实验六 大肠杆菌和沙门氏杆菌
描述大肠杆菌与沙门氏菌在麦康凯培养基上形成的菌落颜色差异原理
大肠杆菌与沙门氏菌是两种常见的细菌，它们可以通过在麦康凯（MacConkey）培养基上生长并产生不同的菌落颜色。
这是因为麦康凯培养基中含有一种称为胆红素的指示剂，它可以根据细菌对乳果糖的发酵能力产生不同的颜色反应。
麦康凯培养基是一种区分肠道菌和非肠道菌的选择性和差异培养基。
它对肠杆菌科细菌是选择性的，对革兰氏阳性菌和许多其他细菌则是抑制作用的。
此外，麦康凯培养基是差异培养基，可以根据细菌的发酵能力和产酸性来区分不同的菌属和物种。
具体而言，麦康凯培养基中含有以下成分：1.硫酸盐和碱性消化酪蛋白酸盐：这些成分提供了一种碱性环境，能够抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长。
2.麦康凯胆盐：麦康凯培养基中含有胆盐，可以抑制革兰氏阴性菌中产酸性的产生。
3.中性红：这是一种指示剂，用于检测细菌对乳果糖的发酵能力。
现在我们来详细解释大肠杆菌和沙门氏菌在麦康凯培养基上形成的菌落颜色差异的原理。
1.大肠杆菌的颜色反应原理：大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，具有发酵乳果糖的能力。
当大肠杆菌生长在麦康凯培养基上时，它会发酵乳果糖产生酸性代谢产物，并降低培养基的 pH 值。
这种酸性环境会导致麦康凯培养基中的中性红指示剂变为粉红色，从而形成粉红色的菌落。
因此，大肠杆菌在麦康凯培养基上形成的菌落颜色通常是粉红色。
2.沙门氏菌的颜色反应原理：沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌，一些沙门氏菌亚种可以发酵乳果糖，但大多数亚种缺乏这种能力。
因此，当沙门氏菌亚种无法发酵乳果糖时，它们不会产生酸性代谢产物，培养基的 pH 值不会降低，中性红指示剂的颜色保持不变，即为无色。
这种情况下，沙门氏菌在麦康凯培养基上形成的菌落颜色通常是无色的。
综上所述，大肠杆菌和沙门氏菌在麦康凯培养基上形成的菌落颜色差异主要是由于它们对乳果糖的发酵能力不同。
大肠杆菌可以发酵乳果糖产生酸性代谢产物，导致中性红指示剂变为粉红色，形成粉红色的菌落。
而沙门氏菌大多数亚种无法发酵乳果糖，不产生酸性代谢产物，中性红指示剂的颜色保持不变，形成无色的菌落。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案实验原理：1、大肠杆菌的性质：大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：沙门氏杆菌是G-直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。
（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：（1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理：1、大肠杆菌的性质:大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S,不能利用xx酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：-沙门氏杆菌是G直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：(1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
(2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
(3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：(1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。
(2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：(1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
医学课件大肠杆菌和沙门氏菌
② 于培养物中加入0.5mL V-P甲液；
③ 随后加V-P乙液0.5mL，轻摇；
