中药中黄曲霉毒素检测方法研究
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中药中黄曲霉毒素检测方法 研究
四川省食品药品检验检测院 中药室
中药中黄曲霉毒素检测方法研究
1 真菌毒素简介 2 黄曲霉毒素的检测意义 3 黄曲霉毒素的种类及性质 4 现有检测方法介绍 5 中药黄曲霉毒素检测药典收载状况 6 药典检测方法详解 7 安全防护措施
真菌毒素简介
是真菌在适宜的环境条件下，在食品或 饲料里生长所产生的代谢产物，对人类 和动物都有害
黄曲霉毒素
显微镜下 的黄曲霉
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
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黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO） 的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种 毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒霉素，是目 前已知霉菌中毒性最强的。
黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
醚、己烷和乙醚中
中性溶液及弱酸性 溶液中较稳定，强 酸性溶液中稍有分 解，强碱溶液中分 解迅速
紫外线对低 浓度黄曲霉 毒素有一定 的破坏性
纯品为无色结晶.在紫 外光灯下，B1、B2发 蓝色荧光，G1、G2发 绿色荧光
耐高温，一般烹调 温度不能破坏，B1 的分解温度为 268℃
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
光化学衍生法：紫外光灯（254）nm照射，操 作简单，对衍生温度无要求，无需冲洗
黄曲霉毒素的衍生化
AFB1
衍生原理
紫外光灯照射
AFG1
紫外光灯照射
黄曲霉毒素的衍生化
增强B1、G1的荧光强度。
黄曲霉毒素的检测
荧光检测器，激发波长 = 360nm (或 365nm) ， 发射波长= 450nm
2010年版一部
正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、 胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残 留量检查
附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法
历年中国药典标准收载状况
2010年版一部第二增补本： 修订了附录方法
删除了流速规定 增订了另一种衍生方法：即光化
学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定
真菌毒素简介
毒素名称
毒素来源
毒性
黄曲霉毒素（常见 黄曲霉、寄生曲霉等 毒素）
黄绿青霉毒素
黄绿青霉
肝毒性 神经毒性
橘青霉毒素
橘青霉
肾毒性
黄天精和环氯素 岛青霉
肝毒性
T2毒素
拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀 心衰、出血 菌
黄曲霉毒素的起源
第一次发现黄曲霉毒素的起源事件： 1960年，英国发现有10万只火鸡死于一种以前没见过的病，
中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解
方法来源：《中国药典》2010年版第二 增补本附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法
基本步骤
提取 过柱 洗脱 测定
提取 上样
检测流程
样品前处理
过滤除杂
免疫亲和柱 纯化
洗涤
柱后衍生、 HPLC检测
稀释 洗脱
黄曲霉毒素检测主要设备
气孔操作架
免疫亲和柱
黄曲霉毒素检测主要设备
黄曲霉毒素的种类及性质
生长温度
最低6-8℃，最高达44-46℃，32℃时黄曲霉 毒素B1的产量最高。
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种： B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.
基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘 邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻 酮（香豆素）.前者为基本毒性结构，后者与致癌有 关.
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、 粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类 中药；贮存期中药材、中成药; 油性成分多的 中药材
黄曲霉毒素的检测意义
国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多
欧盟（μg/kg）
德国
中国香港
（μg/kg） （μg/kg）
灵敏度高，可用于痕量检测
检测方法详解
方法难点：
痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复
性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品
黄曲霉毒素在样品中分布不均匀 中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难 假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液
历年中国药典标准收载状况
2015年版正文
未查到具体品种规定是否有变化
黄曲霉毒素药典检测方法详解
液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42） 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。 混合对照品溶液的制备：液体标液
（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3 ug/ml）梯度稀释500 倍。 供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲 醇提取，免疫亲和柱纯化。 测定： 吸取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、 20μl、25μl，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供 试品溶液20-25μl，测定。
总结
黄曲霉毒素危害极大，应引起重视 检测前先多了解被检测物质和成分的性
质，了解检测方法的原理及实验中每一 步操作的目的，避免不必要的差错 检测过程中大家一定要注意安全措施的 防护，保护好自己、保护好环境
药材 5
黄曲霉毒素 食用坚果、玉米、调味品 10， AlfatoxinsB 食用干制水果及其制品 4.
