基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题

5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同

时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶

(PS:完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。)

6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶

异同点：

相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的

是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。(传说中的网上答案)

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感

5、尽可能缩小连接反应的体积

6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好

& 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？

1 )大肠杆菌DNA聚合酶

2) Klenow fragment

3) T7 DNA聚合酶

4) T4 DNA聚合酶

5 )修饰过的T7 DNA聚合酶

6 )逆转录酶

7)Taq DNA聚合酶

第四章基因克隆的载体系统

1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性) ；

具有合适的筛选标记；

具有较高的外源DNA的载装能力；

具有多克隆位点(MCS)；

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？

基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选

的标志基因、单一的限制酶切点等。

4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

A、化学法（CaCI2法）转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者

经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受

态细胞）。

B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池

中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA

重组分子便可进入细胞内。

影响转化率的主要影响因素：

1 ）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；

2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；

3）受体细胞的类型及预处理；

4）转化方法：电击法高于化学法。

5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。

从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：

（1）基于载体遗传标记检测法

在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转

化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组

子的初步筛选。

（2 ）基于克隆DNA序列检测法

Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结

合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的

DNA片段。

（3）基于外源基因产物检测法

如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是

显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。

第五章基因的克隆一般方法

1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，

建议必选DD RT-PCR和SSH,原因请看下题）？

1）差减杂交（SH）

通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因

分离克隆的。

2）抑制性差减杂交（SSH）

SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤

去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

3）差异显示PCR（DD RT-PCR ）

利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3'端设计象5'-T11GA 样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5'端的随机引物（20条10-mer ），可以使不同长度的基因得到扩增。

4）D NA代表性差异分析（DNA RDA ）

代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA , driver DNA ）与野生型（检测DNA , tester DNA ）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。

5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）

基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该

接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻

的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

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2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？

主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3'端设计象5'-T11GA

样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5'端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。

优点：

简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。

所需的mRNA量少。

各样本mRNA的差异可同时进行比较。

扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。

缺点：

假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。

工作量大。

无法定量研究。

扩出的条带往往是3'端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。

利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程

研究领域发挥了极大的作用。（P221）

3、抑制性差减杂交的原理与应用。

原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂

交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

应用：

基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；

基因时空表达的研究：如根、茎、叶；

不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。

4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。

A •酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA 特异结合域（DNA-binging domain,BD ）, 一个是转录激活域（tran scriptio nal activation domai n, AD）。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完

整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活

功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。B.噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白

一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合

噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。

5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。