热—酵母双杂交
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交操作步骤
酵母双杂交操作步骤(总9页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交系统步骤
酵母双杂交系统的步骤酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
酵母双杂交法的步骤：1. 阳性克隆的筛选2. 用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆3. 酵母杂合试验确定真阳性克隆4. 阳性克隆的进一步筛选和确证5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究6. 阳性克隆的筛选7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆9. 阳性克隆的进一步筛选和确证扩展资料：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。
针对实际工作中的这种需要，Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。
这项技术的关键是报道基因URA3的引入。
URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。
酵母双杂交
酵母双杂交随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成, 基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。
功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述, 尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。
系统综合分析蛋白- 蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。
酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。
它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术, 可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。
酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。
随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成, 酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
一、酵母双杂交原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
二、酵母双杂交的系统酵母双杂交常用的有两种系统，第一种为LexA系统：DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 第二种为Gal4系统：BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
酵母双杂交原理与实验具体流程
galactosidase. MEL1 is endogenous to both Y187 and AH109. Because αgalactosidase is a secreted enzyme, its activity can be detected by adding X-α-Gal to the selection plate: If MEL1 is active and X-α-Gal is present, the colony will turn blue. lacZ in Y187 exhibits a high level of induced β-galactosidase activity in a poAD通过这个“桥 梁”共同起作用，激活报告基 因（ADE2、HIS3 、 lacZ和 MEL1）的转录。
推荐使用Clontech公司的第三 代载体，pGADT7-Rec 和 pGBKT7进行双杂交筛选，因 为它们产生更少的假阳性。对 于cDNATA regions can be switched to create novel promoters
For GAL4-based systems, either a native GAL UAS or a synthetic UASG 17-mer consensus sequence (Heslot & Gaillardin, 1992) provides the binding site for the GAL4 DNA-BD. If you are putting together your own one- or two-hybrid system, you must make sure that the reporter gene's promoter will be recognized by the DNA-BD moiety encoded in your DNA-BD fusion vector.
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理酵母双杂交技术是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，通过这种技术可以发现蛋白质之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的分子机制。
酵母双杂交技术的原理是利用酵母细胞中的转录因子结合域来检测蛋白质之间的相互作用，从而筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质。
下面将详细介绍酵母双杂交技术的原理。
首先，酵母双杂交技术的原理基于酵母细胞中的转录因子结合域。
酵母细胞中存在着一些转录因子，这些转录因子在细胞内起着调控基因表达的作用。
这些转录因子通常由两个功能域组成，一个是DNA结合域，用于结合DNA上的特定序列，另一个是活化域，用于激活基因的转录。
利用酵母双杂交技术，可以将待测蛋白质与转录因子的DNA结合域进行融合，从而构建出一种能够识别特定DNA序列的融合蛋白质。
其次，利用构建的融合蛋白质来筛选相互作用蛋白质。
在酵母双杂交技术中，将构建的融合蛋白质导入酵母细胞中，然后将另一个蛋白质与活化域融合，形成另一种融合蛋白质。
如果待测蛋白质与另一融合蛋白质相互作用，就会激活转录因子的活化域，从而促使特定基因的表达。
通过检测这些特定基因的表达情况，可以筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质。
最后，酵母双杂交技术的原理是基于筛选出与待测蛋白质相互作用的蛋白质。
通过这种技术，可以发现蛋白质之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的分子机制。
酵母双杂交技术的原理简单易懂，操作方便，因此被广泛应用于蛋白质相互作用研究领域。
总之，酵母双杂交技术是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，其原理是基于酵母细胞中的转录因子结合域，利用构建的融合蛋白质来筛选相互作用蛋白质，最终揭示生物学过程中的分子机制。
这种技术的应用为解析蛋白质相互作用提供了重要的手段，有助于深入理解生物学过程中的分子调控网络。
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
该技术利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的基本原理是利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
其中一个融合蛋白包含了DNA结合域，另一个融合蛋白包含了激活域。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的优点是可以在活细胞中直接检测蛋白质相互作用，而不需要纯化蛋白质。
此外，该技术可以用于高通量筛选，可以同时检测多个蛋白质相互作用，从而加快了研究进程。
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用于研究蛋白质相互作用、信号转导通路、基因调控等方面。
例如，利用酵母双杂交技术可以筛选出与某个蛋白质相互作用的蛋白质，从而揭示其功能和调控机制。
此外，该技术还可以用于筛选药物靶点，从而为药物研发提供新的思路和方法。
酵母双杂交技术是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白
质相互作用和信号转导通路等方面。
该技术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，是现代生命科学研究中不可或缺的工具之一。
酵母双杂交实验
酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）1、酵母质粒提取试剂Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol0.1mol/L EDTABuffer II 50mM/L Tris20mM/L EDTABuffer III 10mM/L Tris1Mm/L EDTA2、操作步骤：(1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。
.(2)37℃水浴1h。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。
(4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
(7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。
(8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。
(9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
(11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。
(12)取上清，加入等体积的异丙醇。
(13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。
(14)4℃10000rpm 离心5min。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。
(1)M 醋酸锂（Lithium Acetate）(2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v）(3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）800μl 50%PEG100μl 10×TE100μl 10×LiAc1ml 总体积(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE(5)11ml 10×LiAc(6)78ml ddH202、操作步骤：(1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
下面将介绍酵母双杂交的步骤。
第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。
一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。
第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。
一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。
DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。
第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。
初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。
确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。
第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。
β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。
Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
酵母双杂交技术的原理及其应用