1,B2,G1
,G2
药材 4
药材 10
药材 10
黄曲霉毒素的种类及性质
根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物
1 • B族：蓝色荧光
12
2
• G族：黄绿色荧光
ACCD PPT
薄层层析法：灵敏度低，定量困难 HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，
采用UPLC可以增强灵敏度 HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高
（目前药典采用此法）
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫化学分析方法
酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳性多 免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多 微柱筛选法 ：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法 ：快速、现场大批量
初筛
HPLC/MS/MS ：不衍生，灵敏度高，假阳性 少，成本高
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
色谱学方法
HPLC
LC-MS/MS
TLC
GC
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫学方法
ELISA
胶体金
历年中国药典标准收载状况
2005年增补本
附录：第一次增加了黄曲霉毒素 测定法
历年中国药典标准收载状况
HPLC-荧光检测器
光化学衍生器
免疫亲和柱的原理
IAC
①上样，载体上的抗 体结合样品中的待测
物①
②清洗，将杂 质冲洗干净
②
用大剂量的黄 曲霉毒素单克 隆抗体固化在 水不溶性的载 体上然后装柱 而成
③
抗待测物（半抗原）抗体
待测物（半抗原）
无关杂质
固相载体（凝胶）
③洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来 进入仪器检测
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
B1,B2,G1,G2, M1,M2
M1是B1在体内经过羟 化而衍生成的代谢产物
M1、M2主要存在于牛奶中
B1：最常见、毒性 及致癌性最强
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
理化性质
相对分子量 为312-346
难溶于水、易溶于油， 甲醇、丙酮和氯仿等有 机溶剂，但不溶于石油
原理：抗原、抗体反应， 注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水
其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器 洗涤
方法详解
黄曲霉毒素标液
supelco
黄曲霉毒素的衍生化
衍生原因 B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法
碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求， 试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗。
• 处方中含有易污染的药材以及生粉投料 的中成药品种应注意相关真菌毒素的检 测
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9302 中药有害残留物限量制定 指导原则
• 根据具体品种和具体污染状况，参考相关 品种国外药典和各国、各国际组织相关限 量标准等规定，尽可能控制在最低范围内
• B1 限量和 B1、 B2、 G1、 G2 总和的限量
中国（μg/kg）
黄曲霉毒素
Alfatoxin B1
食用花生 8， 食用坚果、玉米、调味品 5， 食用干制水果及其制品 2， 生乳、热处理牛奶，婴幼儿食
品 0.1， 婴幼儿奶粉 0.1， 婴幼儿食疗食品0.1.
药材 2
药材 5
玉米、花生及其制品 20， 大米、植物油 10，
其他粮食、豆类、发酵食品 5， 婴幼儿配方食品 5.
急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。 慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性
坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和 胰脏也有轻度的病变。
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自 制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热 带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比 较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生， 在农作物正常的生长期中也可以形成。
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
2351 黄曲霉毒素测定法
• 增加了第二法：高效液相色谱 - 串联质 谱法
• 附注：当测定结果超出限度时,采用第 二法进行确认
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9305 中药中真菌毒素测定指导原则
• 粮谷类、种子类、油性成分多的品种应 注意黄曲霉毒素的检测
被称为“火鸡X病”，主要症状为食欲减退，羽翼下垂，染病后 昏睡死亡，死时头脚向后伸。解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。 再后来鸭子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些可怜 的火鸡和鸭子吃的是花生饼。花生饼是花生榨油之后剩下的残渣， 富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。科学家们很快从花生饼中找到 了罪魁祸首，一种真菌产生的毒素。它被命名为“aflatoxin ”，就 是现在所说的黄曲霉毒素。
质联用，关闭衍生器
结果报告
未检出
低于检测限（标出检测限）
限度内
报告具体值
限度外
报告具体值
黄曲霉毒素检测安全防护措施
应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境 黄曲霉毒素标准品禁用固体 实验全程佩戴手套 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，
应泡在专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶 液内，浸泡24小时以上 ，再用清水将玻璃器 皿冲洗干净。 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常 规处理。
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