④ 静置10-15min。
⑤ 15min内变红者为阳性。
V-P甲液
V-P乙液
阳性 阴性
M.R与V-P试验原理
① M.R试验：
• 甲基红是一种pH指示剂：
pH 4.4 - 6.2 红→黄
• 当细菌分解葡萄糖产酸且产酸量大时；
3. 生化管接种培养
① 糖发酵试验：
葡乳麦甘蔗
② H2S试验； ③ 尿素酶试验； ④ 枸橼酸盐利用试验。
葡 乳 麦 甘 蔗 H2S 尿 枸
葡 乳 麦 甘 蔗 H2S 尿 枸
大肠杆菌
沙门氏菌
大肠杆菌 沙门氏菌 置 37℃培养
4. 吲哚试验
① 接种大肠杆菌或沙门氏菌于5mL邓亨氏蛋白胨水中， 置37℃培养3-5d；
一、目的要求
1. 学习常用的生化实验方法； 2. 掌握大肠杆菌与沙门氏菌的主要生化特点。
二、背景知识介绍
1. 大肠杆菌
G－
个体为杆状 散在或成对
① 大肠埃希氏菌是这个菌群的代表成原；
② 与广泛的兽医临床病征有关，如：
• 犊牛的肠道感中染和等水大泻小；
• •
幼狗猪的的尿水道泻感0和染.4腹；-0泻.7，×断2-奶3μ仔m猪水肿病；
实验原理?各种细菌在其新陈代谢中由于利用营养物质的能力有所差异排泄的代谢产物亦不同所以利用这点进行生化试验可达到鉴定细菌种的目的尤其在鉴定肠道杆菌时生化试验是极其常用的一种方法
实验原理
各种细菌在其新陈代谢中，由于利用营养 物质的能力有所差异，排泄的代谢产物亦 不同，所以利用这点进行生化试验，可达 到鉴定细菌种的目的，尤其在鉴定肠道杆 菌时，生化试验是极其常用的一种方法。
大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作
福氏志贺菌
NotI
XbaI
SpeI
(50 U/sample) (50U/sample) (30U/sample)
8、用枪头吸出缓冲液 M，避免损伤胶块。 9、每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的 下面。 10、在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。 步骤 5 加样
注：将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。病原菌使用的限制性内切如表： 病原菌 第一种酶 （浓度） 大肠杆菌 O157 第二种酶 （浓度） 第三种酶 （浓度）
XbaI
(50U/sample)
BlnI/AvrII
SpeI
(30U/sample) (30U/sample)
非 O157 产志贺毒素 大肠杆菌 沙门氏菌
注：缓冲液要置于冰上。不同试剂供应商，相同试剂供应商的不同酶切缓冲液是 不通用的，所以应根据产品说明来配制缓冲体系，这里以 TaKaRa 为例。 3、 在每个 1.5ml 微量离心管中加入 200µl 缓冲液。 4、 小心地从 TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下约 2mm 宽的胶块放入 1.5ml 微量离心管中。 确保胶块在液面下面。 将剩余的胶块放回原来的 TE 中。 6、将试管放在 37℃水浴中孵育 10-15 分钟。 7、在用稀释缓冲液孵育的过程中，以 XbalI 为例按照以下比例配制酶切反应体 系，混匀。 试剂 纯水 Buffer M BSA 酶（15U/µl） 总体积 µl/胶块 157µl 20µl 20µl 3µl 200µl µl/11 胶块 1727µl 220µl 220µl 33µl 2200µl
1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。 注：不要触碰电极。 2、 加入 2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约 1L/分钟）和 缓冲液在管道中正常循环。
实验五 大肠杆菌与沙门氏菌
扬州大学兽医学院
2019年12月31日星期二
实验原理
各种细菌在其新陈代谢中，由于利用营养 物质的能力有所差异，排泄的代谢产物亦 不同，所以利用这点进行生化试验，可达 到鉴定细菌种的目的，尤其在鉴定肠道杆 菌时，生化试验是极其常用的一种方法。
一、目的要求
1. 学习常用的生化实验方法； 2. 掌握大肠杆菌与沙门氏菌的主要生化特点。
＋(－) ；＋(－)
3. 细菌的染色、镜检
大肠杆菌
沙门氏菌
