生物实验：大肠杆菌的分离与培养
实验一大肠杆菌的培养和分离
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
大肠培养实验报告
一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生长特性。
2. 掌握大肠杆菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 学习使用显微镜观察大肠杆菌的形态。
4. 熟悉大肠杆菌的生理生化特性。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性、无芽孢、兼性厌氧的细菌，广泛存在于自然界和人体肠道中。
大肠杆菌的培养和鉴定是微生物学实验中的重要内容。
本实验通过分离、纯化和鉴定大肠杆菌，了解其生长特性，为后续研究提供基础。
三、实验材料与仪器1. 材料：普通琼脂、营养肉汤、乳糖、胆盐、伊红、美蓝、无菌水、无菌棉签、酒精灯、培养皿、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、电子天平、无菌操作台、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 分离大肠杆菌（1）取少量疑似大肠杆菌的样品，用无菌棉签涂抹于营养肉汤中。
（2）将营养肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，用无菌移液器吸取少量，涂布于普通琼脂平板上。
（4）将平板置于恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
2. 纯化大肠杆菌（1）挑取单菌落，接种于新的营养肉汤中。
（2）将培养后的肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，用无菌移液器吸取少量，涂布于新的普通琼脂平板上。
（4）重复上述步骤，直至获得纯化的大肠杆菌。
3. 鉴定大肠杆菌（1）革兰氏染色：取纯化的大肠杆菌，制作革兰氏染色片，观察细菌形态。
（2）生化试验：进行乳糖发酵试验、硫化氢试验、吲哚试验等，鉴定大肠杆菌的生理生化特性。
4. 观察大肠杆菌形态（1）将纯化的大肠杆菌接种于营养肉汤中。
（2）将培养后的肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，制作涂片，置于显微镜下观察细菌形态。
五、实验结果与分析1. 分离大肠杆菌在涂布有疑似大肠杆菌样品的琼脂平板上，观察到典型的圆形、湿润、边缘整齐的菌落。
2. 纯化大肠杆菌经过多次纯化，获得纯化的大肠杆菌。
3. 鉴定大肠杆菌革兰氏染色结果显示，大肠杆菌为革兰氏阴性菌。
分离大肠杆菌的方法
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是微生物学研究中的重要模式生物。
分离大肠杆菌是许多实验室中常见的操作，这里将介绍几种常用的分离方法。
1.无菌技术准备在进行分离大肠杆菌之前，必须保证实验环境的无菌。
操作前要用75%乙醇对操作台面进行消毒，使用无菌培养皿和试管，并佩戴无菌手套。
2.样品采集从目标样品中采集含有大肠杆菌的样品。
常见的样品类型包括食品、水样、粪便等。
采集样品时要注意避免污染，使用无菌容器收集样品。
3.预处理样品将采集到的样品进行预处理，以提高大肠杆菌的分离效率。
常用的预处理方法包括：(1) 粪便样品：将粪便样品稀释于无菌生理盐水中，通过离心操作去除大部分固体颗粒。
(2) 食品样品：将食品样品加入适量的无菌生理盐水中，进行均匀搅拌。
(3) 水样：直接使用无菌容器收集水样，避免污染。
4.选择培养基根据实验需要选择适合分离大肠杆菌的培养基。
常用的培养基包括营养琼脂糖平板（Nutrient Agar Plate）、MacConkey琼脂糖平板（MacConkey Agar Plate）等。
这些培养基含有适合大肠杆菌生长的营养物质，并可以通过某些特殊成分选择性地抑制其他细菌的生长。
5.涂布法涂布法是最常用的分离大肠杆菌的方法之一。
具体操作步骤如下：(1) 取一支无菌的鉴别环，将其蘸取预处理后的样品。
(2) 将鉴别环均匀地涂布在培养基平板的表面上。
(3) 使用无菌铁环或无菌玻璃杆均匀涂布，以保证样品的均匀分布。
(4) 将涂布好的培养基平板放置在恒温培养箱中，以适当的温度（通常为37摄氏度）进行培养。
6.滤膜法滤膜法是一种通过滤膜来分离大肠杆菌的方法。
具体操作步骤如下：(1) 准备无菌滤膜和滤膜培养基。
(2) 将预处理后的样品滤过滤膜，将滤膜放置在滤膜培养基平板上。
(3) 将滤膜培养基平板放置在恒温培养箱中进行培养。
7.生物化学试验分离大肠杆菌后，需要进行进一步的鉴别和确认。
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
高中生物选修一 第一部分 实验1 大肠杆菌的培养和分离
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
实验一大肠杆菌的培养和分离
操作时右手无名指和小指 夹住封口膜，另外三指持 三角瓶，左手拿培养皿并 打开上盖的一边，在酒精 灯火焰旁操作。
