凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量
面粉中淀粉、蛋白质含量的测定
⾯粉中淀粉、蛋⽩质含量的测定实验⽬的：⼀、实验⽬的1、利⽤酸⽔解法测定出⾷品中淀粉含量；2、利⽤凯⽒定氮法测定⾷品中蛋⽩质的含量。
实验原理：⼆、实验原理1、淀粉的测定原理：利⽤酸⽔解法测定⾷品中的淀粉，⾸先将⽶粉去脂肪及可溶性糖，接着加盐酸对⽶粉进⾏酸⽔解，利⽤滴定的⽅法检测⽔解后样品中还原糖，将还原糖换算成淀粉的含量。
2、蛋⽩质测定的原理：⾷品中的蛋⽩质在催化加热条件下被分解，产⽣的氨与硫酸结合⽣成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，⽤硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋⽩质的含量。
实验仪器及试剂：三、实验仪器及试剂1、仪器：天平、定氮蒸馏装置、烧杯、500mL与100mL容量瓶、滤纸、烧瓶、⽔浴锅、锥形瓶、玻璃珠、滴定管。
2、试剂：硫酸铜、硫酸钾、硫酸（1.84 g/L）、甲基红⼄醇溶液（1 g/L）、硼酸溶液（20 g/L）、混合指⽰液(2份甲基红⼄醇溶液(1g/L)+1份亚甲基蓝⼄醇溶液(1 g/L))、氢氧化钠溶液（400 g/L）、硫酸或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）、⼄醚、85%⼄醇、6mol/LHCl、40%NaOH、20%⼄酸铅、10%的NaSO4、碱性酒⽯酸铜液（甲、⼄液）。
实验步骤：四、实验步骤1、淀粉的测定实验步骤：（1）样品的处理：称取2.0~5.0克的⾯粉样品，将样品置于带有滤纸的漏⽃加⼊30ml⼄醚以除去⾯粉中脂肪，再⽤150ml的85%⼄醇分3次洗涤残渣以除去可溶性糖，滤⼲，接着⽤100ml⽔洗涤残渣后将残渣移⾄烧瓶，加⼊30ml的6mol/L的HCl⾄烧瓶中，⽤沸⽔浴冷凝回流40min，接着⽤流⽔冷却后⽤碘液鉴定是否充分⽔解，直⾄⽔解充分，冷却后加⼊甲基红及40%的NaOH调⾄黄⾊，⽤6mol/L的HCl校正⾄刚好变红，加⼊20ml20%的⼄酸铅，摇匀放置10min，接着加⼊20ml10%的NaSO4摇匀，将滤液及残渣移⼊500ml容量瓶定容，接着过滤同时弃去最初的20ml滤液，取滤液20ml加⼊到100ml的容量瓶中定容，则样液制备完成备⽤；（2）标定碱性酒⽯酸铜液：吸取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加⽔20ml，玻璃珠2颗，滴加9ml葡萄糖标准液，控制在2min内加热⾄沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准液，直⾄溶液刚好褪⾊（平⾏三次取平均值）计算10ml（甲、⼄液各5ml）碱性酒⽯酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）A1；（3）样品液预测：取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，加20ml的⽔以及两粒玻璃珠⾄250ml的锥形瓶中，加热⾄沸腾，⽤样品液趁沸先快后慢滴定⾄褪⾊；（4）样品溶液的测定：取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，加20ml的⽔以及⽐预测体积少1ml的样品溶液，另加⼊两粒玻璃珠，加热⾄沸腾，⽤样品液趁沸继续以1d/s的速度滴⾄褪⾊（平⾏三次，取平均值V1）。
凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤
一、引言定氮法是一种常用的测定粗蛋白质含量的方法，而凯氏定氮法则是其中的一种常用方法。
在食品、饲料、肥料等领域，粗蛋白质的含量是一个重要的指标，对其进行准确的测定具有重要的意义。
本文将重点介绍凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤。
二、凯氏定氮法的基本原理凯氏定氮法是利用样品中的蛋白质中所含的氮原子来进行测定，其基本原理是将样品中的蛋白质分解成氨基酸，然后将氨基酸中的氮测定出来，从而计算出样品中蛋白质的含量。
具体步骤包括将样品中的蛋白质分解成氨基酸、使氨基酸中的氮转化为氨，然后将氨转化为氮气，最终用氮气进行测定，从而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的主要测定步骤1. 样品的预处理样品在进行测定之前，需要进行预处理，包括粉碎、称取等操作，以保证样品的代表性和准确性。
2. 样品的消解将样品中的蛋白质分解成氨基酸，通常采用氢氧化钠、硫酸等消解剂，将样品中的有机氮转化为氨基酸中的氮。
3. 氮的转化将氨基酸中的氮转化为氨，通常采用氢氧化钠、碳酸盐等转化剂来实现。
4. 氨的转化将氨转化为氮气，通常采用硼酸、氢氧化钠等转化剂来实现。
5. 氮的测定用高纯氮气进行氮的测定，通常采用凯氏装置来收集和测定氮气中的氮含量。
6. 计算粗蛋白质含量根据测定得到的氮含量，结合样品的系数，计算出样品中粗蛋白质的含量。
四、凯氏定氮法的优缺点1. 优点凯氏定氮法具有操作简便、结果准确、适用范围广等优点，特别适用于大批量样品的快速测定。
2. 缺点凯氏定氮法在样品需消解的时间较长、对转化剂和试剂的要求较高等方面存在一些缺点，同时测定过程中易受外界环境的影响。
五、结语凯氏定氮法作为一种常用的测定粗蛋白质含量的方法，在食品、饲料、肥料等领域具有重要的意义。
通过本文的介绍，相信大家对凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤有了更加全面的了解。
认真掌握凯氏定氮法的操作技巧，能够准确快速地测定出样品中粗蛋白质的含量，为相关行业的质量监控和产品研发提供有力支持。
凯式定氮法
凯式定氮法检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。
一、原理将样品与浓硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出, 样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，加碱将消化液碱化，通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，使硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
消化反应为：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入催化剂，如硫酸钾、硫酸铜。
1、硫酸钾。
加入硫酸钾的目的是为了提高溶液的沸点。
加快有机物的分解。
硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可以提高反应温度，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸氢钾的浓度不断升高。
但加入的硫酸钾的量不能太大，否则消化体系温度过高，会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失。