G－直杆菌，大小0.4-0.7×2-3μm， 无芽胞，两端钝圆，散在或成对。
4. 生化管接种培养
大肠杆菌
沙门氏菌
葡乳麦甘蔗
⊕⊕H/⊕2-
S⊕ －
尿⊕ 枸 －
葡乳麦甘蔗
H⊕ ＋ － 2
S⊕ －
尿⊕ ＋
枸－
5. 吲哚、M.R、V-P试验结果
2. 沙门氏菌
G－
个体为杆状 散在或成对
① 是一大群寄生于人和动物肠道内、生化特性和抗原结构 相似，G－，兼性厌氧的无芽胞直杆菌。
② 在医学、兽医和公共卫生上均十分重要： • 绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性； • 能致人和动物多种不同临床表现的沙门氏菌病； • 人类食物中毒的主要病原之一。
大肠杆菌
沙门氏菌
吲 M V哚 .R P 试试 试
吲 M V哚 .R P 试试 试
六、思考题
大肠杆菌与沙门氏菌：
1. 革兰氏染色特性与形态特点？ 2. 在麦康凯平板上的生长表现？ 3. 在三糖铁琼脂上的生长表现？ 4. 常规糖发酵情况？ 5. IMViC试验结果？
二、背景知识介绍
1. 大肠杆菌
G－
个体为杆状 散在或成对
大肠杆菌与沙门氏菌
大肠杆菌大肠细菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。
一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。
某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称病致病大肠杆菌。
一、生物学性状（一）形态与染色大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。
有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。
（二）培养特性在血琼脂平板上，有些菌株产生β型溶血。
在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径2～3mm的光滑型菌落。
生化反应：大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。
IMViC试验为“+、+、-、-”。
即为典型大肠杆菌。
（三）抗原构造较复杂，有O、K、H、F四种抗原。
O抗原为脂多糖，已有171种，其中162种与腹泻有关，是分群的基础。
K抗原有103种，为荚脂多糖抗原。
从病人新分离的大肠杆菌多有K抗原，有抗吞噬和补体杀菌作用。
根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三种，其中L、B不耐热，有60种。
F抗原至少有5种，与大肠杆菌的粘附作用有关、表明大肠杆菌血清型的方式是按O：K：H排列，例如O111：K58（B4）：H2。
（四）抵抗力该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。
胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。
对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。
二、致病性（一）致病物质1．定居因子（Colonization factor ,CF）;也称粘附素(Adhesin)，即大肠杆菌的菌毛。
致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁，以免被肠蠕动和肠分泌液清除。
使人类致泻的定居因子为CFAⅠ、CTAⅡ(Colonization factor antigen Ⅰ、Ⅱ)，定居因子具有较强的免疫原性，能刺激机体产生特异性抗体。
实验6 常见病原菌的形态观察.
液体培养基生长特征
在肉汤培养基中24小时后呈均匀混浊生长， 管底稍有沉淀。
链球菌
染色镜检形态特征
1. 革兰阳性，球形或卵圆形，直径小于0.８ ~ 1.0μm) 。
2. 呈链状或成双排列，短者4~8个细菌组成， 长者有20~30个细菌组成。
固体培养基生长特征
1. 营养要求较高。普通培养基中需加有血液、 血清、葡萄糖等才能生长。菌落小，灰白 透明，稍黏。
2. 血琼脂平板上形成灰白、光滑、圆形突起 小菌落，有不同溶血现象。
液体培养基生长特征
血清肉汤中生长，初呈均匀浑浊，后因 细菌形成长链呈颗粒状沉淀管底，上清 透明。
大肠杆菌