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（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液 体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手 无名指和小指夹住斜面的棉塞和 三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液 体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离） 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
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大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
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• 实验器材
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
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（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。
实验一大肠杆菌的培养与分离(最新)
恒温培养箱
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床
摇床
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床 7、酒精灯和超净台
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 用途：90%以上的微生物是对人类有利的。如抗生素 多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳 由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染， 在新能源领域将发挥巨大作用。
1）放线菌
1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
实验大肠杆菌培养和分离
实验大肠杆菌培养和分离
比较消毒与灭菌
比较 理化因素的作 消灭微生物的数 芽孢和孢子能否
项
用强度
量
被消灭
消毒 灭菌
较为温和
部分生活状态 的微生物
强烈
全部微生物
不能
实验大肠杆菌培养和分离
3、常用的灭菌和消毒的方法
（1）灭菌方法：
高压蒸汽灭菌 （湿热灭菌）
实验大肠杆菌培养和分离
2、成分 水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 调节pH 真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
实验大肠杆菌培养和分离
实验1： 大肠杆菌的培养和分离
实验大肠杆菌培养和分离
一、基础知识： (一)微生物
病毒 细菌
微生物包括哪五类： 放线菌
真菌
原生生物
病毒界 原核生物界
真菌界 原生生物界
特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且 体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体 培养基上大量生长繁殖时，所 形成的肉眼可见的具有一定形 态结构的子细胞群体。
大肠杆菌
不同微生物形成的菌落具有不同 大肠杆菌菌落： 的特征，是鉴定菌种的重要依据。白色或乳白色，光滑
如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。
酵母菌
放线菌
霉菌
实验大肠杆菌培养和分离
均匀混浊生长
分离大肠杆菌的方法
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，常存在于人和动物的肠道中。
尽管大肠杆菌在正常情况下对人体有益，但某些菌株也可以引起严重的感染和疾病。
因此，分离大肠杆菌并进行进一步研究和鉴定是非常重要的。
本文将介绍几种常用的分离大肠杆菌的方法。
1. 纯培养基分离法纯培养基分离法是分离大肠杆菌的常用方法之一。
首先，可以使用选择性培养基，如MacConkey琼脂培养基，其中含有发酵大肠杆菌的特定物质（如乳糖）。
大肠杆菌能够利用乳糖产生酸，导致琼脂变成红色。
然后，从样品中接种适量的细菌在含有选择性培养基的琼脂平板上进行培养。
大肠杆菌会在琼脂上生长并形成典型的红色菌落。
2. 群体分离法群体分离法是一种通过分离菌落的方法来分离大肠杆菌的有效方法。
首先，将样品均匀涂布在含有琼脂的培养基上，并在适当的温度下进行培养。
大肠杆菌在琼脂上形成单独的菌落，而其他细菌可能形成不同形状或颜色的菌落。
然后，通过挑选典型的菌落进行分离并进行进一步鉴定。
3. 抗生素敏感性试验大肠杆菌对不同抗生素的敏感性有所不同，因此抗生素敏感性试验可以作为分离大肠杆菌的方法之一。
将大肠杆菌接种在含有不同抗生素的琼脂平板上，然后观察菌落的生长情况。
大肠杆菌对某些抗生素具有抗性，因此在含有这些抗生素的琼脂平板上，大肠杆菌的生长会受到抑制，而其他细菌则可能继续生长。
通过观察菌落的生长情况，可以初步判断出含有大肠杆菌的菌落。
4. 生化试验生化试验是一种通过检测大肠杆菌所产生的特定酶或代谢产物来分离和鉴定大肠杆菌的方法。
例如，大肠杆菌能够产生β-半乳糖苷酶，可以将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。
通过将大肠杆菌接种在含有乳糖的培养基上，并添加某种指示剂，如菲嗪红，可以观察到培养基的颜色变化。
如果大肠杆菌存在，培养基会变成黄色。
