原核表达条件优化

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红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

ＡｑｕａｔｉｃＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌｓｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０２５，Ｃｈｉｎａ；
达量最大，分子质量大小与预测值相符，该蛋白主要以包涵体形式存在。利用ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和层析柱使ＴｄＴ蛋白
得到进一步纯化，最佳咪唑洗脱浓度为３００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔ分析显示，该融合蛋白可与鼠抗Ｈｉｓ —ｔａｇ单克隆抗体发生特异性的结合，表明表达蛋白为目的蛋白。关键词：红笛鲷；ｔｄｔ基因；原核表达；优化；纯化；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析
２．ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｙｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｔｕｒｅｐｅｐｉｆｄｅＬｕｔｊｎＵａＳｓａｎｇｕｉｎｅｕｓＴｅｒｍｉｎａｌ
第３３卷Байду номын сангаас
第１期
广东海洋大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

【关于优化原核表达的一些总结】

我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。

大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。

另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。

同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。

我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。

2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。

乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。

若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。

若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。

3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。

【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。

２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。

原核表达条件的优化

【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。

“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。

挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。

胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。

有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。

胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。

这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。

有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。

硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。

这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。

Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。

丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化

丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化作者：张利华,吴文燕,黄璐琦,申业来源：《中国中药杂志》2012年第24期[摘要] 目的：在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上，为研究丹参SmJAZ蛋白的功能，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白，并对其表达条件进行优化。

方法：利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上，转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行诱导表达。

结果：对影响重组蛋白表达的4个因素，即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化，确定丹参SmJAZ1重组蛋白最适表达条件。

IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响；随诱导时间和诱导温度增加，SmJAZ蛋白的表达量增加；而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响。

结论：丹参JAZ1蛋白在30 ℃温度条件下，重组菌生长2 h（A600=0.9），加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG，诱导20 h后，表达条件最合适。

[关键词] 丹参；JAZ1；原核表达；条件优化[稿件编号] 20120927008[通信作者] *申业，Tel：（010）64014411-2956，E-mail：shenye@；*黄璐琦，E-mail： huangluqi@ 茉莉酸（JA）和它的衍生物（JA-Ile）是植物体内广泛存在的一种植物激素，参与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫和次生代谢调控。

JAZ（jasmonate ZIM-domain）转录抑制蛋白是JA信号通路重要成分，在茉莉酸信号传导途径中起着重要的调控作用。

通常，植物体内JAZ蛋白与MYC2等转录因子结合，从而抑制了JA早期反应基因的表达；当植物受到环境胁迫时，体内具有生物活性的JAs积累，比如JA-Ile[1]，JA-Ile促进SCF COI1与JAZ二聚体的结合，形成COI1-JA-Ile-JAZs复合体，随即JAZ被多聚泛素化，进入到26S蛋白酶体降解，使得有活性的MYC2被释放，从而启动了茉莉酸响应基因的转录[2]。

