成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)对骨形成的直接调控作用

Skeletal elements are formed through two distinct developmental processes: endochondral ossification, which also goes through two close related processes-chondrogenesis and osteogenesis, and intramembranous ossification, in which mesenchymal cells differentiate into osteoblasts directly.
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第三军医大学硕士学位论文
主要实验结果 一. FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠骨形成增加，体型变小 1. 成年期(2 月龄)FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠体型变小，体重减轻；新生小鼠长骨 生长板软骨发育无异常。 2. 成年期 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠骨量增多，骨形成增加 X 线摄片显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠股骨放射密度增高；Micro-CT 扫描显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠 BV/TV，骨小梁数量( Tb.N)及骨小梁厚度( Tb.Th)均显著升 高；H&E 染色 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠干骺端和骨骺部位骨小梁较野生小鼠明显增 多、增长、增粗。提示成年期 FGFR3K644E,Oc-cre 骨量增多，骨形成增加。 3. FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠成骨细胞分化增强，矿化障碍 1) 2 月龄 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠胫骨骨组织中成骨细胞分化标志基因 Cbfa1、 OP 和 Col1a1 表达上调，表明成骨细胞分化增强；钙绿素双标实验提示 FGFR3 K644E,Oc-cre 小鼠矿化能力减弱；体内血清钙磷含量正常，提示骨骼矿化障碍没有影 响全身钙磷水平。 2) FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠颅骨成骨细胞增殖减慢；经成骨诱导培养后碱性磷酸 酶表达增加，钙结节形成减少；成骨细胞分化标志基因 Cbfa1、OP、OC、Col1a1 表达 均显著上调，表明成骨细胞分化增强，矿化降低。 3) FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠成骨相关基因 FGFR1、FGFR2 及 BMPRIA 表达下调。 4.FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠破骨细胞骨吸收作用没有改变 TRAP 染色后计数结果显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠胫骨单位骨小梁面积上的破 骨细胞数量与野生小鼠无明显差别，提示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠破骨细胞数量及功 能无明显改变。 二. FGFR3G369C/+小鼠胫骨骨皮质损伤愈合延迟 1. FGFR3G369C/+小鼠骨皮质损伤后局部新生骨组织增多 Micro-CT 扫描重建分析及 H&E 染色显示 FGFR3G369C/+小鼠损伤局部新生骨组织 数量和体积较野生小鼠增加；新生骨组织成骨细胞分化标记基因 Cbfa1、OP 等表达显 著上调，提示成骨细胞分化增强。 2. FGFR3G369C/+小鼠皮质骨愈合延迟 MicroCT 扫描重建分析及 H&E 染色显示在损伤后第 21 天，野生型小鼠和 FGFR3G369C/+小鼠在皮质缺损处都出现了新生板层骨，但 FGFR3G369C/+小鼠的新生骨皮 质厚度要小于野生小鼠。
既往研究表明，FGF/FGFRs 信号通路与骨骼发育、再生和骨骼疾病有密切联系。 FGFR1、2、3 功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis, CS)、软骨发 育不全(achondroplasia, ACH)和 CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss)综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。
FGFR3 和 FGFR1、2 高度同源，也受可调节骨形成的内源性配体 FGF2、18 等激 活，提示 FGFR3 可能参与调控骨形成过程。而人类 FGFR3 A391E 功能增强型点突变 可引起 Crouzon 等囟门早闭征，则是 FGFR3 影响骨形成的直接证据。模拟人 ACH 的 FGFR3 突变小鼠出生后 15 天长骨骨小梁处成骨细胞分化标志基因 Cbfa1 等表达水平 增高，成年期骨量减少；FGFR3 敲除小鼠骨量减少，骨小梁矿化障碍。这些结果均提 示 FGFR3 可影响成骨细胞功能和骨形成过程。
目前已有多名学者报道利用条件性基因敲除小鼠研究 FGFR1、2 对成骨细胞的直 接调控作用，但Leabharlann Baidu于 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直接调控作用及机制还不完全清
* 本课题受国家重点基础研究发展规划 (973 计划)项目子课题 (2005CB522604)、国家自然科学基金杰出青年基金 (30425023)、国家自然科学基金重点项目(30530410)、国家自然科学基金青年科学基金项目(30301527)资助。
FGF/FGFRs signal pathway plays an important role in skeleton development and bone regeneration. Gain-of-function mutations or lose-of-function mutations of FGFR1,2,3 can cause a variety of human skeleton genetic disease, including craniosynostosis(CS), achondroplasia (ACH), CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss) syndrome, and so on.
第三军医大学 硕士学位论文 成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)对骨形成的直接调控作用 姓名：周锐 申请学位级别：硕士 专业：遗传学 指导教师：陈林
2011-05
第三军医大学硕士学位论文
成纤维细胞生长因子受体 3(FGFR3)对骨形成的 直接调控作用*
摘要
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)属于受体酪氨 酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族。目前已发现 4 种 FGFRs，即 FGFR1、 FGFR2、FGFR3、FGFR4。它们之间在氨基酸水平有 55%~72%的一致性。
据 此 ， 本 课 题 用 成 骨 细 胞 特 异 性 表 达 FGFR3 功 能 增 强 点 突 变 (FGFR3 K644E,Oc-cre)小鼠和模拟人软骨发育不全的 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3G369C/+)小 鼠两种基因敲入小鼠模型为研究对象，探讨生理和病理(骨损伤)情况下，FGFR3 对成 骨细胞及骨形成的直接调控作用。
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第三军医大学硕士学位论文
The role of FGFR3 in bone formation*
Abstract
Fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are members of the receptor tyrosine kinase (RTK) family. There are now four known FGF receptors, FGFR-1 through FGFR-4, which share 55–72% overall amino acid identity.