5. 分子生物学方法分子生物学方法是一种准确且快速的分离大肠杆菌的方法。
通过检测大肠杆菌特有的基因或DNA片段，如16S rRNA基因，可以准确鉴定大肠杆菌。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落 形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色 为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化 反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌 的菌落数量，菌落数量在适宜的条件 下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆 菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独 获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离， 获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。 分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反 应等生物学特性，能够通过实验结果 判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生 的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特 性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存 等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引 起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原 和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
01
02
03
基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂 培养基等，提供大肠杆菌 生长所需的基本营养成分。
高中生物 第一部分《实验一 大肠杆菌的培养和分离》课件13 浙科版选修1
①常用的固体培养基:
琼脂固体培养基. ②微生物在固体培养基
表面生长,可以形成
肉眼可见的菌落.
第七页，共38页。
2.培养基内所含的基本物质
• (1)水 • (2)碳源
• (3)氮源
• (4)无机盐
第八页，共38页。
3.培养基内所需的其他条件 • (1)pH值 • 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱
α-固定化酶的使用 α-固定化酶 条件和效果
枯草杆菌
果酒和果醋的制作 果酒:酵母菌+天然 干酵母 果醋:醋化醋杆菌 菌种或醋曲
泡菜的腌制和亚硝 假丝酵母、乳酸菌 天然微生物 酸的测定
植物组织培养
菊花
第二页，共38页。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的： • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进
的铅笔上，冷却后使培养基形成斜面。
第二十页，共38页。
步骤:
１、配制培养基; 培养基灭菌、器具灭菌
2、冷却，倒平板 (编号,无菌环境操无菌环境操作)
４、划线分离、恒温培养箱培养12~24h
(无菌环境操作)
５、接种斜面,4℃冰箱保存(目的:为了保存菌种)
6、实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处理后丢失。
4℃冰箱保存。
视频
6.实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处 理后丢弃。 目的：为了防止实验菌残留于接种环而污染环境 和感染实验人员。
第三十一页，共38页。
1为了获得纯净的培养物，其关键是防止外来杂菌的入侵 污染： 1）培养皿； 2）培养基； 3）接种过程是无菌的 2请思考：培养基、培养皿、手、接种环分别如何消毒或 灭菌？
大肠杆菌的分离及培养条件的优化
• 5.在暗箱盖开启状态下调节零 点调节器，使读数盘指针指向 t=0处。 6.盖上暗箱盖， 调节“100”调节器，使空白 管的t=100，指针稳定后逐步 拉出样品滑竿，分别读出测定 管的光密度值，并记录。 7.比色完毕，关上电源，取出 比色皿洗净，样品室用软布或 软纸擦净。
注意事项
• 在仪器尚未接通电源时，电表 指针必须于“0”刻线上，若 不是这种情况，则可以用电表 上的校正螺丝进行调节。 • 该仪器应放在干燥的房间内， 使用时放置在坚固平稳的工作 台上，室内照明不宜太强。
分离结果
10负四次
10负五次
划线分离
大肠杆菌培养基条件的优化
• 选用氮源为主要优化条 件 • 采用复合氮源，在lb培 养基为基础优化
实验方案：
实验方案经与老师讨论过后实验方案如下： 酵母 蛋白 Nacl 硝酸铵 氯化铵 尿素
1%尿素 2%尿素 1%Na4NO3 2%Na4NO3 粉 胨 0.5% 1% 0.5% 1% 0.5% 1% 0.5% 1% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 1%
1%（NH4)2SO4 0.5% 1% 2%（NH4)2SO4 0.5% 1% 原LB培养基 0.5% 1%