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

１０ｍｌｍＬＩＴ诱导６ｈ时条件下蛋白表达量最高。ＳＳＰＧＥ电泳检测的纯化目的蛋白约为９Ｄ，预．ｍｏ／ＧＰＤ－Ａ０ｋａ与计大小一致。ＶＰ２基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。关键词：犬细小病毒；２基因；合蛋白；化与纯化ＶＰ融优
犬细小病毒ＶＰ２基因原核表达条件优化与蛋白纯化
陈胜男，素贞，翟少伦，子健马简
（疆农业大学动物医学学院，鲁木齐新乌８０５）３０２
摘
要：为了提高犬细小病毒ＶＰ２基因在大肠杆菌Ｅ．ｃｌＢＬ１（ｏｉ２ＤＥ３中的表达量，过改变诱导温度、导时）通诱
ｐａｍｉｃｅｉｈａｃｌ，Ｌ２ＤＥ３ｌｓｄＥｓｈｒｃｉｏｉＢ１（）ｗａｈｐｉａｅ．ｍｍｏ／ＰＴＧｒｎｕｅｏｔｓｔｅｏｔ１ｗｈｎ１０ｍｌｍＬＩｗｅｅｉｄｃｄｆｒ６ｈａ
３ ℃．５ＦｕｓｏｏｅｎｐｕｉｉｄｂｙＧｌｔｔｏｐｒｓＢｆｉｉｙｃｌｍｎｗａｂｏｕＤａｗｈｃｒｉｎｐｒｔｉｒｆｅｕａｈｉｎｅＳｅｈａｏｅ４ａｆｎｔｏｕｓａｔ９０ｋｉｈｗｅｅ
ｓｏｏｅｎｓｔｔｅｂｓｏｔｙｎｇｓ — ｎｉａｃｎｆＣＰＶ．ｉｎｐｒｔｉｅｈｙｗｏｒｓＣａｎｎｄ：ｉｅｐａｒｖｉｕｓ；ＶＰ２；ｆｉｎｐｒｔｉｏｔｍｉａｉｎｒｆｃｔｏｖｏｒｕｓｏｏｅｎ；ｐｉｚｔｏｎａｄｐｕｉｉａｉｎ

原核表达条件优化

原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【摘要】根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度.结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37C、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】6页(P52-57)【关键词】溶藻弧菌;dtd;基因克隆;原核表达;条件优化【作者】陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;仲恺农业工程学院,广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S941溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，又名藻朊酸弧菌、解藻酸弧菌、解藻朊酸内克氏菌[1]，是一种嗜盐嗜温、兼性厌氧的海生革兰氏阴性短杆细菌。

原核表达系统三大要素的选择及优化

原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

pGEX—4T—1—Neurexin 1β原核表达载体构建及表达条件的优化

pGEX—4T—1—Neurexin 1β原核表达载体构建及表达条件的优化作者：徐岩王梦林侯筱宇来源：《中国科技纵横》2015年第24期【摘要】目的：构建Neurexin 1β（Nrx 1β）原核表达重组体。

方法：以pcDNA3.1-Myc-Nrx 1β真核表达载体为模板，经PCR扩增Nrx 1β目的基因，然后将其亚克隆入pGEX-4T-1载体，构建其原核表达载体，转化入宿主菌BL21，选用IPTG进行诱导表达，优化表达条件，SDS-PAGE检测Nrx 1β的蛋白表达。

结果：N rx 1β目的基因扩增成功，经克隆后成功连接至pGEX-4T-1，重组体酶切结果及测序结果与预期结果一致。

转化入BL21后在IPTG的作用下成功表达，且在24°C时， IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导12 h后Nrx 1β的蛋白表达量最高。

结论：该研究成功构建了pGEX-4T-1-Nrx 1β原核表达载体，并优化了Nrx 1β的蛋白表达条件，为下一步研究该蛋白质的功能奠定基础。

【关键词】Neurexin 1β 原核表达载体表达条件【Abstract】Objective： To construct the prokaryotic expressing plasmid recombinant for Neurexin 1β （Nrx 1β）. Method：Nrx 1β cDNA was obtained by PCR from pcDNA3.1-Myc-Nrx 1β eukaryotic expression vector， and cloned into the pGEX-4T-1 vector. The positive prokaryotic expressi on vector was transformed into Escherichia coli BL21. The expression of Nrx 1β was induced by IPTG with optical condition and was detected by SDS-PAGE. Result：Gene of Nrx 1β was successfully amplified， and the PCR product was ligated into pGEX-4T-1. Results of restriction enzyme digestion and sequencing were consistent with expectations. After transforming into BL21，the protein expression was successfully induced by IPTG. Conclusion：The study constructed Nrx 1β prokaryotic expressing plasmid recombinant successfully， and optimized the protein expression of Nrx 1β，which provide the foundation for studying the role of Nrx 1β in nervous system.【Key words】Neurexin 1β； prokaryotic expressing vector； expression condition1 引言Neurexin（Nrx）是一种突触前膜蛋白，他们大多定位于突触前膜并含有一个跨膜结构域。