对照品溶液的配制 取样 ：混匀，严格按要求取样，要有代表性 提取 ：方式可比较后选择 滤过 :普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
净化和富集
采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗 体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成
四川省食品药品检验检测院 中药室
中药中黄曲霉毒素检测方法研究
1 真菌毒素简介 2 黄曲霉毒素的检测意义 3 黄曲霉毒素的种类及性质 4 现有检测方法介绍 5 中药黄曲霉毒素检测药典收载状况 6 药典检测方法详解 7 安全防护措施
真菌毒素简介
是真菌在适宜的环境条件下，在食品或 饲料里生长所产生的代谢产物，对人类 和动物都有害
黄曲霉毒素
显微镜下 的黄曲霉
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黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO） 的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种 毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒霉素，是目 前已知霉菌中毒性最强的。
黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
醚、己烷和乙醚中
中性溶液及弱酸性 溶液中较稳定，强 酸性溶液中稍有分 解，强碱溶液中分 解迅速
紫外线对低 浓度黄曲霉 毒素有一定 的破坏性
纯品为无色结晶.在紫 外光灯下，B1、B2发 蓝色荧光，G1、G2发 绿色荧光
耐高温，一般烹调 温度不能破坏，B1 的分解温度为 268℃
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
光化学衍生法：紫外光灯（254）nm照射，操 作简单，对衍生温度无要求，无需冲洗
黄曲霉毒素的衍生化
AFB1
衍生原理
紫外光灯照射
AFG1
紫外光灯照射
黄曲霉毒素的衍生化
增强B1、G1的荧光强度。
黄曲霉毒素的检测
荧光检测器，激发波长 = 360nm (或 365nm) ， 发射波长= 450nm
2010年版一部
正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、 胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残 留量检查
附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法
历年中国药典标准收载状况
2010年版一部第二增补本： 修订了附录方法
删除了流速规定 增订了另一种衍生方法：即光化
学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定
真菌毒素简介
毒素名称
毒素来源
毒性
黄曲霉毒素（常见 黄曲霉、寄生曲霉等 毒素）
黄绿青霉毒素
黄绿青霉
肝毒性 神经毒性
橘青霉毒素
橘青霉
肾毒性
黄天精和环氯素 岛青霉
肝毒性
T2毒素
拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀 心衰、出血 菌
黄曲霉毒素的起源
第一次发现黄曲霉毒素的起源事件： 1960年，英国发现有10万只火鸡死于一种以前没见过的病，
中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解
方法来源：《中国药典》2010年版第二 增补本附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法
基本步骤
提取 过柱 洗脱 测定
提取 上样
检测流程
样品前处理
过滤除杂
免疫亲和柱 纯化
洗涤
柱后衍生、 HPLC检测
稀释 洗脱
黄曲霉毒素检测主要设备
气孔操作架
免疫亲和柱
黄曲霉毒素检测主要设备
黄曲霉毒素的种类及性质
生长温度
最低6-8℃，最高达44-46℃，32℃时黄曲霉 毒素B1的产量最高。
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种： B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.
基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘 邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻 酮（香豆素）.前者为基本毒性结构，后者与致癌有 关.
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、 粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类 中药；贮存期中药材、中成药; 油性成分多的 中药材
黄曲霉毒素的检测意义
国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多
欧盟（μg/kg）
德国
中国香港
（μg/kg） （μg/kg）
灵敏度高，可用于痕量检测
检测方法详解
方法难点：
痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复
性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品
黄曲霉毒素在样品中分布不均匀 中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难 假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液
历年中国药典标准收载状况
2015年版正文
未查到具体品种规定是否有变化
黄曲霉毒素药典检测方法详解
液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42） 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。 混合对照品溶液的制备：液体标液
（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3 ug/ml）梯度稀释500 倍。 供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲 醇提取，免疫亲和柱纯化。 测定： 吸取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、 20μl、25μl，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供 试品溶液20-25μl，测定。
总结
黄曲霉毒素危害极大，应引起重视 检测前先多了解被检测物质和成分的性
质，了解检测方法的原理及实验中每一 步操作的目的，避免不必要的差错 检测过程中大家一定要注意安全措施的 防护，保护好自己、保护好环境
药材 5
黄曲霉毒素 食用坚果、玉米、调味品 10， AlfatoxinsB 食用干制水果及其制品 4.