酵母双杂交技术的原理及其应用1. 引言酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。
2. 原理酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。
其基本步骤如下：1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。
2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录因子的表达。
3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列，使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。
4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。
3. 应用3.1 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。
通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。
这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。
3.2 酶底物筛选酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。
通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。
这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。
3.3 药物靶点筛选利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。
这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。
3.4 蛋白质与DNA/RNA相互作用研究除了研究蛋白质间相互作用外，酵母双杂交技术还可以用于研究蛋白质与DNA/RNA的相互作用。
通过将DNA/RNA序列与目标蛋白质的编码序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以检测蛋白质与DNA/RNA的相互作用，并进一步研究该相互作用的功能和调控机制。
酵母双杂交名词解释
酵母双杂交名词解释酵母双杂交名词解释酵母双杂交是基因学领域的研究方法之一，其主要是通过两种不同类型的酵母菌之间的交配达到检测基因交互作用的目的。
在酵母双杂交中，每个基因都被分别连接到酿酒酵母中唯一的两个分子，利用蛋白质交互作用而使得两种酵母菌互相连接并产生可观测的效果。
本文将按类别对酵母双杂交进行详细解释。
1. 酵母：酵母是一类单细胞真菌，研究人员可以利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物进行基因研究。
酵母具有许多极其有用的特性，比如其遗传可重复性很高，因此研究人员可以利用酵母来进行基于DNA的研究。
2. 双杂交：双杂交是指一种检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过在酵母的细胞内部形成蛋白质复合物，而使蛋白质相互作用的结果在酵母细胞内可观测到，从而达到检测蛋白质交互作用的目的。
在酵母双杂交中，两种酵母菌互相连接，产生可观测的效果。
研究人员可以利用该方法来检测不同蛋白质之间的交互作用。
3. 名词解释：酵母双杂交可以被定义为一种鉴定基因交互作用的方法，该方法通过酵母细胞内的蛋白质交互作用导致的效果来检测基因交互作用。
同时，酵母双杂交也可以被定义为酿酒酵母之间的一种孢子杂交法。
4. 操作方法：酵母双杂交技术需要利用DNA重组方法，将目标基因在拼接时连接到酵母二杂交系统（Y2H）中的激活子，而将其连接到另一种被测体系（prey）中，还需要使用质粒在酵母菌当中进行转化；随后，其菌落在关键培养基上生长出菌丝，涂上试纸液，观察菌落是否变色，判断蛋白之间的作用是否发生。
总之，酵母双杂交在基因学领域中发挥着重要的作用，在生物学的方方面面都有着广泛的应用。
它是许多基因测序研究的前提，也是基因组学的核心研究方法之一。
我们相信，随着科技的不断提高，这一技术将发挥更加巨大的作用，进一步推动基因学领域的发展。
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酵母双杂交酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。
典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
基本原理二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。
主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。
常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
结构组成酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。
利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞核抗原(proliferating-cell nuclear antigen，PCNA)的结合序列vi 等。
此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵ 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
例如已报道成功分析了RAP1 与RIF1ii、P21cip1 与CDK2iii、p16 与CDK4iv 等之间的相互作用。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA 吉合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。
例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。
其中双筛选系统用二种不同的报告基因（常用lacZ和HIS3）有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，可明显减少假阳性。
⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统毗也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。
在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。
表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT共同转染哺乳动物细胞系。
报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。
假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。
用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果。
且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。
并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。
因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段常见问题的解决与改进酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。
所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因被激活。
主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。
另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，则也可单独激活报告基因的表达。
因此，为排除假阳性就需要作严格的对照试验。
应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。
目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。
另外，报告基因通常整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。
即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：（1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3）一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体（motif）如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。
十年来，酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进，并且已取得较好的效果〔2，3〕。
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。
所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来〔4〕。
造成假阴性的原因主要有两方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。
这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。
二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。
目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题，但也应予以重视。
转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。
转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。
更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时，共转化则可以减弱或消除这种毒性。
一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中，通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。
目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。
而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。
因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。
现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法酵母双杂交技术发展与应用的趋势在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节〔18〕。
第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图（linkage-map）〔19〕。
Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类,然后对其中的四类（非编码序列除外）通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图〔20〕。
这是以往的实验所难以获得的。
为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTEC公司在Merck-Washington 大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。
它主要有以下特点：（1）来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA （2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡（3）含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。
这样既避免了5'非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。
这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多.有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。