2、硫酸铜。
硫酸铜的作用机理如下：Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2+CO2此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜（Cu2SO4褐色）生成，溶液呈现清澈的Cu2+的蓝绿色。
故硫酸铜除了起催化剂作用外，还可指示消化终点，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
蒸馏：在消化完全的样品消化液中加入浓氢氧化钠使其呈碱性，此时氨游离出来，加热蒸馏即可释放出氨气，反应如下：(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO4吸收与滴定：蒸馏所释放出来的氨，用硼酸溶液进行吸收，硼酸呈微弱酸性，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，吸收及滴定反应为：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3二、仪器和试剂凯氏烧瓶、定氮蒸馏装置浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠溶液、盐酸标准溶液、硼酸吸收液、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。
生化实验05凯氏定氮法
可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果， 当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。
1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，
加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管 口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低 ，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体 达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。
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二、材料、仪器设备及试剂
材料：苞菜或其他果蔬
仪器设备：蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定
管、漏斗、移液管等
试剂：
1. 2%草酸；
2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）；
3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制）
2,6-二氯酚靛
酚溶液（蓝
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（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL）
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四、数据记录
W= g（根据样品管编号在讲台上查表获得）； VT= mL; Vs= mL; A= mL；B= 0.2 mL
五、结果计算
样品总氮含量（%）= C ( A B) 14 VT 100 W VS 1000
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三、实验步骤
3. 染料标定 取10 mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶
蛋白质制备及含量测定（凯氏定氮法）分析
蛋⽩质制备及含量测定（凯⽒定氮法）分析实验六蛋⽩质制备及含量测定——微量凯⽒（Mirco-Kjeldahl）定氮法⼀、实验⽬的要求1、了解蛋⽩质提取的⼀般⽅法和原理2、了解蛋⽩质含量测定的常⽤⽅法3、学习微量凯⽒定氮法的原理4、掌握微量凯⽒定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋⽩质含量的换算等。
⼆、实验原理1、蛋⽩质的提取与制备蛋⽩质的提取与制备⽅法与⽣物材料的类型及蛋⽩质的存在部位有关。
如果是胞内蛋⽩，⾸先必须要进⾏细胞破碎。
细胞破碎的⽅法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋⽩，可以根据相应蛋⽩质的性质进⾏提取分离纯化。
如果待提取的蛋⽩质是具有⽣物活性的蛋⽩质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防⽌蛋⽩质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋⽩质含量测定蛋⽩质含量测定的⽅法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染⾊法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯⽒定氮法等。
3、凯⽒定氮⽣物材料的含氮量测定在⽣物化学研究中具有⼀定的意义，如蛋⽩质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋⽩含量。
⽣物材料总氮量的测定，通常采⽤微量凯⽒定氮法。
凯⽒定氮法由于具有测定准确度⾼，可测定各种不同形态样品等两⼤优点，因⽽被公认为是测定⾷品、饲料、种⼦、⽣物制品、药品中蛋⽩质含量的标准分析⽅法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为⽆机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提⾼硫酸沸点。
这⼀步约需2～3h，视样品的性质⽽定。
天然的含氮有机物（如蛋⽩质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢⼆元素被氧化成⼆氧化碳和⽔；蛋⽩质分解，⽽有机氮则变成氨（⽆机氮），并进⼀步与硫酸作⽤⽣成硫酸铵。
此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进⾏得⽐较缓慢，通常需要加⼊硫酸钾或硫酸钠以提⾼反应的沸点，并加⼊硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进⾏。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
结语
食品行业的飞速发展与人们对食 品安全的愈加重视都给食品质量检测 提出更高的要求，作为质量检测的从 业者，需对食品进行更加严格和准确 的检测。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