--- ----- --1% --2% ----- 1% --- 2% --- ---
2%
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优化过程
• 配制培养基：首先配置lb培养 基，分装于七个锥形瓶中，按 方案称取无机氮源依次加入瓶 中，混匀 • 调PH：用NaoH将PH调至7.2
大肠杆菌的分离
• 原理： • 划线分离：微生物细胞数量将 随着划线次数的增加而减少， 并逐步分散开来 。 • 涂布分离：将稀释后菌液用涂 布棒在平板上均匀涂布，以达 到分离目的。
实验1---大肠杆菌的培养和分离
实验1 大肠杆菌的培养和别离高二年级班学号：实验日期：____月日【知识准备】1．背景知识：大肠杆菌〔Escherichia coli，E.coli〕是微生物学和遗传学常用的实验材料，为单细胞原核生物，宽约0.5×1～3微米；具有由肽聚糖组成的细胞壁；周身具鞭毛，能运动。
大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的正常栖居菌，但假设进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。
它能利用多种糖类物质产酸、产气，其代谢类型为异养兼性厌氧型；其代谢活动能产生大肠杆菌素〔抑制肠道内其他分解蛋白质的微生物生长〕，还能合成维生素B和K。
它们在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。
实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。
按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。
将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。
而在固体培养基外表用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以到达接种的目的，又可以实现别离菌种的目的。
这是因为划线过程中接种环与培养基外表接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就到达了别离细菌的目的。
2．实验原理：使用通用的细菌培养基〔如LB液体培养基〕可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。
在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线别离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单独的菌落。
这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。
为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌操作。
3．思考题〔1〕为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象？〔2〕进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象吗？〔3〕本实验的关键步骤——划线别离的目的是什么？〔4〕在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?在操作过程中应注意什么？【实验目的】1．利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增2．用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线别离3．了解微生物实验的操作原理和培养条件【材料用具】大肠杆菌菌种装有固体培养基的、已灭菌培养皿；装有LB液体培养基的、已灭菌的250ml三角瓶封口膜和橡皮圈酒精灯接种环镊子装有酒精棉球的广口瓶恒温培养箱摇床【操作流程】灭菌、消毒划线、接种培养、观察【实验步骤】1．接种前的准备进行接种操作前，应先洗手，再用70%的酒精棉球擦拭双手和桌面。
大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准
⼤肠杆菌微⽣物培养实验报告及评价标准实验1 微⽣物的分离、培养及计数实验原理纯化分离：⼈为提供适宜的菌落⽣长的条件（包括营养、温度、Ph 等）。
⽤平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表⾯连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表⾯。
在数次划线后培养，可以分离到由⼀个细胞繁殖⽽来的⾁眼可见的⼦细胞菌落。
筛选：转基因⼤肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。
⽽普通的⼤肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。
由此可进⾏⼤肠杆菌的筛选。
梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的⼤肠杆菌稀释到⼀定浓度，⽤稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表⾯进⾏培养。
在稀释度⾜够⾼的菌液⾥，聚集在⼀起的微⽣物将被分散成单个细胞，从⽽能在培养基表⾯形成单个的菌落。
由此可计数计算⼤肠杆菌的数量。
实验⽬的1. 通过制备LB 固体培养基，对平板进⾏划线等，学会使⽤固体LB 平板。
