基因工程-简界

研究目的决定
载体选择后，对基因克隆方法具有一定的 指导作用。
2. 选择、构建合适的载体
（1）载体的分类
根据宿主的对象
原核
真核
根据载体的性质
质粒 病毒
根据功能
克隆 表达
2. 选择、构建合适的载体
（2）质粒（plasmid）
独立于染色体外的能够进行自我复制的共价、 闭环、双链的DNA分子 严紧型质粒
主要内容
基因工程的发展史简介
基因工程的基本原理
基因工程的应用
基因工程发展简史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验
1822-1884
基因工程发展简史
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验
1877-1955
基因工程发展简史
1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶
15K左右
真核复制起始点
若真核载体？
原核表达载体---Pharmacia
Tac Promoter GST-融合蛋白 GST标签
原核表达载体---Promega
T7启动子控制
体外转录 SP6 T3
原核表达载体---Merck
T7启动子控制 TrxA标签 His标签
Smith HO, Wilcox KW.
A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol. 1970;51(2):379-91
Hamilton O. Smith 美國 霍普金斯大 學醫學院 1931年--
表达可控性 加入药物后不表达
载体构建
载体构建
一条mRNA分子双基因表达
IRES Internal Ribosome
Entrance
Site
载体构建
Clontech
pIRES2
3. 粘性质粒(cosmid)
可插入45kb
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
0.4
0.2
0.0 293
20
0 293 H2pG2
表达可控性 加入药物后、或停药后表达
载体构建
四环素控制系统 VP16 transaction domain of herpes simplex virus
Tet off :去除四环素后表达
Tet on :加入四环素后表达
表达可控性 加入药物后表达
4、目的基因与载体的连接
（1）采用连接酶的方法
DNA连接酶 T4DNA连接酶 Ecoli DNA连接酶 辅基NAD
Ecoli DNA连接酶 常用于双链DNA合成
4、目的基因与载体的连接
（2）利用重组酶的方法(噬菌体整合机制)
attB 25bp， attP 240bp
4、目的基因与载体的连接
（2）利用重组酶的方法(噬菌体整合机制)
载体构建
RU486系统
表达可控性 加入药物后表达
载体构建
RU486系统（1994）
加入后表达 元件组成：
Gal4DBD：酵母转录因子Gal4的 DNA结合区
VP16AD：单纯疱疹病毒蛋白 VP16激活区
PRLBD-891： PR-891突变体改 良后的C末端配体结合区
VP16AD,目前用NF-B的p65激活区代替 用来减少免疫原性
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
合成长度有限，120bpu 单链，需多次，需拼接
可以合成需多次突变产生 可以在密码子偏好性差的 细胞中表达的基因
4、目的基因与载体的连接
连接的方法 生成磷酸二酯键的酶 DNA连接酶 重组酶 拓扑异构酶
4、目的基因与载体的连接
连接的方法 （1）采用连接酶的方法 （2）利用重组酶的方法 （3）利用拓扑异构酶的方法
Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标
志着基因工程技术的诞生。
第 一 个 重 组 体 构 建
SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为 450Å的球形病毒，分子量为28×106 道 尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全 长5243个碱基对。SV40DNA上有一个
Boyer
Swanson
基因工程发展简史
1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂
insulin From Genetech
基因工程发展简史
1997年 英国罗林研究所
成功的克隆了多莉
基因工程的流程
1、确定研究的目标 2、选择、构建合适的载体 3、分离目的基因 4、目的基因和载体的重组 5、重组子转入宿主细胞 6、重组子的筛选 7、目的基因表达
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
2. 噬菌体(phage)
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）
M13mp系列
pUC系列
Phage display technology
真核载体
原核载体的条件
仍需其它条件 真核细胞复制起始点 polyA位点 真核的抗性
inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc.