□ 石红伟 大连普兰店市产品质量监督检验所
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食品安全导刊
2016年11月
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.33.091 越来越多的人开始关注自身健康 与食品安全问题，精确地测定食品中 蛋白质含量对食品质量检测、食品安 全 都 极 为 重 要。 新 的 国 家 标 准《 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定》（ＧＢ／Ｔ ５００９．５－ ２０１０）给出凯氏定氮法、分光光度法 和燃烧法 ３ 种可用于食品中蛋白质的 检验方法。其中凯氏定氮法在现阶段 检测中的使用最为广泛，其具有适用 范围广，检测试验重现性好，准确度 和灵敏度高， 被测样品用量少等优点， 因此本文主要具体介绍凯氏定氮法的 步骤和原理并分析其误差。
T
echnology
科技
分析与检测
的蒸发效率和吸收程度都直接决定检 测结果的准确度。 滴定 滴定主要目的定量测量蒸馏得到 的溶液中的铵根离子。其基本原理是 利用弱碱性的硼酸铵与强酸反应生成 铵盐和硼酸。一般采用已知浓度的稀 盐酸或稀硫酸对溶液进行滴定试验， 根据消耗的 ＨＣｌ 或 Ｈ２ＳＯ４ 的量计算出蒸 馏后溶液中氨的含量，折算成样品中 氮元素的含量，从而根据蛋白质中氮 元素的比例，通过计算得到被测样品 中蛋白质的含量。 F＝６．２５。 多次测量取平均值减小偶然误差 整个测量中涉及大量试剂的配制 使用，操作与读数，各种环境因素的 干扰等，这些都会使测量中产生偶然 误差，因此在蛋白质含量的测量中， 最终测量结果需要进行多次重复性试 验，并将得到的结果取算数平均值表 示， 以 此 减 小 测 量 的 偶 然 误 差， 并 且 如 果 待 测 样 品 蛋 白 质 的 含 量 即： Ｘ ≥ １ ｇ／１００ ｇ，其结果需要保留三位 有效数字；如果待测样品蛋白质的含 量即：Ｘ ＜ １ ｇ／１００ ｇ，其结果只需要 保留两位有效数字即可。 其他含氮物质的干扰 通过凯氏定氮法的基本原理与操 作步骤可发现，使用该方法检测时， 第一步消化的本质是将样品中的氮元 素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮 法测量的是被测样品中有机物中含有 氮元素的总量，因此该办法并无法消 除样品中其他有机物中含有的氮元素 对测量结果的影响，如尿素、三聚氰 胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检 测方法便为凯氏定氮法，最终未能检 测出原料中的三聚氰胺而导致食品安 全事件。除去样品中非蛋白质部分有 （１） 机物中氮元素对整个测量的影响，要 先去除非蛋白质中的氮元素再进行具 体测量，或用其他方法测出非蛋白质 中的氮含量，再用总氮含量减去该值 再进行折算。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法在化学分析中的应用摘要：蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质。
蛋白质又是食品的重要组成之一，也是食品中的营养素指标。
它是复杂的含氮有机化合物，其溶液是典型的胶体分散体系，有两性氨基酸以肽键相互连接而成。
蛋白质可以用酶、酸或碱水解，最终水解产物为氨基酸，其中赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸在人体内不能合成，称为必须氨基酸【1】。
他们对人体起很重要的生理功能作用。
在国家标准中，对蛋白质的测定一般采用凯氏定氮法。
下面对蛋白质、凯氏定氮法以及粮油中粗蛋白的测定进行说明。
关键词：凯氏定氮法、粗蛋白、粮油、测试蛋白质：蛋白质为人体补充蛋白质，是人体不可缺少的重要营养素，是唯一可帮助身体形成新组织的营养素，可制造肌肉、血液、皮肤和各种身体器官，蛋白质约占人体体重的20%。
最主要具有以下多种功效：1.提供多种氨基酸，帮助身体制造新的组织以替代老化组织抗衰老。
2.通过增加血红蛋白和胶原蛋白改善皮肤弹性和透明度红润度。
3.调节血液血红蛋白向细胞输送氧和各种营养素，促进机体生长。
4.调节体内水分的平衡。
5.为免疫系统制造对抗细菌和感染的免疫球蛋白和荷尔蒙。
6.在体内制造各种蛋白酶，有助将食物转化为能量，恢复疲劳。
7.均衡提高人体所需的八种必需氨基酸。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。
故各种不同的蛋白质含氮量也不同。
一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质。
此数值（6.25）称为蛋白质换算系数【2】。
不同种类的粮食油料其蛋白质换算系数也有所不同，如小麦为5.70，谷物及豆类为6.25。
在国家标准中粮食油料中粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法。
该法是1883年由丹麦化学家凯道尔（Johan、kjedahl）【3】创立的。
该方法适于以测定任何形态（固体、液体）的样品。
而且具有很高的准确度和精密度。
因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。
凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析
实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。
2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。
二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H 形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。
然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。
吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2↑+12SO2↑ + 16H2O(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3三、样品：面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。
1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体)2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。
二组配500ml3. 40%NaOH溶液准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。
为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。
注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80℃后，方可加入30%浓度的双氧水。
凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量
凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量食品种类很多,食品中pro的性质和含量各不相同,而且其他成分,如碳水化合物,脂肪和维生素的干扰成分很多,因此pro的测定通常利用经典的凯氏定氮法将样品消化成铵盐蒸馏,用标准酸液吸收,用标准酸或碱液滴定,由样品中含氮量计算出pro的含量。
由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。
我们在检验食品中pro时,往往只限于测定总氮量,然后乘以pro核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro。
1凯氏常量定氮法不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的,首先第一个步骤是消化:样品与硫酸一起加热消化,硫酸使有机物脱水。
并破坏有机物,使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出,而pro则分解氮,则与硫酸结合成硫酸铵,留在酸性溶液中。
在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解,它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提高反应温度,一般纯硫酸加热沸点330?,而添加硫酸钾后,温度可达400?,加速了整个反应过程。
此外,也可以加入硫酸钠,氢化钾盐类来提高沸点。
其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解,水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大,沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失。
为了加速反应过程,还加入硫酸铜,氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢,次氯酸钾作为氧化剂。
但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后,出现硫酸铜的兰绿色,它具有催化功能,还可以作为碱性反应指示剂。
使用仪器推荐:消化炉或者全自动定氮仪。
1.1蒸馏样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨,在这操作中,一是加入氢氧化钠溶液要过量,二是要防止样液中氨气逸出。
吸收与滴定:蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收,然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液,从而计算出总氮量。
蛋白质的测定—凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验原理
• 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为 二氧化碳和水逸出样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量 可计算出蛋白质的含量。
仪器
500ml凯 氏烧瓶
定氮蒸馏 装置
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，如高于40°C可置于冷 水浴中。
（10）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色， 在酸性溶液中呈红色。
课后思考
• 凯氏定氮法测定 食品中蛋白质还 有哪些需要注意？
常量蒸馏按下式计算: 微量蒸馏按下式计算：
W c(V2 V1 ) 0.014 F 100 m
W c(V2 V1 ) 0.0 1 4 F 1 0 0 m 10 100
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验步骤——计算 • 式中W—蛋白质的质量分数，%； • c—盐酸标准液的浓度，mol/L； • V1—空白滴定消耗标准液量，mL； • V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； • m—样品质量，g； • 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； • F—蛋白质系数。
• 凯氏定氮步骤包括消化、蒸馏、 吸收、滴定、计算。
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量为粗蛋白
（2）所有试剂应用无氨蒸馏水配制
（3）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，促进消化完全 （4）若样品含脂肪或糖较多时，易产生大量泡沫可采用小火或者可加入 少量辛醇、液体石蜡或硅油等消泡剂 （5）控制消化时间 ，一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含 有特别难以氨化的氮化合物的样品，消化时间需适当延长；
粗蛋白含量测定（凯氏定氮法）
粗蛋白含量测定（凯氏定氮法）粗蛋白含量测定（凯式定氮法）1 原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
硫酸铜硫酸钾硫酸4或2%硼酸溶液混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合，也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合40%氢氧化钠溶液0.05N盐酸标准溶液3操作方法样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的100ml 或500ml定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，3g硫酸钾及10ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，5至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。
取下放冷，小心加20ml 水。
放冷后，移入100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。
将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。
夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
凯氏定氮法测定食品中蛋白质
滴定前
滴定终点
2021同/3/10时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。21
