐温缓冲液： 细胞不清晰，背景 不干净
使用蒸馏水清洗浸泡载片
正常操作
使用蒸馏水清洗浸泡载片：
细胞肿胀变形，滴度下降
PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周
正常操作
PBS吐温缓冲液 常温放置1周： 背景不干净
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由刮或擦拭所引起的基质损坏
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由于挤压所引起的基质损坏
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由于掀盖玻片所引起的基质损坏
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灰尘颗粒
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组织折叠
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没有进行血清温育
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没有进行二抗温育
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载片过度干燥(1) (血清温育后5分钟Hep-2细胞)
粘起来。
• 立即检查盖玻片与载片是否吻合良好 ，必要时可调整盖玻片的位置。
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封片
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(9)
结果判断：
• 将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。 • 使用合适的目镜和滤光片。 判断组织用的目镜有：20x，dry, Apertur 0,6 e. g. Planapochromat, Plan Neofluar (Zeiss), HC PL Fluotar (Leica) objectives for evaluation of cells: 40x, dry, Apertur 0,7 e. g. Plan Neofluar (Zeiss), HCX PL Fluotar (Leica) filters: e. g. Exciting filter 450-490 nm, Suppression filter Long-Pass 520 nm • 确保光线合适。 • 如果模板片中ANA的荧光模型不能达到预期的强度，应更换灯泡。
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间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (3)
滴加样本至加样板的反应区：
• 应把窗户关上，以避免已稀释样本的蒸发。
• 因塑料制品会吸附抗体，造成抗体浓度的下降，所以最好用玻璃管稀 释样本。
• 将样本滴加在加样板的反应区。
• 加样量要准确。 • 避免产生气泡。 • 加完所有样本后方可开始温育。
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1)
当出现问题时，我们应该检查是否有：
• • • • • 图像不清 气泡 荧光强度减弱 组织有非特异反应 组织根本不反应
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间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2)
镜下图像不清
主要的原因：
封片基质过量。 盖玻片与载片吻合不好。 目镜的镜头模糊不清。 使用了两张盖玻片。 盖玻片表面模糊不清。