原核表达条件优化

原核表达条件优化【专题讨论】原核表达条件优化！之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET 系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。

如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。

pET载体原核表达鉴定与条件优化

pET28a-sumo载体原核表达鉴定与条件优化一、是否表达从-80℃去除冻存菌，以10ul接种5ml 含Kan+LB培养液的试管中，置摇床中37℃，220rmp复苏12h。

再以复苏菌接种到新的试管中，置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）加入终浓度至1mMIPTG 37℃诱导过夜，收集菌液。

取pet28a-sumo 载体1mM诱导对照，pet28a-sumo未诱导和1mM诱导菌液进行SDS-PAGE鉴定。

如在预期位置出现条带，则进行WB鉴定是否表达。

二、感受态可以尝试BL21，BL21(DE3)还原型，Rossta对6种稀有密码子优化以及BL21(DE3)ply促可溶表达菌株。

三、IPTG浓度向试管中加入4ml Kan+培养液，接种20ul测序正确的表达菌。

置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）。

向双份中的其中一份诱导菌和空载体对照菌中加入IPTG至终浓度为0.1,0.25,0.5,0.75和1mM的，37℃诱导过夜。

取各梯度进行SDS-PAGE电泳，取诱导量大的最低稀释度进行下一步诱导。

四、诱导时间以诱导量大的最低稀释度进行诱导，分别在15℃、30℃及37℃诱导过夜，取样进行SDS-PAGE鉴定。

五、上清or包涵体取复苏菌100ul加至30ml Kan+LB培养液中培养，以上述条件进行诱导，8000rpml离心15min收集菌体,至冰上以工作6s停9s超声20min,再次以8500rpm离心20min,取上清80ul, 80ulPBS重悬沉淀+20ul 4XSDS-PAGE煮样进行电泳检测。

六、附注操作详细：取1ml菌液12000rpm离心后3min，用PBS涮洗一次后，取80ulPBS重悬菌体+20ul 4XSDS loadingbuffer煮样10min，12000rpm离心10min取上清上样。

SDS-PAGE电泳：取上层10ul 跑两份SDS-PAGE电泳，80V 20min后换120V继续电泳，直至胶板下沿。

原核表达系统三大要素的选择及优化

原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。

草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件优化

草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件优化张卿;邢宇;曹庆芹;秦岭【摘要】[Objective]The experiment is to establish and optimize the prokaryotic expression conditions of FaMRLK47 protein in strawberry (Fragaria× ananassa Duch.'Benihoppe').[Methods]The expression efficiency and yield of FaMRLK47 protein induced by IPTG at 0.5 mmol/L and 1mM were compared and analyzed at 0,2,4,6,8,and 12 h.[Results]The results showed that the expression efficiency and yield of FaMRLK47 protein were high at 1mM concentration and 8h induction.[Conclusion]The prokaryotic expression system of strawberry FaMRLK47 protein was optimized and used in the study of the specific binding between FaMRLK47 and oligosaccharides.%[目的]优化草莓FaMRLK47蛋白原核表达条件并在研究中应用.[方法]以八倍体草莓‘红颜'(Fragaria×ananassaDuch.‘Benihoppe’)为试材,对比研究异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thio-galactopyranoside,IPTG)在0.5 mmol/L和1 mmol/L处理,对比分析0、2、4、6、8、12h等不同时间FaM-RLK47蛋白诱导表达效率和产量.[结果]IPTG在1 mmol/L下诱导8h,FaMRLK47蛋白的表达效率和产量高.[结论]优化草莓FaMRLK47原核诱导表达体系并检测FaMRLK47与寡糖的特异性结合.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2018(033)001【总页数】5页(P10-14)【关键词】FaMRLK47;草莓;蛋白原核表达体系【作者】张卿;邢宇;曹庆芹;秦岭【作者单位】北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206;北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206;北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206;北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】Q946.1类受体蛋白激酶家族(Receptor-like kinases，RLKs)是植物中的一个超级跨膜蛋白家族，该蛋白家族细胞膜外部分具有信号识别功能的氨基端和膜内部分具有激酶功能的羧基端[1,2]。