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第三军医大学硕士学位论文
楚。 骨损伤后的再生修复是局部骨骼的再发育过程。一些参与调控骨骼发育的分子如
IHH/PTHrP、BMPs、Wnt 等在骨再生过程中也起着重要调控作用。研究发现，FGFR3 参与调节骨损伤后的再生过程，且在一定程度上，FGFR3 对骨再生和骨生长发育中的 软骨内成骨过程可能发挥相似的负性调控作用。而 Rundle 等发现 FGFR3 表达于骨折 部位成骨细胞和骨膜下间充质细胞，提示 FGFR3 直接参与调控骨再生过程中的成骨细 胞骨形成过程。那么 FGFR3 在骨再生过程中对成骨细胞骨形成的影响是否与 FGFR3 在成年期骨重建中的作用类似呢？
主要研究内容 第一部分:成骨细胞特异性表达含功能增强点突变 FGFR3 对成年期小鼠骨形成的 影响 1. 对成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3K644E,Oc-cre)小鼠身 长，尾长，体重等形态学指标进行大体观察。 2. 利用藏红固绿染色观察新生小鼠胫骨生长板软骨发育情况。 3. 利用 X 线摄片和 Micro-CT 观察成年小鼠股骨骨密度及骨组织结构的变化。 4. 通过 H&E 染色、钙绿素双标实验观察小鼠胫骨骨小梁的结构及矿化情况；测 定血清钙磷含量，了解体内钙磷水平是否受骨骼代谢异常影响；定量 PCR 检测成骨细 胞分化标志基因 Cbfa1、OC、OP、Col1a1 等的表达变化。 5. 小鼠颅骨成骨细胞分离培养，测定生长曲线并进行成骨诱导。通过碱性磷酸酶 染色、茜素红染色观察，结合检测成骨相关基因 Cbfa1、OC、OP、Col1a1 以及 FGFR1、 FGFR2 和 BMPRIA 的表达，观察成骨细胞分化和矿化情况。 6. 通过 TRAP 染色观察胫骨破骨细胞形成及活性。 第二部分：FGFR3 功能增强对小鼠胫骨骨皮质损伤修复过程的影响 1. 建立 FGFR3 功能增强小鼠(FGFR3G369C/+)胫骨皮质缺损模型。 2. 利用 H&E 染色和 Micro-CT 重建分析观察骨再生情况。 3. 定量 PCR 检测新生骨组织中成骨细胞分化相关基因 Cbfa1、OC、OP、Col1a1 等 mRNA 水平表达变化。
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第三军医大学硕士学位论文
主要结论 1. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠体型变小，但生长板软骨未 见明显异常，提示成骨异常在 ACH 侏儒体型发生中有一定作用。 2. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠成年期骨形成增加，导致骨 量增多。 3. FGFR3 功能增强促进成骨细胞分化，抑制其矿化。 4. FGFR3 功能增强对成骨细胞的影响可能部分是通过 FGFR1、FGFR2 及 BMPRIA 的继发性改变所致。 5. FGFR3 功能增强导致小鼠骨皮质缺损愈合延迟。 关键词：FGFR3；骨形成；成骨细胞；破骨细胞；骨再生
不同的 FGFRs 在软骨形成和骨形成过程中的作用不一致。总的讲，目前认为 FGFR1、2 主要调节膜内成骨过程，而 FGFR3 则主要参与调控软骨内成骨。已发现人 类 FGFR1(P252R)功能增强点突变和多种 FGFR2 功能增强点突变可影响颅缝膜内成骨 过程，导致颅缝提前闭合，引起囟门早闭综合征；而 FGFR3 功能增强点突变通过抑制 生长板软骨发育，导致软骨发育不全等软骨发育障碍性疾病。
骨骼的发育是通过软骨内成骨(endochondral ossification)和膜内成骨(intramembranous ossification)两种方式来完成的。软骨内成骨又经过软骨形成(chondrogenesis)和骨形成 (osteogensis)两个密切相关的过程。而膜内成骨则是一个单独的骨形成的过程，即间充 质密集后直接分化为成骨细胞并成骨。
Different FGFRs play distinct role in endochondral ossification and intramembranous ossification. A series of mutations in FGFR2 and a single missense mutation in FGFR1(P252R) can accelerate suture closure, leads to craniosynostosis syndromes; Gain-of-function mutations in FGFR3 can inhibit epiphyseal growth plate development, result in chondrodysplasia syndromes. It is therefore likely that intramembranous bone formation is controlled primarily by FGFR1 and FGFR2, while endochondral ossification is controlled primarily by FGFR3.