实验注意事项—消化
（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化
时间约4小时 （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂 （4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-
3ml
2021/3/10
2021/3/10
样品+0.4g硫酸 铜+6g硫酸钾 消+化20终m点l浓硫酸+
玻珠数粒
45度角
18
（2）蒸馏
将消化液全部转移 到100ml容量瓶中
通入蒸汽开始蒸馏
取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH, 提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室， 立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水使之密封。
（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、 10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；
（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用
碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，最振终摇测、定静溶止1h； 液中不能有沉
（4）取上清液在2000r/min离心5淀min、560nm测定吸
光度，绘制标准曲线。
6
蛋白质测定方法
方法 凯氏定氮法 双缩脲法
Folin－酚试 剂法
紫外吸收法 考马斯亮蓝法
2021/3/10
时间
应用范围
优缺点
8-10h
0.2-1.0mg氮 时间长
20-30min 1-10mg氮
灵敏度低、快 速检测
40-60min <5mg氮
凯氏定氮法测定蛋白质的含量
凯氏定氮法测定蛋白质的含量一、原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。
硫酸铵与强碱反应，放出氨。
将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。
根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
二、试剂与材料：浓硫酸、硫酸钾－硫酸铜粉末（称取80g硫酸钾和20g硫酸铜（五水），0.3g二氧化硒研细混合）、30％氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂（田氏指示剂）储存液（取50ml0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。
此指示剂在PH5.2为紫色；PH为5.4为暗灰色或灰色；PH5.6为绿色；变色点为PH5.4）、硼酸－田氏指示剂混合液（100ml2％硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色）、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉浓硫酸500ml硫酸钾200g硫酸铜200g硼酸50g盐酸200ml甲基红0.5g溴甲酚绿0.5g三、操作方法1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。
液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2－1.0mg范围内。
2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。
加入300mg硫酸钾－硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。
用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。
先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。
时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。
另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。
3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤（先用水蒸气洗涤）干净。
将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，由凯氏于1883
年提出。
它的原理是：将样品中的蛋白质氨基酸氧化分解为氨态水，
测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量。
2 凯氏定氮法的基本原理
凯氏定氮法的基本原理是将蛋白质氨基酸浓度通过离子交换树脂
提取，然后将氨基酸氧化分解为氨态水，再测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量，凯氏定氮法公式如下：
3 凯氏定氮法公式
蛋白质的实际含量=样品内的氨态氮的总量（毫克）÷6.25
其中6.25是认为蛋白质中的结构基元氨基酸的比例为1:6.25，也就是说，100毫克蛋白质中含有16毫克氨基酸，以此类推。
4 凯氏定氮法的优势
凯氏定氮法具有准确、快速、重现性好等特点，在实时测定立即
分析模式中，仍是最常用的技术。
从实验时间上看，凯氏定氮法比其
他定氮方式更加快捷，且准确率较高，受其实验程序简单、复杂材料
分离容易使用的优势受到广大研究人员的青睐。
5 凯氏定氮法的应用
凯氏定氮法大多用于测定含氨基酸的蛋白质，应用范围很广，一般应用在动物、植物的分子的氨基酸的分析，主要用于衡量蛋白质含量，便于计算组分，如果其他物质也能被氧化，也可以用它进行测定计算。
另外，凯氏定氮法也可以用于研究病毒、细菌等非蛋白质有机物的含氮量。
蛋白质含量测定凯氏定氮法