pGL3-Control
SV40 promoter SV40 enhancer
160
180 160 140 120 100
140 120 100
EnIIPcore AAT ForAAT RevAAT CMV SV40
0.8
Relative Luciferase Activity(CMV%)
0.6
40
脂质体转染 磷酸钙共沉淀
方法
将目的基因导入 动物细胞
电击 显微注射法 纳米颗粒
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
5、重组子导入宿主细胞
导入微生物细胞 ——感受态细胞
宿主细菌的选择
A. 克隆载体，DH5，topo10,XL-1等 B. 表达载体，BL21（DE3）等，与载体相对启动子的RNA聚合酶的细菌
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244,
1973） 的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够 在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因 重组技术。
Boyer and Cohen
基因工程发展简史
1976年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司
Daniel Nathans 美國 霍普金斯大 學醫學院 1928年-1999年
Werner Arber 瑞士 Biozentrum 大學 1929年--
1978年诺贝尔奖
第一个重组体的构建
1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发
表了题为∶“Biochemical methode for
基因工程 （genetic engineering ）
将外源性遗传物质
通过载体
转入宿主细胞内，
经筛选，使其获得新的性状的过程。
基本原理（过程）
分：目的基因的获取 切：载体和目的基因的酶切 接：目的基因和载体的连接，重组子 转：重组子转入宿主细胞 筛：含有目的基因的重组子的宿主细胞的筛选 表达：目的基因在宿主细胞内的表达
200kb左右
细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)
F1质粒改建而来 可容纳50kb以上的DNA
动物病毒DNA改造的载体 腺病毒
动物病毒DNA改造的载体 腺病毒
顺时表达，不整合，可以感染非分裂细胞
动物病毒DNA改造的载体 慢病毒(HIV)----逆转录病毒(MMLV)
真 核 载 体---invitrogen
真 核 载 体---clontech
真 核 载 体---选择注意事项
启动子 SV40，CMV，等 Koza序列 -3，+4法则,GCCACCATGG 有无真核筛选标志 Neo(G418)、Hyr(潮霉素) EGFP、RFP、YFP
载体构建
启动子强度 CAG启动子
C：巨细胞病毒增强子， A：鸡-actin启动子， 鸡actin外显子1， 鸡-actin内含子1， G：兔globin内含子2， 兔globin外显子3
载体构建
组织表达特异性 特异性启动子
EnII Pcore
Luciferase
pGL3-EnII-Pcore pGL3-CMV pGL3-AAT pGL3-ForAAT pGL3-RevAAT
并获得成功。
第一个有功能重组体的构建
◆虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并
没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。
◆1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题 为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling,

提高产量 优质 抗病虫害 抗寒、旱、涝、盐碱 抗除草剂
控制成熟
抗除草剂
抗凝血酶
克隆猪，器官移植
克隆猴，研究疾病的 模型
远不仅如此
胚胎干细胞遇到伦 理其它问题时
从受精卵开始就是生命
iPS出现了
这个就 没有问 题了吗？
改造环境
拯救濒危动物
恐龙最好也能复活了！！
限制性内切酶EcoRⅠ的切点。
SV40 病毒
◆ 当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证
明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能 够重新环化，并且能够同另外的分子重组。
◆于是他们进行第二步的实验就是从λdvgal
DNA 中 制 备 含 有 E.coli 的 半 乳 糖 操 纵 子 DNA，用上述同样的方法进行重组连接，
慢病毒：可稳定整合，宿主范围广，可感染分裂细胞
逆转录病毒：可稳定整合，宿主范围有限，感染分裂细胞
植物载体
植物载体
具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间TDNA序列整合到植物基因 组；
②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区；
④. 复制原点；
⑤. 毒性区。
3、目的基因获取
获取目的基因的方法（1）从基因中获取（2）利用PCR技术扩增 PCR技术扩增
最常用的方法
若序列已经明确 利用模板、PCR扩增
引物5‘端进行修饰，加入 酶切位点，与载体对应
还可做其它修饰， 如加入attB位点
酶1切
酶2切
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因
His tag
His tag
enterokinase site TrxA Thrombin site
原核表达载体—选择注意事项
启动子 T7，LacZ, Tac等 标签（Tag）的选择 GST TrxA His Tag SD序列问题
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
4、目的基因与载体的连接
（3）利用拓扑异构酶的方法
4、目的基因与载体的连接
（3）利用拓扑异构酶的方法
T载体 PCR产物末端加A
5、重组子导入宿主细胞
受体细胞 转 —— 目的基因进入_________内，并且在 稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程
5、重组子导入宿主细胞
将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
复制时需DNA聚合酶II 10-200个copies以上
质粒的基本条件
分子量要小 复制起始点 多个克隆位点 筛选标志 容量要大
15K左右
质粒的基本条件
分子量要小 复制起始点 多个克隆位点 筛选标志 容量要大
1. 确定研究的目标
纯的蛋白质
真核表达
酵母、昆虫、动物细胞
功能研究
不需纯化蛋白 原核表达 大片段DNA克隆 克隆研究 150kb以上 原核 真核
是否要稳定表达
2. 选择、构建合适的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有 意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。