染色镜检形态特征
1. 革兰阴性中等大小杆菌。 2. 无芽胞，两端钝圆，散在或成对，通常无
可见荚膜。
固体培养基生长特征
1. 在营养琼脂上生长24h后，形成圆形凸起、 光滑、湿润、半透明、灰白色菌落，直径 约 2~3mm。
本属大多数细菌的培养特性与埃希氏菌属 相似。普通肉汤培养基中生长呈均匀混浊。
巴氏杆菌
染色镜检形态特征
1. 革兰阴性。 2.为球杆状或短杆状菌，两端钝圆，大小为
0.25~0.4μm×0.5~2.5μm；单个存在，有 时成双排列； 3. 病料涂片用瑞氏染色或美蓝染色时，可见 典型的两极着色。
固体培养基生长特征
2. 麦康凯琼脂上形成红色菌落。 3. 在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的
菌落。 4. 一些致病性菌株在绵羊血平板上呈β溶血。
液体培养基生长特征
S型菌株在肉汤中培养18~24h，呈均匀浑 浊，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌环。
沙门菌
染色镜检形态特征
1. 革兰阴性的中等大小杆菌（比大肠杆菌 细）；
家禽大肠杆菌和沙门氏菌分离及药敏试验
家禽大肠杆菌和沙门氏菌分离及药敏试验方法鸡大肠杆菌病主要依靠药物防治，但药物的大量使用带来了大肠杆菌多重耐药性和药物残留等诸多问题。
目前世界许多地方开展了调查研究试验材料1.病料来源。
养殖户送检样本有典型大肠杆菌和沙门氏菌病变的病死鸡，孵化后期死亡鸡胚（没有出壳鸡苗）作病料。
毛蛋没有出壳小鸡小鸡卵黄囊青年鸡病料2.细菌分离用的培养基：麦康凯培养基、普通培养基、SS培养基、亚硫酸铋培养基等二、试验方法1.大肠杆菌的分离培养。
无菌采取死鸡的肝、孵化后期死胚卵黄囊（没有出壳鸡苗）在麦康凯平板上分区划线37℃培养12~24小时，在麦康凯培养基上生长出边缘整齐稍凸起、表面光滑湿润、直径1～2毫米的红色圆形菌落，革兰氏阴性，接种到SS培养基37℃培养12~24小时，生长出粉红菌落。
亚硫酸铋琼脂大肠杆菌不生长。
2.沙门氏菌分离培养。
无菌采取死鸡的肝、孵化后期死胚卵黄囊在在麦康凯平板上分区划线37℃培养12~24小时，然后挑取麦康凯琼脂平板上淡黄色半透明单个菌落，接种到SS培养基37℃培养12~24小时，生长出黄色半透明或黑色菌落。
亚硫酸铋琼脂沙门氏菌生长绿色单个菌落。
如图：SS培养基沙门氏亚硫酸铋琼脂沙门氏菌麦康凯培养基大肠杆菌SS培养基大肠杆菌和沙门氏菌普通培养基大肠杆菌和沙门氏菌三．药敏试验分离到的大肠杆菌和沙门氏菌混合在一起，涂匀营养培养基，选用的药敏片做好标号，平整贴在培养基上37℃培养12~24小时，观察细菌抑菌圈大小，选抑菌圈越大药物敏感度越高，使用疗效越好。
同时考虑某些药物肠道不吸收问题。
四．药敏分析及预防：该地区的大肠杆菌和沙门氏菌对粘杆菌素、痢菌净、氟苯尼考、硫酸阿米卡星、头孢噻呋、硫酸新霉素较敏感。
合理搭配抗生素使用减少细菌耐药性的产生，临床上长期大量使用不规范抗菌药物，致使大肠杆菌沙门氏菌耐药菌株不断产生，敏感的药物越来越少，也可以据本场的大肠杆菌和沙门氏菌血清型做疫苗预防。
这提示我们每隔一定时间要对本地区的大肠杆菌耐药性进行检测，以便更好地选择敏感有效的药物，以控制该病的流行。
鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计
鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计鸡肠道致病菌种类：大肠杆菌与沙门氏菌实验内容：阶段一：大肠杆菌与沙门氏菌的形态培养特性的观察，实验材料的增菌与直接分离培养。
阶段二：识别菌落、做纯培养及三糖铁琼脂接种阶段三：菌种纯度检查及生化培养基接种阶段四：生化反应结果观察与沙门氏菌血清学诊断。
阶段一：1、材料实验菌种混合菌液甲（大肠杆菌和沙门氏菌），混合菌液乙（产气肠杆菌与普通变形杆菌）观察材料四种细菌的融通培养物、琼脂平板、麦康凯或SS琼脂平板的培养物、三糖铁琼脂培养物。
培养基亚硒酸盐亮绿增菌液或四磺酸钠增菌液；SS琼脂平板、麦康凯、琼脂平板等选择与鉴别培养基。
2、内容与方法培养特性观察对大肠杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌在常用培养基上的培养特性作仔细观察并相互比较。
形态观察以无菌接种环分别挑取上述四种细菌在麦康凯等琼脂平板上生长的单个菌落。