食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理;2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等;二、实验原理蛋白质是含氮的化合物;食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量;因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白;三、仪器与试剂硫酸铜CuSO4·5H20 硫酸钾硫酸密度为L 硼酸溶液20g/L氢氧化钠溶液400g/L L盐酸标准滴定溶液;混合指示试剂：%甲基红乙溶液液1份,与%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合;微量定氮蒸馏装置：如图3-所示;图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器2L平底烧瓶；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞样品入口处；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶;四、实验步骤1、样品消化称取样品约±,移入干燥的100mL凯氏烧瓶中,加入硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,加入20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,使用万用电炉,在通风橱中加热消化,开始时用低温加热,待内容物全部炭化,泡沫停止后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,继续加热,取下放冷,小心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液;试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸,按以上同样方法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液;2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好;在蒸气发生瓶内装水约三分之二,加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠或沸石以防止暴沸;测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量约占反应管三分之一体积通入蒸汽煮沸,产生的蒸汽冲洗冷凝管,数分钟后关闭夹子a,使反应管中的废液倒吸流到反应室外层,打开夹子b 由橡皮管排出,如此数次,即可使用;3、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL 于三角瓶中,加入混合指示剂2~3滴,并使冷凝管的下端插入硼酸液面下,在螺旋夹a 关闭,螺旋夹b 开启的状态下,准确吸取样品消化液,由小漏斗流入反应室,并以10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室,棒状玻塞塞紧;使10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,用少量水冲洗立即将玻塞盖坚,并加水于小玻杯以防漏气,开启螺旋夹a,关闭螺旋夹b,开始蒸馏;通入蒸汽蒸腾10min 后,移动接收瓶,液面离开凝管下端,再蒸馏2min;然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下三角瓶,准备滴定;同时吸取试剂空白消化液按上法蒸馏操作;4、样品滴定以L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点;5、数据记录五、结果计算 100101000140.0)(21⨯⨯⨯⨯⨯-=F m c V V X 式中 X ——样品蛋白质含量g/100g ；V 1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积mL ； V 2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积mL ；c ——盐酸标准滴定溶液浓度mol/L ；——盐酸]/000.1)([L mol HCl c =标准滴定溶液相当的氮的质量g ；m——样品的质量g；F——氮换算为蛋白质的系数,一般食物为；乳制品为；面粉为；高梁为；花生为；米为；大豆及其制品为；肉与肉制品为；大麦、小米、燕麦、裸麦为；芝麻、向日葵;计算结果保留三位有效数字;六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测;半固体试样一般取样范围为~；液体样品取样~约相当氮30mg~40mg;若检测液体样品,结果以g/100mL表示;2、消化时,若样品含糖高或含脂及较多时,注意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损失;可加入少量辛醇或液体石蜡,或硅消泡剂减少泡沫产生;3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品彻底消化;若样品不易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,加入数滴过氧化氢后,再继续加热消化至完全;4、硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则氨吸收减弱,造成检测结果偏低;可把接收瓶置于冷水浴中;5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量
溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。所以，加入的氢氧
化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。
４．７ 蒸气发生瓶内的水装至 ２／３ 体积并且保持酸性（在蒸气
发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示
剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱
性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水 至 ２／３ 容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水 呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入 １０ｍｌ ４０ｇ／ｌ 硼酸及 ２ 滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化 液 １０ｍｌ 于反应管内，经漏斗再加入 １０ｍｌ 氢氧化钠溶液，用 少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气 发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏 １０ｍｉｎ，将 冷凝管尖端提离液面继续蒸 １ｍｉｎ。 ２．１．３ 滴定
３．１０６ ６．７８１ ５．７２０ ３．６４５ １５．７２０ ４５．４０１ １．１３０ １．２７４
３．１０３ ７．２０２ ６．３４２ ４．４７１ １６．７３３ ４８．４０９ １．１９２ １．５０１
３．１５５ ７．２４５ ６．３４１ ４．４６５ １６．２７４ ４９．４１５ １．２０４ １．５９４
自动凯氏定氮法面粉操作流程
自动凯氏定氮法面粉操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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下面是自动凯氏定氮法面粉操作流程的详细步骤：一、准备工作1. 准备一定量的面粉样品，通常需要1-2克。