1,B2,G1
,G2
药材 4
药材 10
药材 10
黄曲霉毒素的种类及性质
根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物
1 • B族：蓝色荧光
12
2
• G族：黄绿色荧光
ACCD PPT
薄层层析法：灵敏度低，定量困难 HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，
采用UPLC可以增强灵敏度 HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高
（目前药典采用此法）
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫化学分析方法
酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳性多 免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多 微柱筛选法 ：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法 ：快速、现场大批量
初筛
HPLC/MS/MS ：不衍生，灵敏度高，假阳性 少，成本高
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
色谱学方法
HPLC
LC-MS/MS
TLC
GC
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫学方法
ELISA
胶体金
历年中国药典标准收载状况
2005年增补本
附录：第一次增加了黄曲霉毒素 测定法
历年中国药典标准收载状况
HPLC-荧光检测器
光化学衍生器
免疫亲和柱的原理
IAC
①上样，载体上的抗 体结合样品中的待测
物①
②清洗，将杂 质冲洗干净
②
用大剂量的黄 曲霉毒素单克 隆抗体固化在 水不溶性的载 体上然后装柱 而成
③
抗待测物（半抗原）抗体
待测物（半抗原）
无关杂质
固相载体（凝胶）
③洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来 进入仪器检测
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
B1,B2,G1,G2, M1,M2
M1是B1在体内经过羟 化而衍生成的代谢产物
M1、M2主要存在于牛奶中
B1：最常见、毒性 及致癌性最强
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
理化性质
相对分子量 为312-346
难溶于水、易溶于油， 甲醇、丙酮和氯仿等有 机溶剂，但不溶于石油
原理：抗原、抗体反应， 注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水
其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器 洗涤
方法详解
黄曲霉毒素标液
supelco
黄曲霉毒素的衍生化
衍生原因 B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法
碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求， 试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗。
• 处方中含有易污染的药材以及生粉投料 的中成药品种应注意相关真菌毒素的检 测
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9302 中药有害残留物限量制定 指导原则
• 根据具体品种和具体污染状况，参考相关 品种国外药典和各国、各国际组织相关限 量标准等规定，尽可能控制在最低范围内
• B1 限量和 B1、 B2、 G1、 G2 总和的限量
中国（μg/kg）
黄曲霉毒素
Alfatoxin B1
食用花生 8， 食用坚果、玉米、调味品 5， 食用干制水果及其制品 2， 生乳、热处理牛奶，婴幼儿食
品 0.1， 婴幼儿奶粉 0.1， 婴幼儿食疗食品0.1.
药材 2
药材 5
玉米、花生及其制品 20， 大米、植物油 10，
其他粮食、豆类、发酵食品 5， 婴幼儿配方食品 5.
急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。 慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性
坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和 胰脏也有轻度的病变。
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自 制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热 带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比 较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生， 在农作物正常的生长期中也可以形成。
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
2351 黄曲霉毒素测定法
• 增加了第二法：高效液相色谱 - 串联质 谱法
• 附注：当测定结果超出限度时,采用第 二法进行确认
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9305 中药中真菌毒素测定指导原则
• 粮谷类、种子类、油性成分多的品种应 注意黄曲霉毒素的检测
被称为“火鸡X病”，主要症状为食欲减退，羽翼下垂，染病后 昏睡死亡，死时头脚向后伸。解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。 再后来鸭子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些可怜 的火鸡和鸭子吃的是花生饼。花生饼是花生榨油之后剩下的残渣， 富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。科学家们很快从花生饼中找到 了罪魁祸首，一种真菌产生的毒素。它被命名为“aflatoxin ”，就 是现在所说的黄曲霉毒素。
质联用，关闭衍生器
结果报告
未检出
低于检测限（标出检测限）
限度内
报告具体值
限度外
报告具体值
黄曲霉毒素检测安全防护措施
应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境 黄曲霉毒素标准品禁用固体 实验全程佩戴手套 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，
应泡在专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶 液内，浸泡24小时以上 ，再用清水将玻璃器 皿冲洗干净。 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常 规处理。
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
对照品溶液的配制 取样 ：混匀，严格按要求取样，要有代表性 提取 ：方式可比较后选择 滤过 :普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
净化和富集
采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗 体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成