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

ＪＮＺ — ｉｎＭｕ—ｚｅ，ＨＮＷｅ —ｈｎＺＡｈｏ— ｕ，ＨＯＳｎＩｉｊ，ＡＳＡａｈｎＳＥｉｏｇ，ＨＩａｈａＺＡｅＳ
（ｏｅｅｆＡｉａｄｃｅＸｎａｇＡｒｕｔｒｌｎｖｒｔ，Ｕｕｎｉ３０２Ｃｉａ）Ｃｌｇｎｍｌｉｎ，ｉｉｎｇｉｌａｉｓｙｒｒ０５，ｈｎｌｏＭｅｉｊｃｕＵｅｉｑ８
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ＩＴＧｃｎｅｔｔｎ，ｉｄｃｉｎｔｎｅｅａｕｅｔＳ —ＣＤｕｉｎｐｏｅｎｗｓｓｕｉｄｉｉｐ－ＰｏｃｎｒｉａｏｎｕｔｉａｄｔｍｐｒｔｒＧＴｏｍｅｏＶＮｆｓｒｔｉａｔｄｅｎｔｓａｏｈ
新疆农业科学２１，９２：３３００２４（）３６— ４
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ＤＩＣＫ：５—１９／．０２３２２３．０Ｏ：ＮＩ６０７Ｓ２１００．２７０８网络出版时间：０２— ２２：７０２１３— ２３：７
Ａｓａｔ【ｂｅｔｅｎｔｏ】ｄｒｏｍｒｅｈｉｏｂｐｅｉｖｌｆＳ — Ｄｂｔｃ：ＯｊｃｖｄｒｉａＭｅｄＩｏｅｔｉｐｏｅｓｌｌｅｒｓｎｌｅｏＧＴＣＶＮｈｎｒｖｔｄｓｕｅｘｓｏｅ
果】大肠杆菌Ｂ２（Ｅ）Ｌ１Ｄ３转化菌在３￣培养３５ｈ０＝．１），７Ｃ．（Ｄ１３４时加入ＩＧ使终浓度为１ｍｌ，ＰＴｏＬ然后ｍ／

原核蛋白表达纯化条件优化方案

原核蛋白表达纯化条件优化方案1，收菌每10ml一EP管，弃上清后-40度冻存。

（一）缓冲液PH的确定：2，处理镍柱：（流速控制在30d/min, 5ml注射器）1）用3-5ml去离子水洗柱；2）1ml硫酸镍挂柱；3）3-5ml去离子水洗去余镍；3，取出菌体20管，每4管（40ml）为一组，分为5组。

菌体沉淀置于冰浴中解冻，分别用1ml PH6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的PBS重悬，分别超声至澄清。

离心15000rpm,10min，弃沉淀。

4，纯化：4）binding buffer 3ml平衡柱子；5）上样，保留穿透液；6）洗脱，使用100（or200 mM）咪唑洗2个柱体积；7）3-5ml去离子水洗柱，再用另一PH缓冲液重复步骤4）-6）洗柱：先用去离子水洗3-5个柱体积，用EDTA（50mM）洗去NI 3个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积；用NaOH（1M）洗5个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积，用20%乙醇洗3-5个柱体积，封柱于20%乙醇，4度保存；5，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性/非变性对比。

找到Trimer含量最高的缓冲液PH，并进行后面的优化。

对照/全菌/各PH穿透/各PH样品。

6，该步骤中选定的缓冲PH固化用于以下纯化、透析、ELISA包被、筛选等各个步骤。

（二）咪唑浓度的选择8，取出新1组，选用上一步骤确定的缓冲液超声；9，上样后分别使用60/80/100/150/200mM咪唑洗脱，每次2个柱体积，10，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性电泳，选用含量最高的咪唑浓度作为洗脱条件。