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实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量
一、实验目的与要求：
1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。
2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。
二、实验原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。
然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。
吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2↑+ 12SO2↑ + 16H2O
(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O
2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O
(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3
三、样品：面粉
四、仪器与试剂
仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W
试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。
1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体)
2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。
二组配500ml
3. 40%NaOH溶液
4. 0.0100mol/L盐酸标准溶液
5. 混合指示剂: 临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用)
五、测定方法
1、样品消化：
准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5g CuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。
为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。
注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80℃后，方可加入30%浓度的双氧水。
取50~60mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。
同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。
2、蒸馏与吸收：
⑴组装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸(呈黄色)，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
⑵将所有的夹子打开。
取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。
然后排出废水。
马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。
⑶量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，并加入 2滴混合指示剂，然后将此吸收液置于冷凝管下端插入到液面以下。
⑷将全部夹子打开，用移液管准确吸取10.0ml样品消化稀释液（或空白液），从样品加入口流入反应室内，用少量水(10ml)洗涤加入口，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。
将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，使反应室内的样液呈碱性，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防止氨的逸出。
⑸夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。
（6）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。
测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。
3．滴定：
用0.0100mol/L HCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。
平行实验进行数次。
同时吸取10.0mL 试剂空白消化液按上述操作做试剂空白试验。
注意：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。
洗净的标志：吸收液不变颜色
四、计算：
公式自己推导。
蛋白质% =
C — HCl标准溶液的浓度，mol/L；
V1—滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；
V2—滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；
m —面粉的质量， g；
0.01401－氮的毫摩尔质量；
F —小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70。
说明：参见书中P222
六、注意事项：
（1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。
（3）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL 后再继续加热消化。
（4）蒸馏装置不能漏气。
（5）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
（6）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。
以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（7）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min 后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。
（8）在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。
（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。