在玻片上制成涂片，待自然干燥后，以火焰固定，用革兰氏染色法染色，镜检。
观察没在细菌的形态、大小与排列方式，并作比较。
这四种细菌都是革兰氏阴性而两端钝圆的杆菌，无芽孢和荚膜，大小差异不显著。
增菌培养用无菌2ml刻度吸管吸取混合菌液甲2ml，分别加入亚硝酸盐亮绿增菌液100ml 的试管与四磺酸钠增菌液10ml的试管中各1ml。
换另一支无菌吸管，以同样的方法将混合菌液乙接种到两种增菌液中，接种后轻轻摇匀，置37摄氏度恒温箱内培养18---24h。
直接分离培养每种混合菌液用常规划线方法，接种麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板各一个。
置37摄氏度恒温箱内培养24h后取出，观察每种平板上两种细菌的生长情况，单个菌落的形态，并比较之。
保留活动单个菌落的平板培养物，待阶段二使用。
阶段二1、材料普通琼脂斜面、三糖铁琼脂等。
2、内容与安排纯培养从经24h培养的麦康凯琼脂平板上，分别选出4种不同的细菌的单个菌落。
然后，用无菌接种环在四个单个菌落的中央表面轻轻取培养物少许，各移植至普通琼脂斜面一管，置37摄氏度恒温箱中培养24后，取出后在冰箱内或室温保存备用。
实验六 大肠杆菌和沙门氏杆菌
增 菌 ：血清肉汤
运动性
不溶血
G-菌球杆
动物接种：小白鼠皮下接种 死亡检剖败血症 可疑菌落
脏器涂片镜检
分离培养纯培养源自血液、肠淋巴结及肠黏膜刮取物
及其他病变组织
革
兰
麦康凯或伊红美
麦康凯或血琼脂
氏
兰平板划线分离
平板划线分离
染
色
镜
挑取疑似菌落5-10个分别接种TSI和普通琼脂斜面
检
TSI呈A（K）/A 反应的，其 STI
+（-） 生长物或普通琼脂斜面纯培养菌
生化试验鉴定 猪水肿病菌株 血清型鉴定
ETEC菌株毒力因子鉴定
沙门氏杆菌微生生学诊断程序
未污染病料
在肠道杆菌鉴别培 养基上划线分离
病料
革
兰
污染病料
氏
染
色
用肠道杆菌增菌
镜
培养基增菌
检
挑取疑似菌落分别接种TSI和尿素培养基
普 通
斜
TSI呈 K（A）/K 反应的，尿素分解阴性的STI培养菌
面
+(-), +(-)
纯
培
菌株鉴定
养
沙门菌生化鉴定
沙门菌A-F群多价 O血清平板凝集
大肠杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌
麦康凯培养基上形成红色菌落； 伊红美蓝平板：黑色带有金属光泽菌 落； 远腾琼脂平板：红色带有光泽菌落
大肠杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌（E．coli）
结果观察
大肠杆菌 葡乳麦甘蔗
⊕⊕⊕⊕⊕
沙门氏菌 葡乳麦甘蔗
+- + + -
动物致病性大肠杆菌分离鉴定程序
病料
粪便、肠内容物
大肠杆菌和沙门氏菌的鉴别诊断要点。
大肠杆菌和沙门氏菌的鉴别诊断要点。
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大肠杆菌与沙门氏菌的分离鉴定
一、立题依据1、现状分析及研究意义仔猪白痢病是农村养猪中的常发病、多发病。
常常由于延误医治时间，往往发生整窝死亡，造成很大经济损失。
仔猪白痢病在临床上十分多见, 它主要是由致病性大肠杆菌所引起的以仔猪肠炎或败血症为主要症状的一种病症。
仔猪副伤寒是由猪伤寒沙门氏菌等引起的仔猪细菌性传染病。
沙门氏菌属是肠道杆菌科的一个重要属，包括 2 500 种以上血清型，它们主要在人及动物的肠道内寄生，绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物多种不同临床病变的沙门氏菌病，在医学和公共卫生上均十分重要。
我小组主要基于以上的情况，针对疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪肝脏病样进行病原菌的分离鉴定，以便通过实验来对两种重要病原菌的主要特征进行更深入的了解和掌握。
二、研究方案（一）研究目的，研究内容和拟解决的问题。
1、研究目的：本次设计性病原菌分离鉴定实验，意在提高我们的实践动手能力，让我们将所学的知识综合运用，开拓自我思维，学会主动思考。
在病原菌的分离鉴定中，还可以促进我们对病原菌生理特性的了解，以及对各种分离鉴定方法和技术的掌握以此提高我们对知识的综合运用能力以及设计实验的谨慎思维能力。