顺序：对照/全菌/穿透/各浓度咪唑洗脱样品；（三）疏水抑制剂的选择11，选用第一步确定PH值的缓冲液，取12组；12，分别在体系中加入咪唑（10/20/40/50mM/L）/脲（<4M/L:1/2/4M/L）/吐温（<1%）/甘油(5%,10%,15%)/tritonX-100(0.1%)/不加；13，重复步骤重复步骤4）-6），使用第二步选定的咪唑浓度洗脱；14，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），非变性电泳。

红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

第30卷第6期广东海洋大学学报 V ol.30 No.62010年12月 Journal of Guangdong Ocean University Dec. 2010收稿日期：2010-06-13基金项目：国家自然科学基金“红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究”（40906073）第一作者：魏世娜（1985－），女，硕士研究生，主要从事水产动物病害防治。

Email : weishinazi@ 通讯作者：简纪常，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。

Email : jianjc@红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化魏世娜，王蓓，鲁义善，吴灶和，简纪常（广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江 524025）摘要：通过克隆编码红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）非特异性毒性细胞受体蛋白-1（nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1, NCCRP-1）成熟肽基因序列，然后与载体连接构建pET21a-NCCRP 融合蛋白表达载体，将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。

SDS-PAGE 分析表明，在异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度0.8 mmol/L 、37 ℃条件下培养3 h 后表达量最大，分子大小与预期值相符，融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP 柱子使其得到进一步纯化；Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag 单克隆抗体发生特异性结合，说明获得该表达产物。

关键词：红笛鲷；NCCRP -1基因；原核表达；条件优化；纯化中图分类号：S942.1 + Q344+.13 文献标志码：A 文章编号：1673-9159（2010）06-0025-06Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of CrimsonSnapper (Lutjanus sanguineus ) NCCRP-1 GeneWEI Shi-na, WANG Bei, LU Yi-shan, WU Zao-he, JIAN Ji-chang(Fisheries College of Guangdong Ocean University , Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals & Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions ,Zhanjiang 524025, China )Abstract ：The cloned mature peptide of Lutjanus sanguineus NCCRP-1 was connected with the expression vector pET-21a to construct fusion protein pET21a-NCCRP. This recombinant was transformed into Es cherichia coli BL21 and mainly expressed in the form of inclusion body. The optimal condition for the expression of this protein was that the cells were induced at 37 ℃, in 0.8 mmol/L of IPTG for 3 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by SDS-PAGE analysis, then purified by HisTrap HP column. The result of Western blot show that the expressed product could be combined with mouse anti-His-tag Mab. The fusion protein which lays the basic could be obtained for the future research on function and applied in fish innate immunity. Key words: Lutjanus sanguineus ；NCCRP-1 gene; conditions optimization; purification红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）又名红鱼，隶属鲈形目、笛鲷科、笛鲷属，是我国南方沿海的重要经济鱼类之一。