2. 通过⽤液体培养基，学会对微⽣物进⾏扩⼤培养。
3. 通过稀释，学会⽤计数器对微⽣物进⾏计数。
实验材料和药品待分离的⼤肠杆菌菌液、⾼压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养⽫、恒温培养箱、摇床、酒精灯、⽆菌⽔、移液枪、EP 管实验步骤（⽤简单的流程图表⽰）实验数据的记录与分析（如照⽚、表格等）稀释倍数104105⼤肠杆菌单个菌落个数837799111812平均数86.313.7浓度 1.726×1070.274×107实验结果与讨论结果：稀释了105计算出来的结果约为1.726×107ml/cm^3稀释了104计算出来的结果约为0.274×107ml/cm^3全组数据计算出来结果为2.233×107ml/cm^3讨论：在稀释倍数为104的试验中⼤肠杆菌菌落较少，原因可能是在稀释过程操作中，震荡不够，⽽且由于不⼩⼼洒了半管104稀释液，所以取液接种的时候底层的⼤肠杆菌数量偏少了。
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实验结果与分析
•加氨苄青霉素 •所加菌液：普通 •分离方法：划线 •现象：有菌，集中 分布，不均匀，相霉素 •所加菌液：混合 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 数量较多，但有黄色 透明杂菌。
实验结果与分析
实验反思与总结
这次实验过程中，总的来说较上次在分工 方面有了显著的提高，故而实验做的比较有 序。 但美中不足的是实验结果依然与预期有不 同之处：①培养基被标记错误②杂菌较多， 无菌操作不够规范。 可能还是对实验的预习不够明确，所以在 实验时总是忘记要在酒精灯旁操作这一要求， 在下次试验中一定会多加注意。
Thank You
实验步骤及现象
2.大肠杆菌单克隆的分离与培养 ①设置对照组（6号培养皿）和实验 组（5号培养皿）。 ②向实验组培养皿中加入氨苄青霉素
实验步骤及现象
③用接种环划线 i.将接种环放在火焰上灼烧，直到其烧红。 ii.在火焰旁冷却接种环，同时打开离心管。 iii.在火焰旁将已冷却的接种环伸入普通大肠杆菌 菌液中，蘸取一环菌液，盖上试管。 iiii.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的 接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖 上皿盖。 iiiii.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线 的末端开始往第二区域内划线，重复这一操作， 在三、四、五区域划线。
4号 混合 涂布
6号 普通 划线
实验步骤及现象
1.筛选分离含有重组DNA的受体细胞 ①设置对照组（2、4号）和实验组（1、3 号）； ②向实验组培养皿中加氨苄青霉素 ③向1、2号加含有重组DNA的大肠杆菌 向3、4号加混合大肠杆菌（既有普通的， 也有转基因的）
实验步骤及现象
④用涂布器涂布 i.用酒精灯灼烧涂布棒（靠近涂布端的手柄也 要灼烧）静置冷却（以防温度过杀死微生物）。 ii.用移液枪取50μl的大肠杆菌加至培养基上。 1000μl=1ml iii.用涂布棒将其均匀涂布于平板上。 iiii.静置5min，倒置培养于37°C的培养箱中。 ⑤在培养皿壁上写、姓名、实验名称，一天后 调查统计各个处理菌落数目。
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：混合 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 但有杂菌。
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：普通 •分离方法：划线 •现象：无大肠杆菌， 但有几个黄色杂菌。
实验结果与分析
•加氨苄青霉素 •所加菌液：转基因 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 相对较多。
实验二 大肠杆菌的分离与培养
实验时间：2011.5.23
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实验原理 实验器材与药品
实验步骤及现象
实验结果与分析 实验反思与总结
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实验原理
1.利用液体培养基可以扩大培养大肠 杆菌； 2.利用固体培养基对大肠杆菌进行划 线分离、培养，目的是获得单菌落； 3.利用附加抗生素的培养基筛选含有 重组DNA的受体细胞。
实验步骤及现象
⑤划完线在培养壁上写班级、性名、实验 名称，放在37°C培养箱中倒置培养，一天 后处理菌落数目。
3.配制LB固体培养基 ①1.28g固体培养基，40ml的水（一瓶加氨 苄青霉素，另一瓶不加） ②灭菌 ③倒平板
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：转基因 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 数量适中。
实验器材与药品
器材：高压灭菌锅，培养皿，恒温水浴锅， 恒温培养箱，摇床，酒精灯，涂布器，接 种环，移液枪，电子秤，锥形瓶；
药品：LB液体和固体培养基，去离子水， 70%酒精，氨苄青霉素，大肠杆菌，含有 重组DNA的大肠杆菌。
实验步骤及现象
1号 转基因 涂布
3号 混合 涂布
5号 普通 划线
2号 转基因 涂布