2、研究内容：将疑似疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪肝脏病样进行初步观察并用取样进行实验室病原菌的分离鉴定。
3、拟解决的关键问题：①确定并掌握病原菌的分离鉴定方法。
②充分描述病原菌的特征，将它与已知的细菌特征对比，得出结论。
（二）、所需材料试剂、研究方法及预期结果1、所需材料试剂1.1材料：病死猪肝脏病样1.2试剂：氯化镁孔雀绿增菌培养基、麦康凯琼脂培养基、SS营养琼脂培养基、微量生化发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡磷胨、尿素、枸橼酸盐、甘露醇、H2 S），美兰，结晶紫，碘液，酒精，品红，三糖铁培养基、厌氧肉汤和普通肉汤。
附：普通肉汤：牛肉膏0.15g+蛋白胨0.3g+Nacl 0.l5g+H2O 30mL混合倒入容器搅拌均匀（牛肉膏和蛋白胨均用玻璃纸称量后一起放入容器加热后取出，Nacl用标准纸）—称总重—加热融化（搅拌至煮沸）—补水（10g=10mL)—加NaoH调PH（7.4-7.6），用试纸检验—过滤—分装3管—包装好进行灭菌厌氧肉汤：之前步骤与普通肉汤相同，在普通肉汤的基础上没管加入肝粒5~6块，每管加石蜡密封，包装好灭菌2、研究方法2.1指出所给病样及组织2.2初步观察病样2.3.细茵分离病例需进行实验室检查，可从实质器官中取少量病样，依次进行直接染色镜检观察，增菌培养同时鉴别培养，菌落特征观察，麦康凯平板扩大培养，染色镜检，接种肉汤和厌氧肉汤，生化鉴定。
实验六 肠杆菌科细菌的微生物学鉴定.
实验六肠杆菌科细菌的微生物学鉴定课程名称:兽医微生物学实验学时:6学时一、目的要求1.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌形态与染色特性以及主要培养特性;2.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌常规微生物学诊断法;3.掌握大肠杆菌和沙门氏菌生化试验的方法和原理;4.熟悉大肠杆菌和沙门氏菌在选择性和鉴别培养基上的生长表现;5.熟悉沙门氏菌血清分群、定型的方法和步骤。
二、知识背景肠杆菌科的细菌为革兰氏阴性、中等大小的杆菌,运动者周身鞭毛;在普通培养基上生长好;发酵葡萄糖和碳水化合物者产酸或产酸产气;在麦康凯琼脂上生长;细胞色素氧化酶阴性;还原硝酸盐为亚硝酸盐等。
碳水化合物的利用和其它生化试验是肠杆菌科细菌鉴定的重要试验。
大肠埃希氏菌(E.coli简称大肠杆菌,作为原发和继发病原可引起多种动物疾病:犊牛的肠道感染和水泻;幼猪的水泻和腹泻,二月龄以上猪的出血性肠炎和水肿病;狗的尿道感染;鸡的气囊炎和大肠杆菌肉芽肿(Coligranuloma。
沙门氏菌(Salmonella,虽然沙门氏菌血清型超过2200个,但承认的种为数不多,在O抗原的基础上,沙门氏菌血清组(群用字母A、B、C…表示,然后根据它的H抗原(鞭毛抗原再分,用阿拉伯数字1、2、3…等表示,沙门氏菌可引起多种动物和人的疾病,是肠杆菌科重要的致病菌,如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium可引起动物流产,胃肠炎和败血症。
其它肠杆菌科成员:肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae可引起牛乳房炎、肺炎、母马的宫颈炎和子宫炎,这个菌常形成厚的荚膜。
变形杆菌(proteus引起动物的尿道和胃肠道疾病。
耶尔森氏菌(yersinia引起鼠疫、胃肠炎等。
生化试验和血清群的鉴定和定型在肠杆菌科细菌的鉴定中占很重要的位置。
三、实验材料每6人一组,每组所需材料:1.普通琼脂斜面培养物2管:分别为大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(提供实验用菌种;2.普通肉汤2管:分别用来接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌;3.普通琼脂平板2个分别用来划线接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌;4.生化试验用培养基2套,包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验管、靛基质,M.R、V.P试验、柠檬酸盐利用,硝酸盐还原试验等;5.三糖铁琼脂斜面培养基2管;6.选择性培养基2个,如:麦康凯琼脂平板或远滕氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板;7.各种生化试验试剂:靛基质试剂,M.R试剂,V.P试剂,硝酸盐还原试剂;8.沙门氏菌因子血清。