人黑素瘤相关抗原D4原核表达条件的优化

人黑素瘤相关抗原D4原核表达条件的优化邓芸婷;顾永耀;蔡丹昭;罗育;高精洧;李霞琼;黄冠文;谢小薰;贺菽嘉【摘要】目的:探索黑素瘤相关抗原D4 (MAGE-D4)基因工程菌原核诱导表达的最佳条件,以提高目的蛋白产量.方法:设置不同宿主菌(DH5α、TB1、Rosetta)、诱导时机(重组菌分别培养0.5～3 h后进行诱导)、诱导剂IPTG浓度(0.1～0.9 mmol/L)和诱导时间(1～8 h)等条件,诱导MAGE-D4重组质粒表达,通过SDS-PAGE电泳和Image J软件扫描电泳图谱的方法,对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析.通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法对35例肝癌患者血清MAGE-D4抗体进行检测,分析MAGE-D4融合蛋白的免疫活性.结果:将重组质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,菌液OD600达到0.8时加入IPTG至终浓度0.9 mmol/L,37℃诱导培养7h,可有效提高目的蛋白的表达量.可溶性MAGE-D4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的25.5％.肝癌患者血清中MAGE-D4抗体的阳性率为28.57％(10/35),其MAGE-D4抗体平均效价明显高于正常人(P＜0.05).结论:本研究优化了MAGE-D4融合蛋白的原核表达条件,获得了可溶性、具有免疫活性的重组蛋白.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2019(036)007【总页数】6页(P1050-1055)【关键词】黑素瘤相关抗原D4;原核表达;优化【作者】邓芸婷;顾永耀;蔡丹昭;罗育;高精洧;李霞琼;黄冠文;谢小薰;贺菽嘉【作者单位】广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学基础医学院病理学教研室,南宁530021;广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学广西高校生物分子医学研究重点实验室,南宁530021;广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学广西高校生物分子医学研究重点实验室,南宁530021;广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学五年制临床医学2012级9班,南宁530021;广西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,南宁530021;广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,南宁530021;广西医科大学广西高校生物分子医学研究重点实验室,南宁530021【正文语种】中文【中图分类】Q786黑素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)家族的部分成员在肿瘤中高表达却在正常组织中限制性表达的特点，使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶抗原[1-2]。

人乙醛脱氢酶2的原核表达及条件的优化

人乙醛脱氢酶2的原核表达及条件的优化黄娟;张小骥;刘传青;向玲娟;陈孝平;吴元欣【摘要】The human acetaldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)gene was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with fusion protein tag GST to construct prokaryotic expression recombinant plasmid pGEX-4T-1-ALDH2.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3 ).After being induced by IPTG,expression of the purpose protein was verified by SDS-PAGE analysis,and through optimizing the ex-pression conditions(0.1 mmol· L-1 IPTG,28 ℃,10 h),the purpose protein present in supernatant achieved 25% of that in pellet of the bacterial lysate because of the fusion protein tag GST.It showed that the fusion pro-tein tag GST and low temperature could improve soluble expression of ALDH2 in Escherichia coli .%通过双酶切、连接转化等方法将人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因克隆至载体 pGEX-4T-1上，构建原核表达重组质粒 pGEX-4T-1-ALDH2。

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化牛金中;黄瑜;汤菊芬;鲁义善;汪志文;郑琦;蔡佳;简纪常【摘要】[Objective]Because complement 3 (C3) plays an important role in disease-resistant infection of tilapia, this study aim to optimize the production of recombinant C3 by a prokaryotic expression system for future disease control studies.[Method]According to the functional domain sequence of the cDNA segment of tilapia complement 3 gene in NCBI, we selected a pair of specific primers with cleavage site by C3 gene segment.After ligation and transformation,the recombinant C3 gene segment and the prokaryotic expression vector pGEX-4T were digested with restriction endonucleases EcoRI and Xho I,the recombinant plasmid pGEX-4T-C3 of C3 gene segment was constructed and introduced into Escherichia coli to detect the target protein. Then the optimum gene expression conditions were optimized, and the target protein was identified by Western Blot.[Result]The recombinant plasmid pGEX-4T-C3 of C3 gene segment was successfully constructed.The length of coding region of tilapia C3 gene segment was 1 341 bp. The molecular weight of target protein was about 75 ku, which was consistent with the expected results. The optimal time, concentration and temperature were 4 h, 0.2 mmol/L and 37 ℃, respectively. The target protein w as mainly in the form of inclusion bodies. The recombinant protein can specifically bind to GST-Tag monoclonal antibody.%[目的]补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件.[方法]根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定.[结果]C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功.罗非鱼C3基因片段编码区长度为1341 bp.获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符.最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37 ℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在.重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2018(038)002【总页数】5页(P80-84)【关键词】尼罗罗非鱼;补体3;原核表达;条件优化【作者】牛金中;黄瑜;汤菊芬;鲁义善;汪志文;郑琦;蔡佳;简纪常【作者单位】广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院 // 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q959.483补体是一组存在于人和动物体液及细胞表面，经活化后具有生物活性，可介导免疫和炎症反应的蛋白，也称为补体系统[1]。