实验六肠道杆菌
实验结果分析 一、肠道选择鉴别培养基 SS 平板中起鉴别和选择作用的主要物质各是什么？
鉴别的结果是如何显示的？
二、写出双糖管的组成成分、部位、性质和作用等
双糖管 上层
所含糖类
下层
所含指示剂
培养基物理性状 接种方法
观察内容
三、请根据示教，记录下列各菌在双糖培养基中的生长情况，
“—” 表示不产酸不产气；“+”表示产酸；“⊕”表示0 1:1280
1:2560
抗体 最终 效价
本试验的性质是：
五、写出粪便肠道致病菌分离鉴定流程
六、写出粪便标本鉴定报告及理由
标本 鉴定结果 1号 2号
菌落
理
由
双糖管
玻片凝集试验
双糖
大 肠 埃 痢 疾 志 伤 寒 沙 门 付 伤 寒 沙 变形杆菌
培养基
希菌 贺菌
菌
门杆菌
上层（乳糖）
下层（葡萄糖）
硫化氢
动力
四、用“++++”“+++”“++”“+”和“—”记录肥达试验结果
抗原
抗 体稀 释 度
伤寒 O
1:20 1:40
伤寒 H
副伤寒甲 H
肖氏*H
*副伤寒乙
血清学诊断结论：
1:80
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大肠杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌
麦康凯培养基上形成红色菌落； 伊红美蓝平板：黑色带有金属光泽菌 落； 远腾琼脂平板：红色带有光泽菌落
大肠杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌（E．coli）
结果观察
大肠杆菌 葡乳麦甘蔗
⊕⊕⊕⊕⊕
沙门氏菌 葡乳麦甘蔗
+- + + -
动物致病性大肠杆菌分离鉴定程序
病料
粪便、肠内容物
增 菌 ：血清肉汤
运动性
不溶血
G-菌球杆
动物接种：小白鼠皮下接种 死亡检剖败血症 可疑菌落
脏器涂片镜检
分离培养
纯培养
E.Coli为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长 良好，最适宜生长温度为37℃，最适合生 长pH为7.2～7.4。麦康凯琼脂上形成红色 菌落，在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属 闪光的菌落，在SS琼脂上一般不生长或者 生长较差，生长的菌落呈红色。
一些致病性菌株在绵羊血液平板上呈β 型溶血。在营养琼脂上生长24h，形成圆形、 隆起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落， 直径2～3mm。
沙门氏杆菌微生生学诊断程序
未污染病料
在肠道杆菌鉴别培 养基上划线分离
病料
革
兰污染病料氏染来自色用肠道杆菌增菌
镜
培养基增菌
检
挑取疑似菌落分别接种TSI和尿素培养基
普 通
斜
TSI呈 K（A）/K 反应的，尿素分解阴性的STI培养菌
面
+(-), +(-)
纯
培
菌株鉴定
养
沙门菌生化鉴定
沙门菌A-F群多价 O血清平板凝集
实验六 大肠杆菌和沙门氏杆菌
目的要求：
1、掌握致病大肠杆菌、沙门氏杆菌的微生物学诊断方法。 2、熟悉致病大肠杆菌、沙门氏杆菌形态、培养特性。
实验内容：
一、观察致病大肠杆菌、沙门氏杆菌形态、培养特性。 二、接种大肠杆菌、沙门氏杆菌于鉴别培养基（远腾、SS、BTB），观察结果。 三、大肠杆菌、沙门氏杆菌的微生物学诊断程序。
血清型鉴定
报告鉴定结果
多杀性巴氏菌
革兰氏染色的肺组织中有 大量阴性球杆菌
多杀性巴氏杆菌（Ｐasteurelloa maltocida）
微生物学诊断
病料：（渗出液、心血、肝、脾、淋巴结、骨髓等）
涂片镜检：G-；瑞氏/美兰（新鲜病料）两极着染；球杆菌
培养 分离培养：血液/血清裂解血平板 菌落形状
血液、肠淋巴结
及肠黏膜刮取物
及其他病变组织
革
兰
麦康凯或伊红美
麦康凯或血琼脂
氏
兰平板划线分离
平板划线分离
染
色
镜
挑取疑似菌落5-10个分别接种TSI和普通琼脂斜面
检
TSI呈A（K）/A 反应的，其 STI
+（-） 生长物或普通琼脂斜面纯培养菌
生化试验鉴定 猪水肿病菌株 血清型鉴定
ETEC菌株毒力因子鉴定